Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phạm Thị Huyền Nhung

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC SINH ENZYME HỌ GH61
HỖ TRỢ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. VŨ NGUYÊN THÀNH

Hà Nội - 2012


Lời cảm ơn
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ, chỉ bảo, động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên
Thành người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em
thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Bộ môn Vi sinh, Viện
Công nghiệp Thực phẩm đã luôn chỉ bảo, tạo điều kiện giúp em hoàn thành tốt
công việc.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã tận tình dạy dỗ chúng em trong suốt 2 năm học qua.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn

bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập.
Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên

Phạm Thị Huyền Nhung


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Thành phần lignocellulose......................Error: Reference source not found
Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và
kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) .....................Error: Reference source not found
Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín................Error:
Reference source not found
Hình 1.4: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần.......Error: Reference
source not found
Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985). .Error: Reference source not
found
Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần ......Error: Reference source not
found
Hinh 1.7: 3 loại tiền chất để tổng hợp lignin..........Error: Reference source not found
Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin....................Error: Reference source not found
Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase....Error: Reference source not found
Hình 1.10. Hoạt động của enzyme GH61...............Error: Reference source not found
Hình 1.11. Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose.........Error: Reference source not found
Hình 1.12: sợi nấm và cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995).........Error:
Reference source not found
Hình 1.13: Bào tử động (theo Samson và et al, 1995)......Error: Reference source not
found
Hình 1.14: Bào tử túi (b) ở Mucor circinelloides, (a) Cuống bào tử túi..............Error:
Reference source not found

Hình 1.15: Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus. Error: Reference source not
found
Hình 1.16: Bào tử đính và cuống bào tử đính ở Penicillium chrysogenum ........Error:
Reference source not found............................................................................................


Hình 1.17. Cuống bào tử phân nhánh ở Trichoderma. a. T. viride, b. T. koningii, c.
T. polysporum, d. T. citrinoviride ..........................Error: Reference source not found
Hình 1.18: bào tử đính của Fusarium eumartii .....Error: Reference source not found
Hình 1.19. Bào tử đốt .............................................Error: Reference source not found
Hình 3.1. Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 514, FEC
515, FEC 516...........................................................Error: Reference source not found
Hình 3.2. Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 519, FEC
523, FEC 534...........................................................Error: Reference source not found
Hình 3.3. Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 544, FEC
550 ..........................................................................Error: Reference source not found
Hình 3.4. Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 551, FEC
552 ..........................................................................Error: Reference source not found
Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 514. Error: Reference source
not found
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 519. Error: Reference source
not found
Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 523. Error: Reference source
not found
Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 534. Error: Reference source
not found
Hình 3.9. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 550. Error: Reference source
not found
Hình 3.10. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 551...........Error: Reference
source not found

Hình 3.11. Phổ fingerprinting của 19 chủng nấm mốc phân lập được................Error:
Reference source not found


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ
biến ......................................................................... Error: Reference source not found
Bảng 3.1. Các chủng nấm mốc phân lập được.......Error: Reference source not found
Bảng 3.2. Hoạt tính xylanse của 40 chủng phân nấm mốc phân lập được..........Error:
Reference source not found
Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase của 40 chủng nấm mốc phân lập được Error: Reference
source not found
Bảng 3.4. Hoạt tính enzyme xylanase và cellulase của 10 chủng nấm mốc trên 3 loại
cơ chất carbon khác nhau........................................Error: Reference source not found


Bảng 3.5. Hàm lượng protein (µg/ml) của 10 chủng nấm mốc nuôi trên 3 môi
trường carbon khác nhau.........................................Error: Reference source not found
Bảng 3.6. Hàm lượng D – gluconic acid trong 7 chủng nấm mốc phân lập được
.................................................................................Error: Reference source not found
Bảng 3.7. Phân loại các chủng nấm mốc dựa vào hình thái khuẩn lạc và tế bào Error:
Reference source not found
Bảng 3.8: Kí hiệu của các chủng khi finger printing........Error: Reference source not
found
Bảng 3.9. Kết quả phân nhóm 19 chủng nấm mốc bằng kĩ thuật finger printing Error:
Reference source not found

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMC: Carboxyl Methy Cellulose
DNS: Dinitrosalicylic Acid


dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphate
IU: International Unit (là một đơn vị đo lường cho các giá trị của một chất, dựa trên
hoạt động sinh học)
GH: Glycoside Hydrolase
PDA: Potato Dextro Agar
PCR: Polymerase Chain Reaction
SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide

MỤC LỤC


MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, các ngành công – nông – lâm
nghiệp … cũng phát triển một cách mạnh mẽ. Bên cạnh sự phát triển đó thì lượng
chất thải từ các ngành này thải ra môi trường cũng ngày một nhiều, làm ô nhiễm
môi trường sống không chỉ của các sinh vật mà còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới
con người. Ngoài những chất thải nhân tạo khó bị phân hủy thì cũng có một số chất
thải có nguồn gốc từ sinh vật cũng rất khó bị phân hủy trong điều kiện thường hay
bởi các sinh vật thông thường như chintin, lignocellulose, pectin… Trong đó
lingocellulose là chủ yếu. Sự tồn đọng của lignocellulose trong môi trường không
những gây ô nhiễm môi trường mà còn làm đứt quãng chu trình tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên. Do đó việc phân giải lignocellulose có vai trò rất quan trọng không
chỉ đối với môi trường mà còn đối với các sinh vật.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào
việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích

từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3]. Tuy nhiên, do lignocellulose là một chất rất
khó bị phân giải trong điều kiện thường, và chỉ có một số ít sinh vật có khả năng
phân hủy chúng. Bên cạnh đó, quá trình này đòi hỏi sự tham gia của rất nhiều
enzyme khác nhau đặc biệt là các enzyme trong họ Glycoside Hydrolase.
Nhằm mục đích tăng năng suất quá trình thủy phân lignocellulose thành các
đường đơn, đường đôi từ các phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đó đưa vào
ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người
và vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), chúng tôi đã thực hiện đề tài:
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ
thủy phân lignocellulose.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật. Thành
phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.1).
Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác
nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền
phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và hàm lượng của các polymer này trong thực
vật là khác nhau giữa các loài. Ngoài ra, nó còn tùy thuộc vào độ tuổi, giai đoạn
sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện môi trường. Thành phần của
lignocellulose được trình bày ở bảng 1.1 [10].

Hình 1.1: Thành phần lignocellulose

2


Nguồn lignocellulose

Cellulose (%)

Hemicellulose (%)

Lignin (%)

Thân gỗ cứng

40-55

24-40

18-25

Thân gỗ mềm

45-50

25-35

25-35

Vỏ lạc

25-30

25-30

30-40

Lõi ngô

45

35

15

Giấy

85-99

0

0-15

Vỏ trấu

32.1

24

18

Vỏ trấu của lúa mì

30

50

15

Rác đã phân loại

60

20

20

Lá cây

15-20

80-85

0

Hạt bông

80-95

5-20

0

Giấy báo

40-55

25-40

18-30

Giấy thải từ bột giấy
hóa học

60-70

10-20

5-10

Chất rắn nước thải
ban đầu

8-15

-

24-29

Chất thải của lợn

6

28

-

Phân bón gia súc

1.6-4.7

1.4-3.3

2.7-5.7

Cỏ ở bờ biển
Bermuda

25

35.7

6.4

Cỏ mềm

45

31.4

12.0

Các loại cỏ

25-40

25-50

10-30

Bã thô

33.4

30

18.9

Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông
nghiệp phổ biến [8]

3


Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp,
công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối
thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá
trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình
lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [10].
1.1.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức (C 6H10O5)n, là một polysaccharide

gồm một chuỗi tuyến tính gồm từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân D – glucose nối
với nhau bởi liên kết 1,4 β - glucoside [6] [8] .

Cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào ở thực vật, nhiều loại
tảo và lớp nấm trứng (Oomycetes). Một số loài vi khuẩn chế tiết cellulose để tạo thành
màng sinh học. Cellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất. Khoảng
33% khối lượng khô của thực vật là cellulose (sợi bông là 90%, gỗ là 40 -50% và cây
gai dầu khô là khoảng 75%) [9] [23] [24].
Khác với các carbohydrate phức tạp khác như tinh bột, glycogel có cấu trúc
cuộn lại hoặc phân nhánh, phân tử chính mở rộng và một cấu tạo giống hình que khá
cứng, cellulose có cấu trúc mạch thẳng. Sự khác biệt này là do các đơn phân trong
cellulose nối với nhau bằng cầu nối 1,4 β – glycoside; trong khi các carbohydrate khác
lại là liên kết 1,4 α – glycoside. Nhờ đặc tính này mà các phân tử cellulose dai hơn, bền
hơn, rất khó phân hủy ở điều kiện thường [2] [14].


Cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các
chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính
khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy các sợi ở cạnh nhau liên
kết với nhau bằng liên kết hydro. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn
hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những
khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già
thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Cellulose có nguồn gốc từ thực vật thường được
tìm thấy trong hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin và các chất khác, trong khi
cellulose vi khuẩn là khá tinh khiết, có hàm lượng nước cao hơn nhiều [23].
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van der
Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong vùng kết
kinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi
enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết lỏng
lẻo nên dễ bị tấn công. Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả

vùng kết tinh và vô định hình [4].

Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu
chuỗi gấp khúc (Folding chain) [4]


-

Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar): phân tử cellulose kéo thẳng và
định hướng theo chiều dài sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A, xếp xen kẽ với

-

vùng vô định hình
Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều dài
sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và
b như hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch
glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai
đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng
vô định hình, các liên kết β – glucoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên
kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, ba phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi
1800 cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi tác nhân thủy phân
hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β –
glucoside) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này
không tạo được liên kết hydro.
Nhiều tính chất của cellulose phụ thuộc vào độ dài chuỗi hoặc mức độ trùng

hợp, số lượng các đơn phân glucose tạo nên phân tử polymer. Cellulose từ bột gỗ có độ
dài chuỗi điển hình giữa 300 và 1700 đơn phân, bông và sợi thực vật khác cũng như
cellulose vi khuẩn có độ dài chuỗi khác nhau, từ 800 đến 10.000 đơn phân [5]. Các

phân tử với chiều dài chuỗi rất nhỏ là kết quả từ sự phân hủy cellulose, được gọi là
cellodextrin, trái ngược với chuỗi cellulose dài, cellodextrin thường hòa tan trong nước
và dung môi hữu cơ.
Một số động vật, đặc biệt là động vật nhai lại và mối, có thể tiêu hóa cellulose
với sự giúp đỡ của vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột. Con người có thể tiêu hóa
cellulose trong chừng mực nào đó [13], tuy nhiên nó chủ yếu là hoạt động như một
chất hỗ trợ tiêu hóa và thường được gọi là "chất xơ".


Cellulose dùng trong công nghiệp ngày nay chủ yếu được lấy từ bột giấy và bông.
Chúng chủ yếu được sử dụng để sản xuất bìa và giấy, trong một phạm vi nhỏ hơn nó
được chuyển thành sản phẩm dẫn xuất như giấy bóng kính và tơ nhân tạo. Chuyển đổi
cellulose từ cây trồng nhiên liệu vào nhiên liệu sinh học như ethanol cellulosic đang
được nghiên cứu như là một nguồn nhiên liệu thay thế.
1.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose là một polymer carbohydrate phức tạp và chiếm 25-30% tổng trọng
lượng khô gỗ. Nó là một polysaccharide với trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose
[12]. Nó thường được tìm thấy trong liên kết với cellulose trong thành tế bào thứ cấp
của thực vật, nhưng chúng cũng có mặt trong thành tế bào sơ cấp [19].
Hemicellulose là thuật ngữ chỉ một nhóm các homo - và heteropolymer bao gồm
các đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D – glucose, và các
nhóm thế: L – arabinose, acid 4 – O – methyl – glucuronic, D – galacturonic và D –
glucuronic. Các phân tử đường liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 β và đôi khi là 1,3 β
– glycoside. Sự khác biệt chính với cellulose là hemicellulose có phân nhánh với chuỗi
bên ngắn gồm các loại đường khác nhau; do đó, chúng dễ bị thủy phân hơn so với
cellulose [12].
Thành phần chính của hemicellulose trong gỗ cứng là glucuronoxylan và trong gỗ
mềm là Glucomannan. Glucuronoxylan trong gỗ cứng và thực vật thân thảo gồm mạch
chính là 1,4 β – D – xylan với nhóm thế 1,2 α – 4 – O – methyl – D – giucuronic acid
(hoặc 1,2 α – D – glucuronic acid), chiếm khoảng 10% dư lượng xylose (Hình 1.3).

Xylan trong trong gỗ mềm và thực vật thân thảo khác với xylan trong gỗ cứng ở chỗ
chúng có arabinofuranose liên kết với mạch chính xylan bằng liên kết 1,3 α (Hình 1.4)
[20].


Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín
(theo Dekker 1985)

Hình 1.4: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần
(theo Dekker 1985)
Các glucomannoxylan (thường được gọi là glucomannan và galactomannan)
được cấu thành từ 1,4 β – D – glucose và β – D – mannose dư lượng trong mạch thẳng
(Hình 1.5). Glucomannan trong gỗ cứng chứa liên kết 1,4 β giữa glucose và mannose
hình thành chuỗi nhánh nhỏ. Tỷ lệ mannose: glucose là khoảng 1.5 : 1 hoặc 2 : 1 trong
hầu hết các cây gỗ cứng. Glucomannan trong gỗ mềm đôi khi có các nhánh phụ
galactose liên kết với mannose mạch chính bằng 1,6 α (Hình 1.6). Các liên kết 1,6 α
của galactose là rất nhạy cảm với acid và kiềm và có thể phân cắt trong môi trường
kiềm (Timell 1965). Các xylan trong gỗ mềm và hầu hết thực vật thân thảo đều có một
phân tử L – arabinofuranosyl gắn vào thông qua liên kết với một số vị trí O – 3 của
mạch chính (Wilkie 1979). Khoảng 60% đến 70% xylose của xylan trong gỗ cứng


được acetyl hóa bằng liên kết ester ở vị trí 2 hoặc 3. Xylan trong thực vật thân cỏ và
galactomannan trong gỗ mềm cũng được acetyl hóa, mặc dù mức độ thấp hơn
(Lindberg et al, 1973 a, b). [20]

Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985)

Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần (theo Dekker 1985)
1.1.3. Lignin

Lignin hoặc lignen là một hợp chất hóa học phức tạp phổ biến nhất trong gỗ, và
là một phần không tách rời của thành tế bào thứ cấp ở thực vật [15] và một số loài tảo
[16]. Thuật ngữ này được giới thiệu vào năm 1819 bởi de Candolle và có nguồn gốc từ
tiếng Latin: lignum, [8] có nghĩa là gỗ. Đây là một trong những polymer hữu cơ phong
phú nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose, nó chiếm 30% carbon hữu cơ phi hóa thạch,
[22] và từ 1/4 tới 1/3 khối lượng khô của gỗ [25]. Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi


không những phụ thuộc vào loài cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý.
Ví dụ, trong cây lá kim chứa khoảng 20 – 30%, cây lá rộng 20 – 25%, trong khi cỏ là 5
– 9% [20].
Lignin được tìm thấy ở tế bào thực vật bậc cao (hạt kín và hạt trần), Dương xỉ
và cây Thạch tùng. Đặc biệt lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được chuyên hóa
để vận chuyển chất lỏng. Lignin không được tìm thấy ở rêu, địa y và tảo – là các loại
thực vật không có quản bào [25].
Lignin là hợp chất raxemic với khối lượng phân tử lớn, có đặc tính thơm và kị
nước. Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ
[16]. Nghiên cứu xác định độ trùng hợp của lignin, người ta thấy có sự phân đoạn trong
quá trình tách chiết và phân tử có chứa nhiều loại tiền chất xuất hiện lặp đi lặp lại một
cách ngẫu nhiên trong đó chủ yếu là tại các mắt xích và nhiều nhất là dẫn xuất của
phenylpropan [15].
Thành phần của lignin gồm 62 – 65 % carbon, 5 – 6% hydro, nhiều nhóm
metoxyl (- OCH3) và hydroxyl (-OH) tự do. Lignin được tổng hợp bởi sự polymer hóa
các tiền chất phenylpropanoid. Có 3 loại tiền chất được phân loại tùy theo số lượng
nhóm methoxyl trên vòng thơm; gồm: coniferyl alcohol (guaiacyl propanol), coumaryl
alcohol (p-hydroxyphenyl propanol), và sinapyl alcohol (syringyl propanol) được miêu
tả bằng công thức hóa học sau [16].


Hinh 1.7: 3 loại tiền chất để tổng hợp lignin

Coniferyl alcohol là thành phần chính của lignin gỗ mềm, trong khi đó guaiacyl
và syringyl alcohol là thành phần chính của lignin gỗ cứng [22].
Lignin gỗ mềm (hạt trần) bao gồm cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu coniferyl,
một ít từ β – coumaryl, không có sinapyl. Lignin gỗ cứng (hạt kín) chứa số lượng cân
bằng coniferyl và sinapyl (46%) và một lượng nhỏ (8%) coniferyl β –
hydroxylferylpropan (có nguồn gốc từ rượu coumaryl). Lignin cỏ là hợp chất của
coniferyl, sinapyl và β – hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 – 10%), chủ yếu
là ester và nhóm hydroxyl tận cùng của rượu β – coumaryl [22].


Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin

1.2. Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61)
1.2.1. Glycoside hydrolase
Glycoside hydrolase (còn gọi là glycosidase hoặc glycosyl hydrolase) xúc tác
cho phản ứng thủy phân các liên kết glycoside để tạo thành các phân tử đường nhỏ
hơn. Chúng là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, có vai trò như phân giải sinh khối
sinh vật (cellulose và hemicellulose), phòng chống vi khuẩn (ví dụ, lysozyme), trong
cơ chế sinh bệnh (ví dụ, neuraminidase trong virus) và chức năng khác trong tế bào (ví


dụ, mannosidase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp liên kết N- glycoprotein). Cùng
với glycosyltransferase, glycosidase tạo thành bộ đôi xúc tác cho sự tổng hợp và phá
vỡ liên kết glycoside [24].

Glycoside hydrolase được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống. Ở sinh vật
nhân sơ, chúng được tìm thấy ở cả enzym nội bào lẫn enzyme ngoại bào, chúng chủ
yếu tham gia vào việc hấp thu dinh dưỡng. Một trong những enzyme quan trọng của
glycoside hydrolase ở vi khuẩn là enzyme β – galactosidase (lacZ), tham gia vào quá

trình điều hòa biểu hiện gen của operon lac ở E. coli. Sinh vật bậc cao, glycoside
hydrolase được tìm thấy trong lưới nội chất và bộ máy Golgi nơi chúng được gắn thêm
liên kết N-glycoprotein, và trong lysosome. Sự thiếu hụt glycoside hydrolase trong
lysosome có thể dẫn đến một loạt các rối loạn dự trữ từ đó có thể ảnh hưởng đến sự
phát triển hoặc gây tử vong cho sinh vật. Các glycoside hydrolase được tìm thấy trong
đường ruột và trong nước bọt có thể phân giải các carbohydrate phức tạp như lactose,
tinh bột, sucrose và trehalose. Trong ruột, chúng được tìm thấy như enzyme bám
glycosylphosphatidyl trên tế bào nội mô. Enzyme lactase cần thiết cho sự phân giải
lactose sữa. Enzyme O – GlcNAcase liên quan đến việc loại bỏ các nhóm Nacetylglucoamine từ serine và threonine thừa trong tế bào chất và nhân tế bào.
Glycoside hydrolase còn tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và phân giải glycogen
trong cơ thể [18].
Glycoside hydrolase được phân thành nhóm EC 3.2.1 là enzyme xúc tác thủy
phân của O- hoặc S-glycoside. Glycoside hydrolase cũng có thể được phân loại, theo
cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng thủy phân, do đó chúng có thể được phân loại


thành enzym giữ nguyên hoặc đảo nghịch (hình 1.9 a). Chúng cũng có thể được phân
loại như exo hoặc endo, phụ thuộc vào hoạt động của chúng tại vị trí đầu hoặc giữa của
chuỗi oligo / polysaccharide. Hoặc chúng cũng có thể được phân loại dựa trên các
phương pháp phân tích trình tự hoặc cấu trúc [23].

a.

b.
Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase
a)Theo cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng
b)Theo exo/endo

1.2.2. Họ GH 61

Trong số các họ glycoside hydrolase xúc tác thủy phân cellulose và
hemicellulose, thì vai trò chức năng của họ 61 (GH61) vẫn còn nhiều điều chưa được
làm sáng tỏ cho đến gần đây. Đặc tính của GH61 protein được mô tả đầu tiên vào năm
1992. Ban đầu họ glycoside hydrolase 61 được phân loại dựa vào việc đo lường hoạt
động của endo-1,4-β-D-glucanase của một số thành viên trong họ mặc dù hoạt động
của enzyme này là rất yếu.
Khác với các enzyme GH khác, enzyme họ GH61 không có khả năng thủy
phân liên kết glycoside hoặc rất yếu [17], vai trò chính của nó là oxy hóa cellulose tạo
ra các đầu hở, tạo điều kiện cho các enzyme cellulase bám vào hoạt động [7].

Hình 1.10. Hoạt động của enzyme GH61
Mặc dù mô hình cơ chế hoạt động cuối cùng của các enzyme họ GH61 vẫn chưa
được tìm thấy, song một số tính năng phổ biến của chúng có thể được tổng quát như
sau [7]:
 GH61 là Metallo-enzyme tức là enzyme cần một ion kim loại hóa trị hai để

hoạt động, và đồng thời là ion kim loại điều phối hoạt động của trung tâm
phản ứng.


 Quá trình oxy hóa liên kết glycosidic là hoạt động chính của chúng, tất cả

GH61s đều cần một chất đồng yếu tố ở dạng khử, hoạt động như chất cho
điện tử từ bên ngoài: gallate, ascorbate, và CDH enzyme (thường được kiểm
soát và biểu hiện cùng với GH61s) để tăng cường hoạt động của GH61s.
Mặc dù quá trình oxy hóa có thể diễn ra tại các vị trí carbon khác nhau trong
cấu trúc vòng glucose (C1, C4 hoặc C6), tuy nhiên oxy hóa C1 (aldonic) cellodextrines
là phổ biến nhất.

Hình 1.11. Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose

1.3. Giới thiệu chung về nấm mốc [1]
1.3.1. Định nghĩa
Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệp
lục, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào được cấu tạo chủ yếu là
chitin, có hoặc không có cellulose. Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử
do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu…


Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên động vật, thực vật, và trên con
người. Một số chúng là tác nhân gây bệnh, làm hư hại lương thực, thực phẩm và các đồ
dùng, thiết bị. Tuy nhiên cũng có nhiều loài có lợi cho con người nhờ khả năng tổng
hợp acid hữu cơ, chất kháng sinh, vitamin… hay kích thích tố giúp tăng trưởng ở thực
vật…
1.3.2. Hình thái cấu trúc
Nấm mốc có dạng sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, cấu tạo đơn bào
hoặc đa bào. Sợi nấm có vách ngăn (đa bào) như nấm bậc cao (Ascomycytes,
Basicdiomycetes) hay không có vách ngăn (đơn bào) như nấm bậc thấp (Oomyctes,
Zygomycetes) hoặc hình ống có nhiều nhân gọi là sợi cộng bào.
Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy
loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm.
Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài
theo kiểu tăng trưởng ở ngọn (Hình 1.12). Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh
có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như
bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào
nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất
định gọi là khuẩn lạc nấm.

Hình 1.12: sợi nấm và cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995)
Một bào tử rơi xuống gặp môi trường thuận lợi sẽ nảy mầm tạo khuẩn lạc. Sợi
nấm hút thức ăn làm nhiệm vụ nuôi dưỡng gọi là khuẩn ty cơ chất. Sợi mang cuống
bào tử làm nhiệm vụ sinh sản gọi là khuẩn ty khí sinh.
1.3.3.

Sinh sản của nấm mốc

Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính. Trong sinh
sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh
sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái.

a. Sinh sản vô tính