MỘT số đặc TÍNH của các CHỦNG acinetobacter baumannii gây NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM 1 KHÁNG CARBAPENEM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM DUY THÁI

MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii
GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN
NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM

BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM DUY THÁI

MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii
GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN
NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN HUY HOÀNG
PGS. TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội – 2015


MỞ ĐẦU
Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) hiện nay đang là một thách thức lớn đối với
các bệnh viện trong việc điều trị bởi tỷ lệ nhiễm khuẩn ngày càng cao. NKBV là một
trong những nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến tính mạng người bệnh, là nguyên nhân
chính gây ra tỷ lệ mắc, tử vong cao cho các bệnh nhân tại các bệnh viện trên thế giới
[76]. NKBV thường gây nên bởi các vi khuẩn kháng đa kháng sinh, gây rất nhiều khó
khăn cho công tác điều trị, kéo dài thời gian mắc bệnh, tăng biến chứng, tăng sự kháng
thuốc của vi sinh vật qua đó tăng mức sử dụng kháng sinh, tăng chi phí dùng thuốc và
là gánh nặng bệnh tật cho cả người bệnh và hệ thống y tế.
Hiện nay Acinetobacter baumannii (A. baumannii) là một trong những tác nhân
gây bệnh quan trọng hàng đầu tác động đến các cơ sở điều trị trên thế giới. Tuy nhiên
sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng lại các kháng
sinh thuộc nhóm β-lactam, bao gồm cả các kháng sinh nhóm carbapenem thuộc “nhóm
lựa chọn cuối cùng”. Đặc biệt là sự xuất hiện của các chủng Acinetobacter mang gen
New Delhi Metallo-beta-lactamase-1 (NDM-1) kháng carbapenem được ghi nhận ở
một số quốc gia như Đức và Vương quốc Anh. Trong nghiên cứu gần đây của chúng
tôi tại một số bệnh viện ở Hà Nội, A. baumannii chiếm 53,33% (320/600) trong tổng
số chủng vi khuẩn gram âm gây NKBV và hơn 95% số chủng kháng lại cephalosporin
thế hệ 3, với ít nhất 1 kháng sinh nhóm carbapenem. Câu hỏi nghiên cứu được đặt ra là
liệu các chủng A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại các bệnh viện có mang
gen NDM-1 hay không? Chính sự cấp thiết và ý nghĩa thực tiễn nêu trên, chúng tôi
tiến hành đề tài nghiên cứu: “Một số đặc tính của các chủng Acinetobacter baumannii
gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem” với mục tiêu:
Mục tiêu cụ thể:

1. Mô tả thực trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng carbapenem
phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn.
2. Phát hiện tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 phân lập được trong
nghiên cứu.
3. Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn A. baumannii mang gen
NDM-1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Nhiễm khuẩn bệnh viện
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nhiễm khuẩn bệnh viện (hospital-acquired

infection hay nosocomial infection) là “những nhiễm khuẩn người bệnh mắc phải trong
thời gian điều trị tại bệnh viện mà thời điểm nhập viện không thấy có yếu tố nhiễm
khuẩn hay ủ bệnh nào. Nhiễm khuẩn bệnh viện thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi
người bệnh nhập viện”.
Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức
khoẻ toàn cầu. Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm khuẩn bệnh viện từ
năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho các quốc
gia có thu nhập cao nằm trong khoảng từ 5% đến 12%. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện ở
các quốc gia có thu nhập trung bình và thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% và tỷ lệ tính
chung là khoảng 10,1/100 bệnh nhân.
1.2.

Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
Kháng sinh được phát hiện ở thế kỷ 20 và lập tức đóng vai trò quan trọng trong

việc khống chế các bệnh nhiễm trùng. Cho đến nay nhiều thế hệ kháng sinh khác nhau

đã được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị. Tuy
nhiên hiện nay do sự gia tăng tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện và
cộng đồng là một vấn đề quan trọng hàng đầu trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm
ra các giải pháp phòng chống một cách hiệu quả.
1.2.1.

Lịch sử phát triển kháng sinh
Năm 1929 Alexander Fleming là người đầu tiên nghiên cứu và phát minh ra

loại thuốc kháng sinh đầu tiên có tên là Penicillin. Tuy nhiên phải đến năm 1939, Ernst
Chain và Howard Florey mới tách chiết thành công hoạt chất penicillin và được sử
dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chiến tranh thế giới lần thứ II. Năm 1946,
penicillin bắt đầu được sử dụng trong lâm sàng và có đóng góp to lớn cho y học.
Bác sỹ người Đức Gerhard Domagk đã công bố phát minh tổng hợp được hoạt
chất kháng sinh mới prontosil. Đây là thế hệ đầu tiên của các kháng sinh thuộc dòng
sulfonamides được sử dụng trong lâm sàng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiết
niệu hô hấp và một số bệnh nhiễm trùng khác.


Thập kỷ 50 đến 70 của thế kỷ 20 được coi là thời kỳ hoàng kim của kháng sinh,
nhiều loại kháng sinh mới đã được giới thiệu bao gồm: streptomycin, chloramphenicol
và tetracycline được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn.
1.2.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
1.2.2.1.
Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng kháng
sinh. Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi khuẩn
có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng kháng sinh của vi
khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh được đưa vào sử dụng.

Phân loại đề kháng

1.2.2.2.

Đề kháng được chia làm hai loại đề kháng giả và đề kháng thật.
Đề kháng giả: là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất không phải
do di truyền.
Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được
+ Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi khuẩn
+ Đề kháng thu được: Có rất nhiều cơ chế đã được vi khuẩn phát triển để
kháng lại kháng sinh.
1.2.3.

Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn
Vi khuẩn có rất nhiều cơ chết kháng khang sính
-

1.2.4.

1.3.

Thay đổi đích tác động
Tạo ra các enzyme
Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất

Các yếu tố nguy cơ gây kháng kháng sinh
- Lạm dụng sử dụng kháng sinh trong cộng đồng
- Sử dụng kháng sinh trong bệnh viện
- Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
- Chất lượng kháng sinh kém

- Gia tăng sự đi lại quốc tế
Kháng sinh nhóm carbapenem
Carbapenem là nhóm kháng sinh được coi là “lựa chọn cuối cùng” dùng để điều

trị NKBV. Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn
kháng kháng sinh phổ rộng sinh enzym beta-lactamase (ESBL) bằng cách ức chế quá
trình tổng hợp vỏ ngoài của tế bào vi khuẩn.
1.4.

Thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm hiện nay


Thực trạng đa kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm hiện nay là một
trong những vấn đề mang tính toàn cầu, đặc biệt ở tại các quốc gia đang phát triển với
gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn. Bằng chứng mới nhất là sự lây lan của các
chủng vi khuẩn Gram âm như Klebsiella, Pseudomonas, E. coli, A. baumannii...
mang gen New Delhi Metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) kháng carbapenem “thuộc
nhóm lựa chọn cuối cùng” ở một số quốc gia.
Hậu quả của vi khuẩn kháng đa kháng sinh để lại rất nặng nề, nó tác động đến
nhiều lĩnh vực khác nhau như sức khỏe con người, kinh tế, dịch tễ học, ngành công
nghiệp dược phẩm và các biện pháp phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh.
1.5.
Đặc điểm vi sinh vật học và tình trạng kháng kháng sinh của A. baumannii
1.5.1. Đặc điểm vi sinh vật học của A. baumannii
1.5.1.1.
Đặc điểm chung

A. baumannii là một trong các chủng Acinetobacter spp. có cấu trúc của một
cầu trực khuẩn Gram âm, có nguồn gốc từ trong thiên nhiên như trong đất, nước,
thực phẩm. Ngày nay, người ta đã phát hiện chúng như là một tác nhân thường trú

trong bệnh viện và có khả năng phát tán và lây lan thành các vụ dịch.
A. baumannii là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối và dễ mọc trên các môi trường
thông thường ở nhiệt độ 20 - 30oC, nhiệt độ tối ưu là 35oC.
1.5.1.2.

Đặc điểm sinh học của A. baumannii
A. baumannii có tính chất sinh học thay đổi tùy theo điều kiện và môi trường

sống, chính tính chất này giúp vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong môi trường, dụng cụ
dùng chăm sóc và điều trị bệnh nhân của bệnh viện, đặc biệt là khả năng kháng với
hầu hết các loại kháng sinh thông thường và cả với kháng sinh điều trị đặc hiệu cho vi
khuẩn này như là kháng sinh nhóm carbapenem.
1.5.2.

Cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii
A. baumannii có khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, trong đó

nó có thể đề kháng với chính kháng sinh dùng để điều trị đặc hiệu cho vi khuẩn này.
Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này cũng khác nhau theo loài, địa phương A.
baumannii với đặc tính là loài có khả năng tích lũy nhiều gen kháng kháng sinh dẫn
đến sự phát triển của các chủng đa kháng. Có bốn cơ chế thường gặp gây hiện tượng
đa kháng thuốc ở A. baumannii được nói đến nhiều nhất là: (i) Thay đổi vị trí đích tác
động (thay đổi đích PBP) (ii) Đột biến mất kênh porin không cho kháng sinh qua


màng vào bên trong vi khuẩn, (iii) Bất hoạt kháng sinh qua các bơm đẩy kháng sinh ra
ngoài và (iv) tiết enzyme để phá hủy kháng sinh.
1.5.3.

Tình hình A. baumannii kháng carbapenem trên Thế giới

Hiện nay, vi khuẩn A. baumannii được biết đến như là một tác nhân quan trọng

hàng đầu gây nhiễm khuẩn trong bệnh viện ở trên toàn thế giới. Đặc biệt trong 15 năm
trở lại đây có nhiều phát hiện quan trọng về khả năng thích ứng của loại vi khuẩn này
nhằm kháng lại các kháng sinh đã được báo cáo, điều này cho thấy loại vi khuẩn này
đang đe dọa đến thời đại kháng sinh hiện nay của chúng ta. Hiện nay một số chủng A.
baumannii kháng lại tất cả các kháng sinh hiện có cũng đã được báo cáo, do vậy cần
phải giám sát chặt chẽ thậm chí phải đưa ra ngay các hành động cụ thể nhằm ngăn
chặn sự lây lan của vi khuẩn này trên hệ thống y tế toàn thế giới.
1.5.4.

Tình hình A. baumannii kháng carbapenem tại Việt Nam
Ở trong bệnh viện các vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh ở mức độ

cao. Theo tổng kết về thực trạng kháng kháng sinh của hiệp hội kháng kháng sinh toán
cầu (GARP) tại Việt Nam từ các nghiên cứu khác nhau tại các bệnh viện ở thành phố
Hồ Chí Minh cho thấy từ năm 2000-2001 có 25% các vi khuẩn Gram âm phân lập
được kháng lại cephalosporin, tuy nhiên cho đến năm 2009 thì 42% số chủng vi khuẩn
Gram âm kháng lại cefftazidime, gentamicin 63% và nalidixic acid 74% [1].
Nghiên cứu gần đây nhất do nhóm nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trong 2
năm từ 2010-2011 nhằm phát hiện tỷ lệ kháng carbapenem của các vi khuẩn Gram âm
gây nhiễm khuẩn tại 3 bệnh viện của Hà Nội. Kết quả ban đầu cho thấy A. baumannii
chiếm một tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất 53,33% (320/600) trong tổng số chủng vi khuẩn
Gram âm thu thập được và hơn 95% đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và với ít nhất
1 kháng sinh thuộc nhóm carbapenem. Đặc biệt chúng tôi phát hiện được 5% (16/320)
số chủng A. baumannii mang gen NDM-1 tại cả 3 bệnh viện.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu


Các chủng A. baumannii phân lập được từ 3 bệnh viện ở Hà Nội bao gồm: bệnh
viện Việt Đức, bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Xanh Pôn giai đoạn 2010-2014.
2.2.

Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tư tiêu hao
- Trang thiết bị, sinh phẩm và dụng cụ tiêu hao đầy đủ và đạt tiêu chuẩn sử dụng

trong nghiên cứu.
2.3. Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu hồi cứu – mô tả cắt ngang
2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu được tiến hành từ: năm 2014 đến 2015
Địa điểm nghiên cứu: Tại phòng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
2.5.

Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu nghiên cứu: Cỡ mẫu toàn bộ bao gồm 582 chủng A. baumannii thu thập

được từ 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn từ năm 2010 đến năm 2014.
Các chủng A. baumannii được phân lập từ các bệnh phẩm nhiễm khuẩn như: máu,
đờm khí quản, nước tiểu, dịch vết mổ …
2.6. Các phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh
2.6.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch

Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường
kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Đường kính các vòng vô

khuẩn thu được sẽ được ghi lại và tính toán dựa theo tiêu chuẩn CLSI, năm 2010. Các
loại khoanh giấy kháng sinh sử dụng bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM),
ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM),
amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922
được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm.
2.6.1.2.

Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC)
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Muellerhinton có nồng độ kháng sinh khác nhau theo tiêu chuẩn của CLSI và được ủ ở 37 oC
qua đêm (khoảng 18 giờ). Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn
được xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤ 3. Các kháng sinh được thử nghiệm bao gồm
imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX),
ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn
quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song với các chủng vi
khuẩn thử nghiệm.


2.6.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử
2.6.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn mang gen NDM-1

Trình tự mồi để phát hiện gen NDM-1 của vi khuẩn
TT Tên

Trình tự mồi

Kích
thước
(bp)

Ndm1-F

5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’

Ndm1-R

5’-ttcgacccagccattggcggcga-3’

499

Vi khuẩn sau khi được xác định là chủng thuần sẽ được nuôi cấy trên môi
trường thạch dinh dưỡng và được tách triết DNA để làm khuân mẫu cho phản ứng
PCR. Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch điện di agarose nồng độ 1,5% trong
đệm TAE 1X trong 30 phút. Sau khi điện di xong gel được nhuộm trong dung dịch
ethidium bromine nồng độ 10mg/ml trong 10 phút, rửa trong nước cất 15 phút.
Gel được mang đi quan sát và chụp lại bằng máy chụp ảnh gel.
2.6.2.2.

Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử bằng kỹ thuật multilocus sequence typing
(MLST)
Kỹ thuật MLST sử dụng PCR để khuếch đại 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB,
gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sau đó tiến hành giải trình tự và phân tích kết quả
trên

cơ

sở

dữ

liệu

về

MLST

của

Acinetobacter

baumannii

/>Bảng 2.2. Các trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật MLST đối với chủng A.
baumannii
Kích
TT

Tên

Trình tự mồi

thước
(bp)

gltA -F
1
gltA -R
2

gyrB -F

Tài liệu
tham khảo

AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG
TCC C
GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA

772

CAC G
TGA AGG CGG CTT ATC TGA GT

A. baumannii
MLST
website

594


3

4

5

6

7

2.6.2.3.

gyrB -R

GCT GGG TCT TTT TCC TGA CA

gdhB -F

GCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC C

gdhB -R

GTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG C

recA -F

CCT GAA TCT TCY GGT AAA AC

recA -R

GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC

cpn60-F

GGT GCT CAA CTT GTT CGT GA

cpn60-R

CAC CGA AAC CAG GAG CTT TA

gpi-F

GAA ATT TCC GGA GCT CAC AA

gpi-R

TCA GGA GCA ATA CCC CAC TC

rpoD -F

ACC CGT GAA GGT GAA ATC AG

rpoD -R

TTC AGC TGG AGC TTT AGC AAT

774

425

640

456

672

Phân tích mối liên hệ kiểu gen các chủng A. baumannii bằng kỹ thuật PFGE [39]
-

Tách DNA vi khuẩn trong đệm thạch:
Rửa plug sau khi ly giải:

Cắt DNA vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn:
Cắt chromosomal DNA của vi khuẩn đã tách chiết trong thạch bằng Enzym giới
hạn XbaI (đối với chủng chuẩn Braenderup H9812 ) và ApaI (cho A.
baumannii) nồng độ 30UI/ miếng thạch ở 370C trong vòng 12-16 giờ.
Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad
laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1%, ở hiệu điện thế
6V/cm trong 19 giờ ở nhiệt độ 14 0C, thời gian một xung từ 25 đến 60s và góc

2.6.2.4.

điện trường là 120 độ.
Phát hiện plasmid mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật Southern-Blotting [39]
-

Tạo mẫu dò cho gen NDM-1:
Tách chiết DNA vi khuẩn trong đệm thạch (giống với phương pháp PFGE ở
phần 2.6.2.3)

-

Thực hiện kỹ thuật S1-PFGE: Cắt loại bỏ DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn
bằng enzym S1 nồng độ 20UI/200µl dung dịch đệm enzym S1, Ủ 37 0C trong 1
giờ. Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (BioRad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1%

để tách


plasmid. Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và chụp ảnh để xác định
-

số lượng và kích thước plasmid của các chủng vi khuẩn.
Chuyển DNA plasmid sang màng lai Hybond-N, Amersham: Rửa gel bằng
dung dịch HCL 0,25M lạnh trong 7 phút, dung dịch biến tính (NaCl 1,5M;
NaOH 0,5M) lạnh trong 20 phút và dung dịch trung hòa (Tris-HCl 0,5M; NaCl
1,5M; pH 7.5) lạnh trong 20 phút. Chuyển các plasmid sang màng lai HybondN của hãng Amersham bằng dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 300
mM Natri Citrate, pH 7.0) bằng hệ thống chuyển màng Biometra-analytic (của

-

hãng Jena, Cộng hòa Pháp).
Thực hiện phản ứng lai: Màng lai đặt ủ trong dung dịch tiền lai (gold
hydridization buffer của hãng ECLTM Amersham) ở 42oC trong 1 giờ. Loại bỏ
dung dịch tiền lai đưa vào dung dịch lai đã được bổ sung 30 µl mẫu dò NDM-1.
Lai qua đêm ở 42oC (khoảng 16 giờ) bằng lò lai UPV HL-2000 HybriLinker
(Đức). Dừng phản ứng lại và rửa màng lai bằng dung dịch SSC 0,5X chứa 0,4%

-

SDS và dung dịch SSC 2X ở 55oC.
Hiện màng (sử dụng bộ Kit ECl, Hãng ECL TM Amersham): Hiện màng trên
hyper film bằng hỗn hợp detection 1 và detection 2 ECLTM Amersham.

2.7.

Phân tích kết quả: Sử dụng ảnh chụp gen các plasmid trước khi và ảnh plasmid

sau khi lai để phát hiện số lượng và kích thước các plasmid mang gen.
Quản lý và phân tích số liệu
- Số liệu thu thập được từ phiếu điều tra và bệnh án sẽ được nhập 2 lần độc lập
vào máy tính và kiểm tra đối chiếu để tránh sai sót trong quá trình nhập số liệu.

Số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm excel. Kết quả được trình
-

bày dưới dạng bảng, đồ thị, biểu đồ
Phần mềm Bioedit và website của đơn vị nghiên cứu Oxford

-

được sử dụng để đọc và phân tích kết quả MLST.
Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng A. baumannii kháng carbapenem
mang gen NDM-1 bằng phần mềm Bionumeric- 6.5 để tạo cây phả hệ.


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Mô tả thực trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng
carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn
Trong 5 năm, từ năm 2010 đến năm 2014 nghiên cứu đã thu thập được 582
chủng A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh viện ở Hà Nội (Hình 3.1).

Hình 3.1. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh
viện theo năm (n=582)
Trong 582 chủng A. baumannii phân lập được tại 3 bệnh viện, có 428 chủng
được phát hiện ở nam giới chiếm khoảng 74% và 154 chủng phát hiện ở nữ giới chiếm
khoảng 26% tổng số trường hợp (tỷ suất chênh Nam/nữ=2,78) (Hình 3.2).

Hình 3.2. Tỷ lệ phân bố của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem
3 bệnh viện theo giới (n=582)

Tỷ lệ về giới được thể hiện rõ hơn đối với từng bệnh viện trong biểu đồ tỷ lệ
phân bố theo giới phát hiện các chủng A. baumannii kháng carbapenem (Hình 3.3).

Hình 3.3. Phân bố theo giới của các chủng A. baumannii kháng carbapenem trong
từng bệnh viện (n=582)
Tỷ lệ bệnh nhân nam nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn A. baumannii kháng
carbapenem cao hơn nhiều so với bệnh nhân nữ ở từng bệnh viện (Hình 3.3).
3.2.

Phát hiện tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân
lập được trong nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu
cho

gen

NDM-1

(Ndm1-F:

5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’;

Ndm1-R:

5’-

ttcgacccagccattggcggcga-3’) để phát hiện các chủng A. baumannii kháng carbapenem
mang gen NDM-1 [79].

Hình 3.4. Hình ảnh đại diện cho các chủng vi khuẩn A. baumannii mang gen
NDM-1 trong nghiên cứu. P: positive; N: negative; M: thang chuẩn 100bp


Kết quả cho thấy 23/582 chủng A. baumannii, được phát hiện dương tính với
gen NDM-1 chiếm khoảng 3,95% tổng số chủng thu thập được.

Hình 3.5. Tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem
trong nghiên cứu (n=582)
3.2.1.

Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 phân lập tại 3 bệnh viện
Trong 23 chủng A. baumannii mang gen NDM-1, có 7 chủng được phân lập từ
bệnh viện Việt Đức, 5 chủng phân lập được ở bệnh viện Thanh Nhàn và 11 chủng
phân lập tại bệnh viện Xanh Pôn.

Hình 3.6. Tỷ lệ phân bố A. baumannii mang gen NDM-1 ở 3 bệnh viện (n=23)
3.2.2. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 theo khoa


Sự phân bố theo khoa của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 được thể
hiện trong biểu đồ ở Hình 3.7.

Hình 3.7. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 theo khoa ở 3
bệnh viện (n=23)
Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 ở Khoa Nhi bệnh viện
Xanh Pôn là cao nhất trong các khoa ở cả 3 bệnh viện, liệu rằng có xuất hiện nhiễm
khuẩn chéo xảy ra ở bệnh viện Xanh pôn do công tác phòng chống nhiễm khuẩn chưa
hiệu quả.
3.2.3.

Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 theo nhóm tuổi và theo
giới
Trong 23 trường hợp phát hiện nhiễm khuẩn mang gen NDM-1 có độ tuổi từ 1
đến 77 tuổi. Trong đó nhóm tuổi < 10 tuổi chiếm tỷ lệ 36%, cao hơn so với các nhóm
tuổi khác và chỉ tập trung ở Khoa Nhi bệnh viện Xanh Pôn (Hình 3.8)


Hình 3.8. Tỷ lệ phân lập các chủng A. baumannii mang gen NDM-1
theo độ tuổi (n=23)
Theo số liệu thống kê được, số lượng chủng A. baumannii phân lập được tại
bệnh viện Xanh Pôn là ít nhất trong 3 bệnh viện. Tuy nhiên, số trường hợp phát hiện
chủng mang gen NDM-1 lại cao hơn so với 2 bệnh viện còn lại và chủ yếu được phát
hiện ở Khoa Nhi. Liệu rằng điều này có liên quan đến nhiễm khuẩn chéo trong khoa
hoặc do công tác phòng chống nhiễm khuẩn của bệnh viện tuy đã thực hiện nhưng
chưa đạt được hiệu quả như mong đợi do bệnh nhân điều trị quá đông dẫn đến tình
trạng quá tải trong bệnh viện. Điều này sẽ được chứng minh bằng các kỹ thuật sinh
học phân tử thực hiện ở dưới đây.
3.2.4. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 theo giới

Trong 23 ca phân lập được vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 có 3
trường hợp là nữ giới (13%) và 20 trường hợp là nam giới (87%). Tỷ xuất về giới tính
Nam/Nữ là 6.67/1 (Hình 3.9)

Hình 3.9. Tỷ lệ các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 theo giới (n=23)
3.2.5. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1


Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) của
các chủng A. baumannii dương tính với NDM-1 cho thấy: tất cả các chủng này đều

kháng lại kháng sinh Cefotaxime (>64mg/L), Ceftazidime (>32mg/L). Hầu như các
chủng này đều kháng với kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (nhóm kháng sinh được
cho là lựa chọn cuối cùng để điều trị nhiễm khuẩn) bao gồm: Imipenem, Meropenem.
Chỉ có 1 chủng kháng imipenem và meropenem ở mức độ trung gian (<2 mg/L). Tuy
nhiên, trong thử nghiệm này có tới 11 chủng A. baumannii nhạy cảm với
Ciprofloxacin (0.0625-0.5 mg/L). Chỉ có duy nhất Colistin là còn nhạy cảm hoàn toàn
đối với các chủng A. baumannii trong nghiên cứu (Bảng 3.1)
Bảng 3.1. Nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) của A. baumannii
mang gen NDM-1 phân lập trong nghiên cứu (n=23)
Kháng sinh

Nhạy cảm (mg/L)

Imipenem
Meropenem
Cefotaxime
Ceftazidime
Ciprofloxacin
Colistin

0
0
0
0
11 (0.0625–0.5)
23 (0.25-2)

Kháng trung gian
(mg/L)
1 (<2)

1 (<2)
0
0
0
0

Kháng hoàn toàn
(mg/L)
22 (8-256)
22 (8-128)
23 (>64)
23 (>32)
12 (>4)
0

Trong nghiên cứu này, phần lớn các chủng A. baumannii đã kháng lại với nhóm
cephalosporin và carbapenem. Tuy nhiên, trong các chủng này vẫn có khá nhiều chủng
nhạy cảm với ciprofloxacin (11 chủng). Điều này có thể lý giải là do ở Việt Nam, các
kháng sinh thuộc nhóm carbapenem được đưa vào sử dụng sớm (từ đầu những năm
2000). Việc đưa carbapenem vào trong điều trị bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện sớm
với liều cao đã gây áp lực cho các chủng vi khuẩn dẫn đến tình trạng kháng lại nhóm
kháng sinh này.
3.3.

Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn A. baumannii mang gen

NDM-1
3.3.1. Kiểu gen PFGE của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang
gen NDM-1

DNA của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 được xử lý bằng enzyme
ApaI sau đó chạy điện di xung trường trong 19 giờ. Kết quả được đọc bằng máy
Biodoc và được phân tích bằng phần mềm BioNumerics.

Hình 3.10. Hình ảnh đại diện cho kiểu gen PFGE của một số chủng A. baumannii
mang gen NDM-1 kháng carbapenem trong nghiên cứu

Hình 3.11. Cây phân loại kiểu gen PFGE của các chủng A. baumannii mang gen
NDM-1 kháng carbapenem
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi phân tích 23 chủng A. baumannii mang gen
NDM-1 bằng kỹ thuật PFGE, có thể chia ra thành 4 nhóm chính (Hình 3.11). Nhóm I,
Nhóm II, Nhóm III và Nhóm IV với mức độ tương đồng của Nhóm I, II, III khoảng


90% và độ tương đồng của nhóm IV là 100%. Nhóm I bao gồm 3 chủng (1105TN,
1398TN, 1146TN) được phân lập từ bệnh viện Thanh Nhàn năm 2013 .Nhóm II gồm 2
chủng 303VD và 320TN được phân lập ở bệnh viện Việt Đức và bệnh viện Thanh
Nhàn năm 2011. Nhóm III gồm 8 chủng (351XP, 357XP, 393XP, 650XP, 327XP,
275XP, 282XP, 271XP) phân lập được tại bệnh viện Xanh Pôn từ năm 2011 và 2012.
Nhóm IV gồm 2 chủng 1267VD và 1413VD phân lập được tại bệnh viện Việt Đức
năm 2013. Ở nhóm III, 2 cặp chủng (351XP, 357XP) và (275XP, 282XP) có kiểu gen
PFGE giống nhau hoàn toàn. Qua phiếu điều tra bệnh án, chúng tôi phát hiện các
chủng này đều được phân lập từ Khoa Nhi, bệnh viện Xanh Pôn. Bên cạnh đó, Nhóm
IV gồm 2 chủng 1267VD ở khoa Hồi Sức và 1413VD khoa Phẫu thuật nhiễm khuẩn
bệnh viện Việt Đức cũng có sự tương đồng về kiều gen PFGE là 100%.
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, các chủng A. baumannii mang gen
NDM-1 kháng carbapenem không thuộc cùng một kiểu gen duy nhất (single clone) mà
có sự đa dạng về kiểu gen [70]. Trong nghiên cứu này cũng vậy kết quả PFGE cho
thấy kiểu gen của các chủng A. baumannii phân lập được chia ra làm các nhóm khác

nhau và có sự tương đồng với tỷ lệ nhất định. Ngoài ra có một số chủng A. baumannii
có kiểu gen khác hoàn toàn so với những chủng còn lại. Điều đó chứng tỏ sự đa dạng
về mặt kiểu gen của những chủng A. baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem
phân lập tại 3 bệnh viện. Quan trọng nhất là nghiên cứu đã phát hiện được 4 nhóm vi
khuẩn có độ tương đồng trên 90% trong đó có 3 cặp vi khuẩn phân lập được có kiểu
gen tương đồng nhau 100% (2 cặp ở Xanh Pôn và 1 cặp ở Việt Đức) cho thấy có mối
liên hệ về chủng A. baumannii giữa các bệnh nhân trong cùng một khoa (Khoa Nhi –
Xanh Pôn) và giữa các khoa khác nhau trong cùng bệnh viện (Khoa Hồi sức và Khoa
Phẫu thuật nhiễm khuẩn – Việt Đức). Điều này chứng tỏ đã có sự lây lan các chủng A.
baumannii mang gen NDM-1 giữa các khoa trong bệnh viện (Xanh Pôn, Việt Đức) và
có sự liên hệ giữa các chủng A. baumannii ở 2 bệnh viện Việt Đức và Thanh Nhàn
(Nhóm II). Hiện nay kỹ thuật PFGE được sử dụng nhiều để nghiên cứu và đánh giá sự
lây truyền giữa các vi khuẩn gây bệnh trọng bệnh viện cũng như trong cộng đồng.
3.3.2. Phát hiện plasmid mang gen NDM-1

Kết quả Southern blotting cho thấy chỉ có một chủng phân lập có chứa một
plasmid mang gen NDM-1. Kích thước plasmid này khoảng 50kb và thuộc về type NrepA (Hình 3.12). Hầu hết các chủng A. baumannii dương tính với NDM-1 đều có


gen NDM-1 nằm trên nhiễm sắc thể khi chúng tôi tiến hành thí nghiệm Southern
blotting với enzyme IceuI (loại enzym cắt dùng cho nhiễm sắc thể dùng trong thí
nghiệm Southern blotting).

Hình 3.12. Kết quả đại diện phát hiện plasmid mang gen NDM-1 trên một số
chủng vi khuẩn A. baumannii phân lập tại 3 bệnh viện
Trong nghiên cứu này, chỉ phát hiện một chủng A. baumannii phân lập tại bệnh
viện Thanh Nhàn có một plasmid với kích thước khoảng 50kb tương đồng với một số
plasmid của các chủng vi khuẩn đường ruột mang gen NDM-1 phân lập tại bệnh viện
Việt Đức [3].Trong khi đó ở nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột gây nhiễm khuẩn
bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem cũng tại ba bệnh viện Việt Đức,

Thanh Nhàn, Xanh Pôn của tác giả Trần Huy Hoàng và cộng sự, đa số các chủng
dương tính với NDM-1 đều có một hoặc nhiều Plasmid mang gen NDM-1 [3]. Có thể
lý giải cho sự khác nhau này như sau, chủng A. baumannii có sự khác biệt với các
chủng vi khuẩn đường ruột Gram âm ở hệ thống porin (kênh protein màng). Hệ thống
porin của A. baumannii ít và nhỏ hơn so với các vi khuẩn đường ruột Gram âm vì vậy
nó cũng hạn chế các plasmid đi qua màng tế bào thông qua con đường tiếp hợp để
truyền các plasmid mang gen kháng kháng sinh ra ngoài. Tuy nhiên có plasmid mang
gen NDM-1 chứng tỏ đã có sự truyền plasmid từ các chủng vi khuẩn đường ruột sang
3.3.3.

A. baumannii.
Kỹ thuật multilocus sequence typing xác định kiểu gen các chủng vi khuẩn A.
baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1
Kỹ thuật này được thực hiện bằng phản ứng PCR với 7 cặp mồi bao gồm: gltA,
gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD.


Hình 3.13. Hình ảnh đại diện cho PCR – MLST chủng A. baumannii
Sau khi điện di xác định kết quả của phản ứng PCR, sản phẩm PCR sẽ được
tinh sạch và mang đi giải trình tự bằng máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied
Biosystem, Mỹ). Kết quả giải trình tự sẽ được đọc và phân tích bằng phần mềm
Bioedit và website
Bảng 3.2. Phân tích kết quả MLST các chủng A. baumannii


Chúng tôi đã tiến hành giải trình tự song song giữa các chủng A. baumannii
mang gen NDM-1 và chủng không mang gen NDM-1 phân lập được từ 3 bệnh viện
(Bảng 3.2). Đối với 12 chủng dương tính với NDM-1 trong nghiên cứu, có tới 5 kiểu
trình tự (ST) mới được phát hiện và được chia làm 5 nhóm (clonal complex) gồm
nhóm A, B, C, D và CC92. Trong 11 chủng âm tính với NDM-1, có 3 kiểu trình tự

mới được tìm thấy và được chia làm 4 nhóm gồm CC92, E, CC109, F.
Kết quả MLST phát hiện được 8 chủng thuộc các kiểu trình tự đã biết, còn lại
đều là các kiểu trình tự mới chưa được công bố trên thế giới. Điều này có thể được giải
thích là do việc sử dụng kháng sinh nhóm carbapenem tại Việt Nam đã tạo ra áp lực
chọn lọc cho A. baumannii tiến hóa theo một hướng riêng không giống với các nơi
khác trên thế giới. Nghiên cứu có 5 chủng thuộc 2 nhóm đã được công bố trên thế giới
là nhóm CC92 và CC109 là hai nhóm gây dịch bệnh trên thế giới [34]. Đây là những
phát hiện quan trọng cho thấy 3 bệnh viện ở Việt Nam đã xuất hiện những chủng A.
baumannii có nguy cơ gây dịch và đồng thời cũng xuất hiện các chủng mới dưới áp
lực của việc điều trị nhiễm khuẩn bằng kháng sinh, điều này trở thành áp lực lớn đối
với ngành y tế trong công tác phòng chống và điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện.


Đặc biệt, khi ta so sánh 12 chủng phân lập mang gen NDM-1 với 11 chủng âm
tính với gen này, ở các chủng mang gen NDM-1, số kiểu trình tự mới được phát hiện
nhiều hơn hẳn so với các chủng âm tính với NDM-1. Quan trọng hơn là ở tất cả 6
chủng thuộc novel 1 nằm ở bệnh viện Xanh Pôn và tìm thấy các allele giống nhau
hoàn toàn, điều đó cho thấy có mối liên hệ giữa các chủng gây nhiễm trùng bệnh viện
này với nhau. Bên cạnh đó 2 chủng thuộc ST 302 có một chủng phân lập ở Việt Đức
và một chủng phân lập ở Xanh Pôn cũng có các allele giống nhau, có thể thấy rằng đây
phải là một chủng có đặc trưng riêng gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện. Để đi đến một kết
luận chính xác, chi tiết hơn cần phải tiến hành điều tra thêm về các yếu tố dịch tễ học
lâm sàng và nghiên cứu sâu hơn các kỹ thuật sinh học phân tử.


KẾT LUẬN

Tình trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng

1.

carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn
• Đã phát hiện tỷ lệ khá cao các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng
carbapenem (28%; 582/2088) trên tổng số các chủng vi khuẩn kháng
carbapenem ở 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn đã được thu
•

thập trong 5 năm từ năm 2010 đến 2014.
Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm A. baumannii kháng carbapenem ở nam giới cao

hơn nhiều so với nữ giới (74%, và 26%).
2. Tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 phân lập được trong
nghiên cứu
• 23/582 A. baumannii kháng carbapenem có kết quả dương tính với gen
NDM-1 chiếm tỷ lệ 3,95 %.
• Các chủng mang gen NDM-1 phân lập được trên các bệnh nhân thuộc
nhiều nhóm tuổi, cao nhất là ở trẻ nhỏ dưới 10 tuổi được phát hiện ở bệnh
viện Xanh Pôn. Tỷ lệ phân lập theo giới cũng có sự chênh lệch đáng kể khi
nam giới chiếm tới 87% so với 13% nữ giới (tỷ suất chênh là 6,67).
• Kết quả MIC cho thấy các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 kháng lại
kháng sinh với tỷ lệ cao.
3. Một số đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn A. baumannii mang gen
NDM-1
• Bốn chủng phân lập được tại bệnh viện Xanh Pôn và chủng 2 chủng phân
lập được tại bệnh viện Việt Đức có sự tương đồng hoàn toàn về kiểu gen
•

PFGE.
Một chủng phân lập tại bệnh viện Thanh Nhàn phát hiện được một plasmid

mang gen NDM-1 có kích thước khoảng 50kb.
• Kết quả MLST cho thấy chỉ có 1 chủng A. baumannii mang gen NDM-1 tại
bệnh viện Việt Đức nằm trong nhóm CC92 gây dịch trên thế giới, các chủng
còn lại đều có kiểu trình tự gen không giống với kiểu trình tự gen đã được
công bố trên hệ thống MLST trong ngân hàng gen thế giới.
KIẾN NGHỊ
Đối với 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn:


•

Cần tiếp tục giám sát tình trạng vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-

1 kháng carbapenem tại ba bệnh viện.
• Các bệnh viện cần mở rộng hợp tác nghiên cứu để nghiên cứu sâu hơn
về các đặc điểm lâm sàng, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng vi
khuẩn mang gen NDM-1.