NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

VŨ XUÂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM
KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

VŨ XUÂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM
KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số:

60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI

Hà Nội - 2011

2


NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG
ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU
MỞ ĐẦU
Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế giới, kí
sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây trồng quan trọng
như bông, cải, cải dầu, các loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc. Hàng năm, rệp cùng với các
côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng cây trồng trên toàn thế giới. Do tính chất nguy hại
của rệp, việc sử dụng các biện pháp phòng trừ rệp là cần thiết.
Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng thuốc diệt côn
trùng hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng và hiệu quả tác dụng nhanh, nhưng
thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn trùng sau
một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Với
ưu điểm vượt trội về độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người, thuốc
diệt côn trùng sinh học được coi là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hướng phát triển
nền nông nghiệp bền vững.
Lecanicillium là chi nấm có khả năng kí sinh tự nhiên trên rệp và nhiều loài côn trùng
khác. Từ những năm 1960, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng
Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã được sản xuất và thương mại
hóa. Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử dụng thuốc diệt côn trùng sinh học
còn hạn chế.
Từ những lí do trên, việc tăng cường nghiên cứu phát triển các chế phẩm diệt rệp từ

nấm Lecanicillium là cần thiết. Do vậy, tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu sử dụng nấm
Lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau".
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Rệp hại cây trồng
Rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố tập trung
nhất ở các vùng ôn đới, rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt với
độ đa dạng thấp hơn. Khoảng 3700 loài rệp đã được biết đến trên thế giới, trong đó có 250
loài rệp là côn trùng phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát. Tuy
nhiên, đứng trên quan điểm động vật học, rệp là nhóm động vật thích nghi tốt với môi trường
nhờ khả năng sinh sản vô tính.
Rệp là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương,
hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải. Nhiều loài rệp có khả năng kí
sinh trên nhiều loại cây khác nhau như Aphis gossypii, Myzus persicae và Aphis craccivora.
Với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm
soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết. Biện pháp kiểm soát rệp và các loại côn trùng khác
được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp.

3


Thuốc diệt côn trùng hóa học
Thuốc diệt côn trùng (thuốc trừ sâu) chiếm tỉ lệ lớn trong thuốc bảo vệ thực vật.
Chúng có nguồn gốc tự nhiên hoặc được tổng hợp hoàn toàn trong các nhà máy hóa chất,
được sử dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, hoặc phi nông nghiệp để tiêu diệt các
vectơ truyền bệnh cho người và vật nuôi như ruồi, muỗi.
Ưu điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học là dễ sản xuất ở quy mô lớn với giá thành
rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy nhiên, chúng ngày
càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn
nước và không khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người.
Vì những nhược điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học, xu hướng chung trên thế giới

hiện nay là không sử dụng thuốc diệt côn trùng hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để
thay thế dần nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững.
Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học
Mặc dù có một số nhược điểm như giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực không mạnh
bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu quả bị ảnh hưởng nhiều bởi các điều
kiện ngoại cảnh, nhưng với các ưu điểm vượt trội so với hóa chất tổng hợp về độ thân thiện
với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người, các chế phẩm sinh học ngày càng được
nhận được nhiều sự quan tâm trong nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp.
Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp
Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae.
Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng như rệp,
ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm. Cơ chế diệt côn trùng của
Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám trên vỏ côn
trùng (chitin), các bào tử nảy mầm rồi tiết enzyme (chitinase, proteinase) phân hủy lớp biểu
bì, kết hợp với áp lực nảy mầm của bào tử nấm giúp sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong
cơ thể. Tại đây, sợi nấm tiết các enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân các mô, tiết
các độc tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng. Kết quả là côn trùng bị tổn thương, bị đa
nhiễm bởi Lecanicillium và các vi sinh vật gây bệnh khác. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp
tục phát triển và sinh bào tử bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn
trùng khác.
Mặc dù tiềm năng kiểm soát các côn trùng gây hại cây trồng của nấm Lecanicillium
rất lớn, nhưng việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để bảo vệ cây trồng cũng như kết quả
đạt được còn hạn chế, nhất là ở Việt Nam. Hiệu quả diệt côn trùng của chế phẩm
Lecanicillium cũng như các chế phẩm sinh học khác còn kém, khối lượng chế phẩm diệt côn
trùng sinh học được sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc
diệt côn trùng. Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm
Lecanicillium là cần thiết.
Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng
Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh côn trùng.
Việc lựa chọn phương pháp lên men và tối ưu các điều kiện lên men là cần thiết để sản xuất

được nhiều bào tử với hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay có hai phương pháp lên men phổ biến
nhất là lên men lỏng và lên men rắn.
Phương pháp lên men rắn mặc dù có một số nhược điểm là khó khăn trộn môi trường
lên men, môi trường lên men có độ đồng nhất không cao, khó tiếp giống và phải tiếp giống
theo từng đợt, việc kiểm soát pH khá phức tạp, độ ẩm cơ chất liên tục thay đổi trong quá trình

4


lên men, khả năng truyền nhiệt của cơ chất kém. Nhưng nó có nhiều ưu điểm quan trọng như
yêu cầu thiết bị và vận hành đơn giản, có thể tận dụng các nguồn cơ chất không tan trong
nước và sản phẩm phụ của nông nghiệp với chi phí thấp (tinh bột, cellulose, lignin, pectin), bề
mặt lên men rộng nên dễ trao đổi nhiệt và không khí, không đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt
các thông số trong quá trình lên men, tiêu thụ ít nước và năng lượng, ít nước thải, dễ dàng
kiểm soát sự tạp nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành rẻ.
Sự sinh bào tử của nấm chịu ảnh hưởng chủ yếu của các yếu tố như nguồn carbon,
nguồn nitơ, nguồn khoáng, độ ẩm, nhiệt độ, độ thoáng khí và một số yếu tố khác.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu, hóa chất và thiết bị
Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 do Phòng
Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH và CN Việt Nam cung cấp.
Rệp hại rau lấy trên rau cải ngoài đồng ruộng sau đó được nuôi trên cải thảo trong
phòng thí nghiệm.
Các hóa chất được sử dụng có độ tinh khiết cao, được cung cấp bởi các hãng có uy tín
như Invitrogen, Fermentas…
Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, được cung cấp
bởi các hãng có uy ín về thiết bị sinh học như Eppendorf, Pharmacia…
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp sàng lọc được sử dụng để lựa chọn chủng nấm có độc lực diệt rệp cải
cao.

Phương pháp sinh học phân tử, xác định và so sánh trình tự gen 28S rRNA để xác định
tên nấm.
Phương pháp tối ưu được sử dụng để lựa chọn môi trường phù hợp để lên men nấm
thu bào tử cao nhất.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao
Sau 7 ngày phun, chủng 485 có khả năng diệt rệp cải cao nhất với 67 ± 7% rệp bị diệt.
Chủng L18 hầu như không diệt được rệp, là chủng có độc lực yếu nhất.

5


80
70
Đối chứng
Tỉ lệ rệp chết (%)

60

L18

50

L43

40

L85
85k

30

485

20

8514

10

41185
L1185

0
0

1

2
3
4
5
Thời gian sau phun (ngày)

6

7

Độc lực diệt rệp của 7 chủng Lecanicillium spp.

Định tên chủng nấm 485
Chủng 485 được định tên bằng phương pháp đọc và so sánh trình tự gene 28S rRNA
với trình tự của các chủng đã được công bố trên GenBank.
Trình tự gene 28S rRNA của chủng 485 có độ tương đồng 99,8% với các chủng L.
lecanii trong GenBank. Từ kết quả trên bước đầu có thể kết luận chủng 485 thuộc loài
Lecanicillium lecanii.
EF026004 Lecanicillium fusisporum
HM057107 Verticillium sp.
AY312604 Verticillium sp.
EF026003 Lecanicillium lecanii
EF026005 Lecanicillium lecanii
Lecanicillium sp. 485

82,7
80

70

60

50

40

30

20

10

0

Cây phân loại Chủng 485 và các chủng từ GenBank

Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của L. lecanii 485
Ảnh hưởng của nguồn cơ chất
Trong tám môi trường đã khảo sát, môi trường bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) cho sự
sinh bào tử cao nhất với (5,02 ± 0,26)×109 bào tử/g cơ chất.

6


5

4

9

Số lượng bào tử (x10 /g cơ chất)

6

3

2

1

0
G

BG

CG

BN

LG

LN

MG

MN

Các nguồn cơ chất

Ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485
G: gạo, BG: bột gạo, CG: cám gạo, BN: bột ngô, LG: bột lõi ngô/bột gạo,
LN: bột lõi ngô/bột ngô, MG: bột bã mía/bột gạo, MN: bột bã mía/bột ngô.

Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất
Môi trường gồm bột lõi ngô/bột ngô sau khi được lựa chọn, ảnh hưởng của tỉ lệ hai
thành phần này lên sự sinh bào tử của chủng nấm L. lecanii 485 đã được khảo sát. Tỉ lệ bột lõi
ngô/bột ngô bằng 1:1 (w/w) cho sự sinh bào tử cao nhất với (5,37 ± 0,95)×109 bào tử/g cơ
chất.

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

7

6
5
4
3
2
1
0
8:2

7:3

6:4

5:5

4:6

3:7

Tỉ lệ lõi ngô/bột ngô

Ảnh hưởng của tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô trong môi trường
lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

7

2:8


Ảnh hưởng của độ dày cơ chất

Độ dày cơ chất 27,5 mm thích hợp nhất cho sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485
với số lượng bào tử đạt được (1,032 ± 0,032)×1010 bào tử/g cơ chất.

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

12

9

6

3
8

12

16

20

24

28

32

Độ dày cơ chất (mm)

Ảnh hưởng của độ dày cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất
Khi lượng nước được bổ sung bằng 70% cơ chất (tương đương với độ ẩm môi trường
cơ chất 41%), chủng L. lecanii 485 sinh bào tử cao nhất, đạt được (5,43 ± 1,08)×109 bào tử/g
cơ chất.

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

7

6

5

4

3

2

1
30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Lượng nước bổ sung so với cơ chất khô (%)

Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 tốt nhất ở 30°C, đạt được (7,88 ± 0,64)×109
bào tử/g cơ chất.

8


9

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

8
7
6
5
4

3
2
1
0
20

25

30

35

40

Nhiệt độ (oC)

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ
Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 cao nhất với nguồn (NH4)2SO4, số lượng bào
tử đạt được (1,159 ± 0,050)×1010

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

14
12
10
8
6
4

2
0

KBS

NaNO3
NaNO3

KNO3
KNO3

NH 4NO3
NH4NO3

(NH4)2SO4
(NH4)2SO4

(NH 4)2HPO4
(NH4)2HPO4

Một số nguồn nitơ vô cơ

Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485
KBS: không bổ sung nguồn nitơ vô cơ

Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4
Sau khi được xác định là nguồn nitơ vô cơ phù hợp, ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các
nồng độ khác nhau lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 đã được khảo sát. Kết quả
nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000g cơ chất cho sự sinh bào tử cao nhất với
(1,071 ± 0,028)×1010 bào tử/g cơ chất.

9


Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

12

10

8

6

4

2

0
0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

Nồng độ (NH4)2SO4 (mol N/1000 g cơ chất)

Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4
Ảnh hưởng của MgSO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 ở các nồng độ
khác nhau đã được khảo sát. Kết quả cho thấy nồng độ MgSO4 tối ưu là 0,035% với số lượng
bào tử đạt được (1,304 ± 0,018)×1010 bào tử/g cơ chất.

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

14

13

12

11

10

9

8
0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Nồng độ MgSO4 (%)

Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4
Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 cao nhất khi bổ sung KH2PO4 ở nồng độ 0,1%
và 0,25%, với số lượng bào tử đạt được lần lượt là (1,156 ± 0,043)×1010 và (1,159 ±
0,008)×1010 bào tử/g cơ chất. Tuy nhiên, với các nồng độ KH2PO4 đã được khảo sát, sự khác
biệt về sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 trong môi trường được bổ sung và không được
bổ sung KH2PO4 không có ý nghĩa thống kê.

10


Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

13

12

11

10

9
0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Nồng độ KH2PO4 (%)

Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng
Trong ba chế độ chiếu sáng đã được khảo sát, chủng L. lecanii 485 sinh bào tử cao
nhất ở chế độ chiếu đáng thông thường (12 giờ/ngày) với số lượng bào tử đạt được lần lượt là
(1,326 ± 0,050)×1010.

Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

14

12

10

8
0

12

24

Thời gian chiếu sáng (giờ/ngày)

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Ảnh hưởng của thời gian lên men
Sau 8 ngày lên men, số lượng bào tử của nấm L. lecanii 485 đạt được tối đa với (1,353
± 0,019)×1010 bào tử/g cơ chất.

11


Số lượng bào tử (x109/g cơ chất)

15

14

13

12

11

10

9
4

6

8

10

12

14

Thời gian lên men (ngày)

Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Như vậy, sau khi lên men chủng nấm L. lecanii 485 với các điều kiện tối ưu, cụ thể: 8
ngày lên men ở 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1,

w/w) có độ dày 27,5 mm (tương đương 22g cơ chất/bình lên men 250 ml), được bổ sung
lượng nước bổ sung bằng 70% cơ chất (tương đương độ ẩm môi trường cơ chất là 41%), nồng
độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4
bằng 0,1% cơ chất, đã đạt được số lượng (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g cơ chất.
KẾT LUẬN
1. Chủng 485 có độc lực cao nhất đối với rệp cải trong số 7 chủng nấm được nghiên
cứu. Trong điều kiện 21-25°C và độ ẩm không khí 75-80%, dung dịch bào tử của chủng 485
có mật độ 3×108/ml trong Tween 80 nồng độ 0,05% sau 7 ngày được phun lên rệp cải đã diệt
được 67% rệp.
2. Chủng 485 thuộc loài Lecanicillium lecanii theo phân tích và so sánh trình tự gene
28S rRNA.
3. Điều kiện cho sự sinh bào tử tối đa của chủng L. lecanii 485 trong môi trường rắn
là: lên men 8 ngày ở 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với cơ chất bột lõi ngô/bột ngô
(1:1, w/w) có độ dày 27,5 mm, độ ẩm môi trường cơ chất 41%, nồng độ (NH4)2SO4 tương
đương 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất.
Chủng L. lecanii 485 khi lên men trong điều kiện tối ưu, đạt được số lượng bào tử
(1,353 ± 0,019)×1010/g cơ chất.

12