Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Tên
viết tắt

1

ALL

Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho

Acute lymphoblastic
leukemia

2

AML

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Acute myeloid leukemia

3

BCC

Bạch cầu cấp

Leukemia

4

CE

Cacboxyl esteraza

Carboxyl esterase

5

CS

Cộng sự

et al

6

CD

Dấu ấn miễn dịch

Cluster of Differenciation

7

FAB

Hội các nhà huyết học Pháp Mỹ - Anh

French - American - British

8

HHTB

Nhuộm Hóa học tế bào

Cytochemistry

9

HLA - DR

Kháng nguyên bạch cầu người

Human Leukocyte antigen

10

LA

Bệnh bạch cầu cấp

Acute leukemia

11

L1

Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho đã biệt hóa

Homogenous small blast type

12

L2

Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho chưa biệt hóa

Heterogenous blast type

13

L3

Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho loại Burkitt

Homogenous lager blast type

14

M0

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
biệt hóa tối thiếu

Minimally differentiated
acute myeloid

15

M1

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
không có tế bào trưởng thành

Acute myeloblastic leukemia,
without maturation

16

M2

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có
tế bào trưởng thành

Acute myeloblastic leukemia,
with granulocytic maturation

17

M3

Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tủy

Acute promyelocytic
leukemia

18

M4

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mono

Acute myelomonocytic
leukemia

Tên Tiếng Việt

Tên Tiếng Anh


19

M5

Bệnh bạch cầu cấp dòng mono

Acute mono

20

M6

Bệnh bạch cầu cấp dòng
hồng cầu

Acute erythroid leukemia

21

M7

Bệnh bạch cầu cấp dòng
tiểu cầu

Acute megakaryoblastic
leukemia

22

NE

Esteraza không đặc hiệu

Non-specific esterase

23

NE - NaF

Esteraza không đặc hiệu ức chế
bằng NaF

Non-specific esteraza - NaF
inhibitor

24

PA

Photphataza axit

Acid photphatase

25

PAL

Photphataza kiềm

Alkaline photphatase

26

PAS

Periodic Axit Schiff

Periodic -Acid - Schiff

27

PER

Peroxydaza

Peroxidase

28

SD

Sudan đen

Sudan black

29

SLTBT

Số lượng tế bào tủy

The number of myeloid cells

30

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

World Heath Organization

DANH MỤC HÌNH


DANH MỤC BẢNG


MỞ ĐẦU
Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc
trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Bạch cầu cấp
được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho .
Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy
xương. Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu
dòng lympho. Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương,
chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng
[23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong
nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc xác định chính xác thể
bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị. Hiện nay,
việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu
chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa
ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu
chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17].
Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan
black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế
bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp
nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn
dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ
triển khai. Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá
thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy
trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau,

bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất,
nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội
chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với
các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng
sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là
89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc

5


hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào
theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều
chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19]. Hiện nay, tác giả
Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và
chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật:
Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu,
Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza
kiềm, Photphataza axit, Perls. Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên.
Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại,
đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo
tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào
trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di
truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu
chuẩn FAB (1986).
Nội dung nghiên cứu:

− Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần
đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương.

− Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ
HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di
truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB.

− Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi
nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls
trên bệnh nhân bạch cầu cấp.

6


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Quá trình sinh máu
1.1.1. Cơ quan sinh máu
Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức)
và tổ chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch. Sau
khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của
các xương. Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các
xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy
biệt hóa các dòng lympho T và B [6].
1.1.2. Quá trình sinh máu
Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra
từ tế bào gốc vạn năng. Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự kích
thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế bào có chức
năng cần thiết [11]. Ba kích thích tố chính tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng
cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colony-stimulating factors cùng với interleukin
(IL) kích thích tạo bạch cầu. Quá trình sinh máu được điều hòa bởi yếu tố di truyền
đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13].
1.2. Bệnh bạch cầu cấp
1.2.1. Khái niệm chung

Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với đặc
điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở ngoài
máu ngoại vi, tủy xương có trên 30% tế bào non (blast) trong tổng số tế bào có
nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào các cơ
quan [12].
1.2.2. Dịch tễ học

− Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2014,
ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Tỷ lệ nam
(3.100) và nữ (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này là 1.450
người [52];

7


− Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng
tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp dòng
lympho mới trên toàn quốc [44];
− Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ về dịch tễ học
của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện Huyết
học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ
cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại Bệnh viện
Bạch Mai [7].
1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh
Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên qua nhiều
nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:

− Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có
nguy cơ bị bạch cầu cấp;
− Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để

chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;
− Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho,
Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm...
− Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng
Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp
[12].
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh

− Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene): Các gen bình thường do
yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen
ung thư. Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt
tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào;
− Gen ức chế ung thư: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh
được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, nếu mất
các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u;
− Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa và
kích thích tăng sinh tế bào. Khi các gen này được giải phóng và kết hợp với

8


gen ức chế bị kìm hãm sẽ làm tăng trưởng mạnh sự phát triển khối u và làm
các tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37].
− Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho được thể
hiện trên Bảng 1.1 [10].
Bảng 1.1. Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho.
Tiên lượng
Tốt

Loại bất thường

Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21)

Trung bình

Trên lưỡng bội từ 47-50 NST; 46XX/XY (bộ NST bình
thường); Chuyển đoạn t(1;19)

Xấu

Thiểu bội, mất NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn
t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14).

1.2.5. Phân loại

• Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy
theo FAB 1976. Bạch cầu cấp dòng tủy được chia làm các thể từ M1 đến M7:

−

Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa;

−

Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;

−

Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu và chia làm 2 nhóm:

+ M3h: chứa các hạt đặc hiệu lớn;

+ M3v: chứa các hạt đặc hiệu nhỏ.
−

Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm:

+ M4: lơ xê mi cấp tủy - mono;
+ M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu ái toan.
−

Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:

+ M5a: ≥80% tế bào mono là monoblast;
+ M5b:<80% tế bào mono là monoblast.
−

Thể M6: Thể bạch cầu cấp dòng tủy với hội chứng loạn sản hồng cầu;

−

Thể M7: lơ xê mi cấp nguyên mẫu tiểu cầu.

9


• Xếp loại bạch cầu cấp dòng lympho: Theo xếp loại FAB, bạch cầu cấp dòng
lympho được chia làm 3 thể từ L1 đến L3 thể hiện trên bảng 1.2.
Bảng 1.2. Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB.
Hình thái tế bào

L1

L2

L3

Kích thước tế bào

Nhỏ, đều

Lớn, không đều

Lớn, đều

Chất nhiễm sắc

Đồng nhất, mịn

Không đồng nhất

Mịn và đồng nhất

Hình dạng nhân

Đều đặn, đôi khi
có rãnh, khía

Không đều,
thường có rãnh,
khía

Đều đặn, hình bầu
dục hoặc tròn

Hạt nhân

Không thấy hoặc
nhỏ

Một hay nhiều hạt
nhân to

Một hay nhiều hạt
nhân hình túi

Nhân/ Bào tương

Thấp

Khá cao, thay đổi

Cao

Bào tương ưa base

Nhẹ, vừa hoặc đậm Vừa hoặc đậm

Rất đậm

Không bào trong
bào tương

Thường không có

Hốc to và nhiều

Thường không có

1.2.6. Đặc điểm lâm sàng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh là hậu quả của quá trình sản sinh quá nhiều tế
bào non, ác tính lấn át các tế bào máu sinh máu bình thường. Bệnh có nhiều thể,
mỗi thể có những đặc điểm riêng, các biểu hiện lâm sàng chung nhất gồm:

− Hội chứng thiếu máu: xảy ra nhanh, nặng dần với các biểu hiện da xanh, mệt
mỏi, hoa mắt chóng mặt, nhịp tim nhanh. Thường không cân xứng với tình
trạng xuất huyết;
− Hội chứng xuất huyết: xuất huyết tự nhiên, hay ở da - niêm mạc (chấm nột
đám mảng xuất huyết, chảy máu mũi, chảy máu chân răng...) có thể ở các
tạng (xuất huyết đường tiêu hoá, tiết niệu, tử cung, não - màng não...);
− Hội chứng nhiễm trùng: Sốt, viêm loét miệng họng, viêm phổi, nhiễm trùng da;
− Hội chứng thâm nhiễm: Gan to, lách to, hạch to, phì đại lợi , thâm nhiễm da,
đau xương, cơ khớp...
− Toàn trạng chung: mệt mỏi gầy sút, suy sụp nhanh.

10


1.2.7. Đặc điểm xét nghiệm

•

Huyết đồ:

−

Thiếu máu bình sắc, hồng cầu bình thường, hồng cầu lưới giảm;

−

Bạch cầu: số lượng bạch cầu thường tăng, nhưng có thể bình thường hoặc giảm.
Công thức bạch cầu thường gặp một tỷ lệ tế bào blast. Tuy nhiên một số trường hợp
số lượng bạch cầu giảm nặng có thể không gặp tế bào blast ở máu ngoại vi;

−

Tiểu cầu: số lượng giảm.

•
−

Tuỷ đồ:

Số lượng tế bào tuỷ: thường tăng, tủy giàu tế bào. Trong một số trường hợp tủy
nghèo hoặc có mật độ bình thường;

−

Tăng sinh tế bào blast trên 30% tế bào có nhân trong tuỷ xương;

−

Các dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu bị lấn át.

•

Sinh thiết tuỷ xương: Chỉ định khi chọc hút tuỷ nghèo tế bào. Các khoang

•

sinh máu có nhiều tế bào ác tính, có thể có tình trạng xơ.
Nhuộm hoá học tế bào: Sử dụng hóa chất nhuộm một số enzym và các chất
có trong tế bào, qua đó xác định được dòng tế bào, kết hợp với kết quả hình
thái học trên tiêu bản nhuộm giemsa có thể phân loại thể bệnh bạch cầu cấp
theo tiêu chuẩn FAB.
Xét nghiệm miễn dịch:

•

Bằng kỹ thuật miễn dịch phát hiện các kháng nguyên dấu ấn trên màng các tế
bào blast (CD-Cluster of Differentiation) và đối chiếu với sự xuất hiện các CD này
trong quá trình biệt hóa và trưởng thành tế bào máu bình thường để biết bản chất
dòng và giai đoạn biệt hóa của tế bào trong bệnh bạch cầu cấp.

− Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu dòng tủy: Các
tế bào non thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các kháng nguyên

−

CD33 hoặc CD14.
Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho B:

11


+ Tế bào nguồn đầu dòng B: CD10, CD19;
+ Tế bào tiền lympho B: CD10, CD19, CD20;
+ Lympho B trưởng thành: CD19, CD20, CD21, CD22, CD23;
+ Tương bào: CD38.
−

Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho T:

+ Tế bào nguồn đầu dòng T: TdT, HLA;
+ Tế bào tiền lympho T: TdT, CD7, CD2, CD3;
+ Tế bào lympho T4: CD2, CD3, CD4;
+ Tế bào lympho T8: CD2, CD3, CD8.
•

Xét nghiệm về di truyền NST:
Xét nghiệm di truyền thường được dùng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

Có một số bất thường nhiễm sắc thể phổ biến trong một số thể bạch cầu cấp
(chuyển đoạn, đảo đoạn,…), cụ thể như sau:

−
−
−
−

t(8;12) trong bạch cầu cấp M2;
t(15;17) trong bạch cầu cấp M3;

Inversion (inv) 16 trong bạch cầu cấp M4Eo;
t(9;22) trong bạch cầu cấp dòng lympho.

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào
Nhuộm hóa học tế bào từ lâu đã trở thành đối tượng được các nhà khoa học
tập trung nghiên cứu phát triển các kỹ thuật nhằm phát hiện các enzym cũng như
các chất chuyển hóa có trong nội bào tế bào. Năm 1885, Ehrlich là người đầu tiên
nhuộm enzym cytochrom oxidaza trong các mô tươi bằng phản ứng "Nadi" giữa
α-naphtol và dimethyl-p-phenylethylendiamine và có thể quan sát được trên kính
hiển vi. Neukirch (1910) giới thiệu kỹ thuật nhuộm phát hiện các glycogen trong
các bạch cầu trung tính bằng phẩm màu carmin theo phương pháp Best [31, 40].
Năm 1947, Bailllif và Kimbrough ứng dụng dùng Sudan B nhuộm hạt mỡ bạch cầu
để phân biệt dòng tuỷ và các dòng khác [31, 40]. Đầu những năm 50 của thế kỷ XX,
sự phát triển mạnh mẽ của các loại phẩm màu azo đã giúp các nhà nghiên cứu đưa
các tiến bộ trong ngành hóa màu vào ứng dụng nhuộm hóa học tế bào [30, 32, 51].

12


Năm 1953, Gomori là người đầu tiên phát triển kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu
bạch cầu người sử dụng naphtol AS-D cloaxetat làm cơ chất [55]. Việc phối hợp
với các công nghệ khác như kỹ thuật kháng thể đơn dòng và các phương pháp phân
tích dòng chảy đã cho phép tự động hóa đạt kết quả tin cậy cao [45]. Phương pháp
hình thái học-nhuộm hóa học tế bào cùng với miễn dịch và di truyền được ứng dụng
rộng rãi trong chuyên ngành Huyết học để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu
chuẩn FAB và tiêu chuẩn WHO [28, 32, 34, 49]. Hiện nay, trên thế giới thường sử
dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau:
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS)
Phương pháp dựa trên nguyên lý của phản ứng hóa học gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Axit periodic oxi hóa glycogen trong tế bào thành diandehit

theo hình 1.1:
HO

R1

+
R2

R1CHO

HIO4

+

R2CHO

OH

1-2 Glycol

Diandehit

Hình 1.1. Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit
Ghi chú: R1, R2 là các gốc: amin (-RNH2) hoặc alkyl amino thế (-RNHR')
Giai đoạn 2: Diandehit tạo thành tham gia vào phản ứng nhuộm hoàn nguyên
bằng thuốc thử Schiff thể hiện trên hình 1.2:

13

NH2

HO2 SN

NH

SO 3 H

+

NSO2 (OH)HCR

2R - CHO

NSO2 (OH)HCR

NSO2 H

Thuốc thử Schiff

Phẩm màu quinoit

Hình 1.2. Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit
Như vậy, về mặt bản chất đây là một phản ứng nhuộm hoàn nguyên nhằm
bộc lộ glycogen có trong nguyên sinh chất của tế bào. Kết quả dương tính khi có
màu đỏ trên nguyên sinh chất của tế bào nghĩa là có glycogen và ngược lại.
Phản ứng PAS thường dương tính đối với bạch cầu ung thư dòng lympho, tế
bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Các tế bào monoxit và
lymphoxít bình thường có độ dương tính rất thấp. Các dòng tế bào khác như dòng
tủy, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu, tương bào dương tính dạng lan tỏa, còn tế bào bạch cầu

ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như âm tính. Những tính chất khác nhau đó
là cơ sở của kỹ thuật nhuộm hóa học bạch cầu để phân biệt các dòng tế bào và xếp
loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].
1.3.2. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER)
Cơ chế của phản ứng nhuộm peroxidaza đi qua hai giai đoạn thể hiện trên
hình 1.3 và 1.4 [29, 46]:
H2 O2

Peroxydaza

H2O + O:

Hình 1.3. H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử

H2N

NH2

O

14

HN

NH


Benzidin

Di-imin diphenyl

Hình 1.4. Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl.
Dưới xúc tác của peroxidaza là một enzym oxi hóa khử, nước ôxi già bị khử
thành nước và oxi nguyên tử, oxi nguyên tử có tính oxi hóa mạnh đã oxi hóa
benzidin thành 2-diimin diphenyl có màu vàng nâu. Nếu trên nguyên sinh chất của
tế bào có màu vàng nâu chứng tỏ có mặt của peroxidaza.
Peroxidaza dương tính đối với các tế bào dòng tủy, dương tính nhẹ với dòng
mono; âm tính với dòng lymphoxít, dòng hồng cầu và tiểu cầu.
1.3.3. Kỹ thuật nhuộm sudan B
Cơ chế của các phản ứng nhuộm rất khác nhau gồm khuếch tán vật lí đơn
thuần hoặc liên kết hóa học trực tiếp. Trong các loại thuốc nhuộm, sudan là một
nhóm phẩm nhuộm được ưa chuộng nhuộm lipit từ vàng (Sudan III) đến đen
(Sudan B).
Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm sudan B cho kết quả bạch cầu hạt
dương tính mạnh, monoxit dương tính yếu, lymphoxit và hồng cầu âm tính. Trong
tủy xương bình thường, các tế bào dòng tủy dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào
trưởng thành, dòng mono chỉ dương tính ở các tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu và
tiểu cầu âm tính. Trong nhiều trường hợp của bệnh bạch cầu cấp có thể phân biệt
tương đối rõ dòng tủy và các dòng tế bào khác bằng kết quả nhuộm Sudan B. Kết
quả dương tính Sudan B của mẫu bệnh phẩm thường cũng cho kết quả dương tính
với kỹ thuật nhuộm Peroxidaza. Chính vì vậy kết quả nhuộm Sudan B là một trong
những tiêu chuẩn được ứng dụng phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo
tiêu chuẩn FAB [28].
1.3.4. Kỹ thuật nhuộm esteraza
a) Nhuộm esteraza đặc hiệu [54]
Cơ chế phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chất là các este tạo thành
dẫn xuất của naphtol như hình 1.5:

15

CONH

CONH

esteraza

OCOCH2Cl

CH3

CH3

OH

Naphtol AS-D Cloaxetat

Naphtol AS-D

Hình 1.5. Thủy phân cơ chất este thành naphtol
Giai đoạn 2: dẫn xuất naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu
azo theo hình 1.6

CONH

CONH
CH3

OH

OCH3

N
N

N N Cl

O

CH3

OH
OCH3
O
C

C

N

N
H

OCH3 H

OCH3

Hình 1.6. Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo
Cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu gồm nhiều loại: naphtol AS-D cloaxetat,
Naphtol AS-OL 2-clopropionat... Trong giai đoạn 1, phân tử cơ chất dưới xúc tác

của enzym tạo thành napthol theo cơ chế của hình 1.5 và 1.6. Giai đoạn 2 là giai
đoạn ghép đôi giữa naphtol và muối điazo. Về mặt bản chất đây là phản ứng thế
electrophin của nhóm azo cho nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C 4 trên vòng
naphtol. Tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có màu đỏ hoặc màu đen. Nếu
xuất hiện màu trên nguyên sinh chất của tế bào có nghĩa là có esteraza. Tốc độ của
quá trình nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ cơ chất, muối điazo,

16


thành phần dung môi, nhiệt độ và pH môi trường... các hóa chất sử dụng luôn đòi
hỏi độ tinh khiết cao, giá thành đắt [3, 14, 40, 47, 55].

17


b) Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế và không ức chế bằng NaF
Nhuộm phát hiện esteraza không đặc hiệu bạch cầu người lần đầu tiên được
công bố vào năm 1959 bởi Braunstein. Esteraza không đặc hiệu dương tính trong tất
cả các dòng tế bào máu vì thế nên được gọi là không đặc hiệu. Cơ chế phản ứng
thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống như nhuộm esteraza đặc
hiệu (hình 1.4, 1.5 và 1.6). Cơ chất thường sử dụng là naphtol AS axetat, α-naphtyl
axetat, α-naphtyl butyrat và naphtol AS-D axetat. Chất ghép đôi thường sử dụng là
muối điazo và tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có phổ màu khác nhau từ
đen đến đỏ. Các cơ chất của α-naphtyl axetat, α-naphtyl butyrat thường cho phản
ứng dương tính mạnh đối với dòng mono, dòng tiểu cầu; các dòng khác lên màu
dưới dạng hạt và yếu. Riêng tế bào lymphoxít B cho kết quả âm tính. Đối với cơ
chất naphtol AS-D axetat và naphtol AS Axetat thì dương tính mạnh ở tất cả các
dòng trừ dòng tế bào lymphoxit B. Tuy có mức độ dương tính khác nhau nhưng chỉ
có dòng mono bị ức chế bởi NaF với nồng độ 1,5 mg/1 ml. Chính nhờ tính chất này

mà kỹ thuật nhuộm với chất ức chế NaF thường dùng để phân biệt dòng mono với
các dòng tế bào khác trong bệnh bạch cầu cấp và là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế
bào theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].
1.3.5. Kỹ thuật nhuộm photphataza
Photphataza bạch cầu thuộc nhóm Hidrolaza (EC 3.1.3.2) là một enzym xúc
tác cho phản ứng thủy phân nhóm photphat từ nhiều loại phân tử, bao gồm các
nucleotide, protein, và ancaloit [3, 30].
Photphataza có mặt chủ yếu trong lysosom và được giải phóng qua hệ thống
lưới nội nguyên sinh chất. Photphataza là một hệ enzym không đồng nhất gồm
nhiều iso enzym có thể hoạt động ở pH tối ưu khác nhau và được gọi tên gắn liền
với điều kiện pH hoạt động tối ưu như: photphataza kiềm (pH=8-9), photphataza
axit (pH=5-6,5) [35, 38]. Trong các phương pháp nhuộm hóa học tế bào có hai kỹ
thuật nhuộm photphataza là: Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm và photphataza axit
Với sự phát triển mạnh của kỹ thuật hóa màu đặc biệt là phát hiện phẩm màu azo đã
được ứng dụng vào để nhuộm photphataza kiềm và axit.

18


Nguyên lý của kỹ thuật đi qua hai giai đoạn [40, 43].
Giai đoạn 1: Thủy phân cơ chất naphtyl photphat thành các naphtol tương
ứng dưới sự xúc tác của photphataza kiềm (ALP) hoặc axít (AP) theo hình 1.7:
OH

OPO3HNa

+

ALP/AP
H2 O

+

PA

Natri α-naphtyl photphate

NaH2 PO4

α-Naphtyl

Hình 1.7. Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol.
Giai đoạn 2: Naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo
hình 1.6 như ở phần nhuộm esteraza.
Photphataza kiềm bạch cầu dương tính đối với dòng tủy từ hậu tủy bào đến
bạch cầu hạt. Tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Ngoài ra
các tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính trong kỹ thuật nhuộm này.
Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu giảm trong
bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu tăng trong các
bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 30, 40, 43].
Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại
tế bào B, tế bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu. Dòng hồng cầu,
mono, lympho (trừ bệnh bạch cầu tế bào tóc-tế bào B hay còn gọi là Hairy cell) và
dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả âm tính [40, 56].
1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học
Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh học và
đặc biệt trong chuyên ngành Huyết học-Truyền máu. Trong bệnh bạch cầu cấp, kết
quả của phương pháp hình thái học-nhuộm hóa học tế bào, phương pháp marker và
di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp cũng như thể
bệnh. Việc xác định chính xác thể bệnh quyết định việc dùng thuốc điều trị đặc biệt

là các thuốc nhắm đích. Trong bệnh bạch cầu kinh, nhuộm photphataza kiềm
thường bị giảm điểm nhuộm và có giá trị phân biệt với các bệnh nhiễm trùng, tăng
bạch cầu đơn nhân... Năm 1976, Hội các nhà huyết học Pháp-Anh-Mỹ đã sử dụng

19


kết quả của các phương pháp: hình thái học-nhuộm hoá học tế bào làm cơ sở để
phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp. Trong đó nhuộm hóa học tế bào dựa
trên các kỹ thuật: periodic -axit schiff, peroxidaza, esteraza đặc hiệu và không đặc
hiệu (ức chế và không ức chế), Sudan B, photphataza kiềm, axit. Năm 1986, đã bổ
sung thêm các tiêu chuẩn dấu ấn miễn dịch và di truyền để nâng cao độ chính xác
trong phân loại dòng tế bào và thể bệnh. Bảng 1.3 là một ví dụ của Asa Barnes [26]
về tổ hợp các kết quả của ba phương pháp: Hình thái học-hóa học tế bào, marker
CD, di truyền để phân loại dòng tế bào lympho và thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB
(1986).

20


Bảng 1.3. Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker và di truyền [26]
Thể
L1

Hình thái học-số lượng tế bào tủy
1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là
tế bào blast loại I:

 Hầu hết là tế bào nhỏ;

 Nhân mịn, đồng nhất, hình thoi
dẹt;

 Hạt nhân nhỏ hoặc không rõ;
 Nguyên sinh chất không có hạt ưa

Hóa học tế bào

Marker CD

Di truyền

1)

PAS dương tính 1) 1CD (+): TdT; CD (-): Smlg;
1) Early Pre B: t(4; 11)
hạt to trên một số 2) Early Pre B: (+): CD10, HLA(q21:q23).
DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, 2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
lymphoblast trong 80%
3) Pre T và T: t(1; 14)
Cylg.
trường hợp;
(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
2)
Peroxidaza, Sudan 3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLADR; (-/+): CD10; (-): CD3,5.
B, CE âm tính;
3) NE âm tính trừ tế bào 4) Pre T: (+): CD5; (-):
CD3,10,19, Cylg, HLA-DR.
non dòng lymphoxít T
5) 5) Lympho T: (+): CD3,5; (-):

có thể dương tính hạt
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.

bazơ.

21

v),
t(8;14)
(q24;q11),
t(10;14)(q24;q11), t(11;14)
(p13;q11-q13),
inv(14)
(q11;q32).


Thể
L2

Hình thái học-số lượng tế bào tủy

Hóa học tế bào

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu; 1)
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là
tế bào blast loại I:

 Tế bào to, nhỏ không đều;
 Nhân không đồng nhất;
 Có 1 hoặc nhiều hạt nhân và

thường lớn;

 Nguyên sinh chất rộng, ưa bazơ.

Marker CD

Di truyền

1) CD (+): TdT; CD (-): Smlg;
1) Early Pre B: t(4; 11)
hạt to trên một số 2) Early Pre B: (+): CD10, HLA(q21:q23).
PAS dương tính

lymphoblast trong 80%
trường hợp;

2)

Peroxidaza, Sudan

B, CE âm tính;

3)

NE âm tính trừ tế

bào
non
dòng
lymphoxit T có thể

dương tính hạt

22

DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5,
2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
Cylg.
3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLA- 3) Pre T và T: t(1; 14)
DR; (-/+): CD10; (-): CD3,5.
(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
4) Pre T: (+): CD5; (-):
v), t(8;14) (q24;q11),
CD3,10,19, Cylg, HLA-DR.

t(10;14)(q24;q11),
t(11;14)(p13;q11-q13),
inv(14)(q11;q32).


Thể
L3

Hình thái học-số lượng tế bào tủy

Hóa học tế bào

Marker CD

1) <50% SLTBT là nguyên hồng 1) PAS dương tính hạt to 1) CD (-): Smlg, TdT;
cầu;

2)





Di truyền

1) Early Pre B: t(4; 11)

trên
một
số
(q21:q23).
2) Early Pre B: (+): CD10, HLAlymphoblast
trong
≥30% tế bào có nhân trong tủy là
DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, 2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
80% trường hợp;
tế bào blast loại I:
Cylg.
3) Pre T và T: t(1; 14)
2)
Peroxidaza, Sudan B,
Tế bào to và đồng nhất;
3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLA(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
CE âm tính;
DR; (-/+): CD10;
v), t(8;14) (q24;q11),

Nhân đồng nhất, có các chấm hình
3) NE âm tính trừ tế bào
t(10;14)(q24;q11),
tròn hoặc oval;
4) (-): CD3,5.
blast dòng lymphoxit T
t(11;14)(p13;q11-q13),
Có 1 hoặc nhiều hạt nhân lớn;
5)
Pre
T:
(+):
CD5;
(-):
có thể dương tính hạt.
inv(14)(q11;q32).
CD3,10,19,
Cylg,
HLA-DR.
Bào tương vừa, bắt màu bazơ nhẹ
có các không bào.

6) Lympho T: (+): CD3,5; (-):
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.

23


Bảng 1.4. Bảng phân loại dòng tế bào theo FAB có bổ sung thêm marker và di truyền [26]
Thể

M0

Hình thái học-số lượng tế bào tủy (SLTBT)

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts
3) Không có tế bào trưởng thành dòng hạt
4) Không có hạt đặc hiệu và thể Auer trên

Hóa học tế bào

1)

Di truyền

Peroxidaza dương tính 1) CD (+): 13, 33;

trên kính hiển vi điện tử;

2)

Marker CD

Tất cả kỹ thuật nhuộm

khác đều âm tính.

2) CD dòng lympho âm
tính (-): TdT, 3, 5, 10,
19.

nguyên sinh chất tế bào.
M1

M2

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

1) ≥3% blasts (+):

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts

2) Peroxidaza, Sudan B, CE. 2) HLA-DR (+).

3) Có thể Auer trên nguyên sinh chất tế bào.

3) ≥3% blast (-): NE-NaF

3) CD (-): 14

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

1) ≥3% blasts (+):

1) CD (+): 13, 15, 33;

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;

2) Peroxidaza, Sudan B, CE. 2) HLA-DR (+).

3) 30-89% tế bào không phải dòng hồng cầu là

3) ≥3% blast (-): NE-NaF

blasts;

4) >10% SLTBT là bạch cầu hạt trưởng thành;
5) <20% SLTBT là bạch cầu monoxít;
6) Có thể Auer trên nguyên sinh chất.
24

1) CD (+): 13, 15, 33;

3) CD (-): 14

t(8;21) (q22; q22)


Thể
M3

Hình thái học-số lượng tế bào tủy (SLTBT)

Hóa học tế bào

Marker CD

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

1) ≥3% blasts (+):

1) CD (+): 13, 15, 33;

2) 30-89% tế bào không phải dòng hồng cầu là

2) Peroxidaza, Sudan B, CE.

2) HLA-DR (+).

3) ≥3% blast (-): NE-NaF

3) CD (-): 14

blasts;

Di truyền
t(15; 17) (q22; q12)

3) >10% SLTBT là bạch cầu hạt trưởng thành;
4) <20% SLTBT là bạch cầu monoxít;
5) Có nhiều thể Auer thành bó trên nguyên
sinh chất.
M4

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;

Peroxidaza, Sudan B, CE, 1) CD (+): 13, 14, 15, t(9; 11) (p22; q23)
NE-NaF dương tính
33;

2) HLA-DR (+).

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao
gồm cả blasts;

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;
5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh
chất;

6) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu
>5.109 hoặc <5.109 kèm tăng lysozym
trong huyết tương.

25