Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT
CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT
CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội – Năm 2012



LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri đã
tận tình hướng dẫn khoa học, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau Đại học của
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học đã
tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, anh chị trong Bộ môn Hóa
Phân tích- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Bộ môn Hóa Phân tích
& Độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong
quá trình học tập và làm thực nghiệm.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động
viên, khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012
Nguyễn Thị Thùy Linh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN.................................................................................3
1.1. Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV....................................................................3
1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay...................6
1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV..............................................7
1.3.1.Các phương pháp sắc ký

7

1.3.2.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE)

8

1.4. Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản...........................................9
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản.......................................9
1.4.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản...........................................10
1.4.3. Các quá trình xảy ra trong mao quản.......................................................11
1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản...12
1.4.5. Điện di mao quản vùng (CZE).................................................................12
1.4.6. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)......13
1.4.7. Phân tích định lượng theo điện di mao quản............................................23
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................24
2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................24
2.1.1. Điều kiện nghiên cứu.............................................................................24
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................25
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu...............................................................26
2.2.1. Nội dung nghiên cứu...............................................................................26
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................26
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................29
3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT...........................29
3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất ..............................................................29
3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản ................................................................31
3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu..................................................................32
3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng.........................................................33


3.1.5. Lựa chọn cơ chế tách..............................................................................34

3.1.6. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di.............................................36
3.1.7. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm.............................................39
3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS...........................39
3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm....................................................41
3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu...............................................43
3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di.............................................................45
3.1.12. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản ........................................46
3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ưu ......................................................................47
3.1.14. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập.............47
3.2. Đánh giá phương pháp phân tích........................................................................50
3.2.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống.........................................................50
3.2.2 Tính đặc hiệu............................................................................................50
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn....................................52
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).............................
3.2.5. Độ lặp lại của phương pháp....................................................................57
3.2.6. Độ đúng của phương pháp..............................................................................
3.2.7. Kết quả định lượng trong chế phẩm..............................................................
3.3. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen
(MEKC)...............................................................................................................................
3.4. Hướng phát triển của đề tài.................................................................................64
KẾT LUẬN...............................................................................................................65


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC

19

3.1

Tổng kết các điều kiện điện di tối ưu

47

3.2

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống

49

3.3

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng

52

3.4

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng

54

3.5

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng

55

3.6

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

57

Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng
3TC
Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng
AZT
Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng
NVP
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm
chuẩn 3TC
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm
chuẩn AZT
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm
chuẩn NVP

57

3.13

Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N

61

3.14

Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg &
Zidovudine 300mg

62

3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12

58
58
59
60
60


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

11

1.2

Quá trình tách các chất trong CZE

13

1.3

Cấu trúc của Mixen và dòng EOF trong MEKC

15

1.4

Cấu trúc không gian của β- cyclodextrin

20

1.5

Cấu trúc không gian của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD

21

1.6

Cấu trúc phân tử của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD

22

3.1

Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP

31

3.2

Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC

35

3.3

Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17.

37

3.4

Điện di đồ tại nồng độ SDS 25mM; 50mM và 75mM

40

3.5

Điện di đồ tại nồng độ đệm 5mM; 10mM và 20mM

42

3.6

Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s

44

3.7

Điện di đồ tại thế điện di 15kV; 20kV và 22 kV

46

3.8

Điện di đồ của 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ưu

48

Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP tại
điều kiện tối ưu
Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi
thêm 3TC tại điều kiện tối ưu
Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi

thêm AZT tại điều kiện tối ưu
Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi
thêm NVP tại điều kiện tối ưu

48

3.13

Điện di đồ mẫu trắng

51

3.14

Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP

51

3.9
3.10
3.11
3.12

49
49
49


Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP

51

Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP
thêm hỗn hợp chuẩn
Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng
độ 3TC
Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng
độ AZT
Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và
nồng độ NVP

52

3.20

Điện di đồ viên nén Avocomb-N

62

3.21

Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine
300mg

63

3.15
3.16
3.17
3.18

3.19

53
54
55


DANH MỤC VIẾT TẮT

ARV

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human
Immunodeficiency Virus)
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người
(Acquired immunodeficiency syndrome)
Thuốc kháng virut

USP

Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea)

CE

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

HIV
AIDS

CEC

Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)

CGE

Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)

CZE

Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

DAD

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

EOF

Spic

Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow)
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic
chromatography)
Diện tích pic

tm

Thời gian di chuyển (Migration times)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

HPLC
MEKC

RSD %

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

STT

Số thứ tự

AZT

Zidovudine

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantity)

NVP

Nevirapine

D4T

Stavudine

3TC

Lamivudine


MỞ ĐẦU
Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang
tiếp tục duy trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ
yếu. Một là số người nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ
tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm HIV.
Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số
người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh. Đến tháng 12/2008 ước tính
khoảng 4 triệu người nhiễm HIV ở các nước có thu nhập thấp và trung bình
được điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. Trong
vòng 4 năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết do AIDS đã
giảm 10% [12].
HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất
(Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh,...). Chúng ta không chỉ
ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong
kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống cho người HIV/AIDS. Trong điều trị
thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trước đây nước ta chưa đầy đủ các loại
thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong
điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trường
hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nước ta đã sản xuất được thuốc chống HIV là
Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn

đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chương trình quốc gia được cấp [12]
Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lượng
thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phương pháp phân tích có độ tin
cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV.
Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hóa lý
đa số được sử dụng để định lượng các loại thuốc. Ưu điểm của phương pháp này
là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã

1


được tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích
điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát
hiện của phương pháp. Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung môi
có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hưởng xấu, gây ô nhiễm môi
trường. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phương pháp định
lượng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực
hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho
nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15].
CE là phương pháp mới được phát triển, tuy nhiên có nhiều ưu điểm vượt
trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có
thể đáp ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ
cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để
thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên
cứu về Dược.
Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã được quy định trong Dược điển một
số nước như Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chưa được
ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dược phẩm còn hạn
chế. Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa
thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc ở nước ta.

Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của
phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc
bằng phương pháp điện di mao quản”.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV
Nhóm 1: thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleosides (nucleoside
reverse transcriptase inhibitors = NRTIs): Zidovudine (AZT, ZDV), Didanosine
(DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC),
Tenofovir disoproxil fumarate.
Nhóm 2: thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleosides (nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors = NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine,
Effavirenz.
Nhóm 3: là thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs): Indinavir,
Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir .
Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các
thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt
được hiệu quả điều trị cao.
Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị
Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng
retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngược của virus.
Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị
HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá
khả quan. Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân được cải thiện rõ rệt và có ý
nghĩa thống kê. Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ
1273/mm3 lên 1547/mm3), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số
lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể

khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian
sống sót của người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm 3. Liệu pháp
này cũng có thể dùng cho những người bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml
huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu
tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh [12].

3


Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của người bệnh, bệnh lý mắc kèm.
150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần
đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho người cân nặng dưới 60kg với người lớn
và thiếu niên trên 16 tuổi kể cả phụ nữ có thai, trẻ em, bệnh nhân lao và bệnh nhân
đồng nhiễm viêm gan B
* Lamivudin:

(3TC)
Công thức phân tử: C8H11N3O3S. Phân tử lượng 229,3.
Tên

khoa

học:

4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3-

oxathiolan-5-

yl]-2(1H)

pyrimidinon
Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 1600-1620C. Dễ tan trong nước, ít tan trong cồn, khó tan trong
các dung môi hữu cơ.
Năng suất quay cực: [α]21D = - 1350 ( C = 0,38 % trong methanol )
Hằng số pKa= 3,31.
Lamivudin hấp thụ UV ở bước sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A 1%1cm trong H+ 1M
~ 600 abs
Sau khi uống Lamivudin khoảng 1giờ, sinh khả dụng 80%, không bị ảnh hưởng bởi
thức ăn. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 150mg
là khoảng 1,5μg/ml.

4


*Zidovudin:

(AZT)
Công thức phân tử C10H13N5O4 . Phân tử lượng 267.242 g/mol.
Tên khoa học:
1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl)

oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-

dione
Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu.
Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C. Khó tan trong nước, ít tan trong cồn .
Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5%
trong nước)
Hằng số pKa= 9,36

Sau khi uống Zidovudin khoảng 0,5- 1giờ, sinh khả dụng 60-70%, bị ảnh hưởng
khi ăn nhiều chất béo. Đạt T max khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau
khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml.
*Nevirapin

(NVP)
Công thức phân tử C15H14N4O. Phân tử lượng 266.888 g/mol.
Tên khoa học:

5


11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6one
Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong
nước, ít tan trong CH3Cl.
Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5%
trong nước)
Hằng số pKa= 2,42.
Sau khi uống Nevirapin khoảng 4 giờ, sinh khả dụng > 90%, không bị ảnh hưởng
bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid. Đạt Tmax khoảng 4h sau khi dùng liều duy nhất.
1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 người nhiễm HIV trong đó có
62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo
tại 10 tỉnh có số người được điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số
người nhiễm HIV đang được điều trị trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí Minh tiếp
tục là thành phố dẫn đầu cả nước về số lượng người nhiễm HIV đang điều trị.
Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 người nhiễm HIV đang
điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc[10].
Tốc độ tăng trưởng bệnh nhân điều trị ARV trung bình là 950 bệnh
nhân/tháng. Phác đồ bậc 1 chiếm đa số với tỷ lệ là 96,76%, phác đồ bậc 2 là

2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác.
- Thực hiện chỉ đạo của Lãnh đạo Bộ Y tế tại Quyết định số 4139/QĐ-BYT
ngày 26/11/2011 về việc sửa đổi, bổ sung một số nội dung “Hướng dẫn chẩn
đoán và điều trị HIV/AIDS” được ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐBYT ngày 19/8/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS đã
ban hành các văn bản hướng dẫn về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa
phương với các nội dung chính như sau:
- Bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV: Phác đồ chỉ định là TDF/3TC/EFV
hoặc TDF/3TC/NVP. Không sử dụng phác đồ có Stavudin (d4T) cho các bệnh
nhân bắt đầu điều trị ARV.

6


- Đối với bệnh nhân đang điều trị ARV với phác đồ có Stavudin (d4T): thay thế
dần tiến đến loại trừ việc sử dụng thuốc d4T vào tháng 6/2013. Thuốc d4T chủ
yếu được chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT.
Hiện nay Cục Phòng, chống HIV/AIDS đang điều phối toàn bộ các nguồn
thuốc ARV do các chương trình, dự án hỗ trợ để cung cấp thuốc ARV điều trị
cho bệnh nhân trên toàn quốc. Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc nhập
khẩu các dạng bào chế mới của thuốc ARV nhằm tăng cường sự tuân thủ điều trị
ở người bệnh đặc biệt việc mua thuốc viên kết hợp 3 loại thuốc TDF/3TC/EFV
ngày uống 1 lần.[10]
Kể từ ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay
loài người đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp, tính
đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV
trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8%. Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm
mới HIV và 1,8 triệu người tử vong do AIDS. So sánh với năm 1999, số người
nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận tính cuối năm 2009
đã có 33 nước có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước khu vực cận Saharan,
Châu Phi. Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so

sánh giữa năm 1999 và 2009[11].
1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV
1.3.1. Các phương pháp sắc ký (HPLC & HPTLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách
pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại mẫu khác
nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy,
độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi
rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở
rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với

7


phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể
phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là
20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril
(04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18-ODS
Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm). Thời gian lưu của mỗi chất là Stavudine là 2,85
phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26]
Xác định bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha
động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F 254 và
định lượng các chất ở bước song hấp thụ 265nm. Hệ số lưu giữ của Stavudine,
Lamivudine và Nevirapine lần lượt là 0.21-0.27, 0.62-0.72 và 0.82-0.93.[26]
Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với
metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng
cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước :

axetolnitril (20:80,v/v). Các ion được tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực.
[21]
1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng
dụng để tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương
pháp MEKC. Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài
hiệu dụng 62cm), đường kính trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM
sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2propanol. Áp thế 20kV.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s. Tất cả các chất
được tách ra trong vòng 14 phút. Khoảng tuyến tính 20-200 µg/ml (r 2= 0,9996) cho
3TC; 5-50 µg/ml (r2= 0,9985) cho d4T và 25-250 µg/ml (r2= 0,9987) cho NVP[24]
Nhóm nghiên cứu đã tách được lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân
giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường

8


kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 25 0C,
điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm… Về định lượng lamivudin trong chế
phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) và sự hiện diện của chất
hoạt động bề mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể phân tích đồng thời
lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột mao
quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu
quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm, dung
dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9]
Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách và định lượng đồng
thời lamivudine và zidovudine trong dược phẩm đã được phát triển. Các yếu tố ảnh
hưởng đến sự tách, chẳng hạn như pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium
dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện áp áp dụng đã được tối ưu

hóa. Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium và 15
mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile
(ACN) đã được khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc. p-aminobenzoic
acid (PABA) đã được sử dụng như là chất chuẩn nội (IS). Phát hiện chất phân tích
và IS được thực hiện ở bước sóng 210 nm. Điện di đồ đã được quan sát thấy rằng cả
hai loại thuốc và IS đã được di chuyển trong vòng 20 phút ở điện áp 10 kV. Đánh
giá của phương pháp này đã được thực hiện về tính chính xác, độ tuyến tính, độ
đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ). Khoảng tuyến tính từ 10-80
mg / ml cho Lamivudine và 10-100 mg / ml cho Zidovudine. Các giới hạn phát hiện
cho Lamivudine và Zidovudine được tìm thấy là 2,5 và 2,0 mg / ml, tương
ứng. Phương pháp đã được áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và
Zidovudine trong huyết tương. Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên
thuốc và trong huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và
≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25]
1.4. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản

9


Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản
(đường kính 25 - 100 µm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm
pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi
một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là
CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều
khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu
và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng N ef lớn, sự tách
các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao.
Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao
quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng

của lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng)
của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào
điện tích và kích thước của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm
thấu, hay dòng điện thẩm).
1.4.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản
Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy
phải có các bộ phận chính như sau:
1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt).
2. Cột tách (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),
3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển
quá trình điện di của các chất.
4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách).
5. Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector).
6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản.
7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu.
Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 2.1

10


Hình 1.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản
1.4.3 . Các quá trình xảy ra trong mao quản
Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V
đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là:
1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản.
2. Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 µA).
3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu EOF.
4. Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản.
5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển.
6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật

hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC).
7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên.
8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh.
9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử
trung tính) trong mao quản. Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất.
Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có
thể làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất.
Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 quá
trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá
trình khác (1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế,

11


muốn có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá
trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải
tối ứu hoá các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác
định, để có được hiệu quả tách cao.
1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản
Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh
và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di)
xẩy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các
kiểu (Mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân
biệt và sử dụng chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là:
1. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)
2. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary
Electro-Kenetic:MEK hay MCEK).
3. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel
Electrophoresis: Gel-CE),
4. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF).

5. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP).
1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE)
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophiresis- CZE) là phương pháp
phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE vì đơn giản, linh hoạt và dễ thao tác. Phương
pháp này có phạm vi ứng dụng rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất
khác nhau, bao gồm các amino acid, peptid, các hợp chất cấu tạo ion, các hợp chất
đồng phân không gian và nhiều loại hợp chất có khả năng ionic hóa [8].
Đây là phương pháp tách dựa trên sự di chuyển của chất tan có điện tích trong
điện trường với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào độ linh động điện di của chúng. Độ
linh động điện di là đại lượng phụ thuộc vào điện tích ion, chính xác hơn là tỷ lệ
giữa điện tích và khối lượng của ion, bán kính của ion, trạng thái của ion như mức
độ ion hóa, trạng thái liên kết với các đối ion. Do đó độ linh động điện di phụ thuộc
vào hằng số điện môi, pH, độ nhớt của dung dịch... Khi ta đặt một điện áp cao vào

12


hai đầu mao quản, các tiểu phân tích điện sẽ bắt đầu di chuyển, tất nhiên là về phía
điện cực trái dấu. Các ion có độ linh động cao hơn sẽ di chuyển nhanh hơn, hình
thành các vùng mà ở từng vùng, các ion tại đó có độ linh động điện di tương tự
nhau. Mặt khác khi đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, ở một vùng pH
đủ lớn, sẽ hình thành một dòng điện thẩm.

Hình 1.2 : Quá trình tách các chất trong CZE
Trong mao quản silica dòng này hướng về phía cực âm (catod). Do các ion
dương có cùng hướng với dòng này cho nên tốc độ được tăng thêm, các ion âm do
không cùng hướng với dòng điện di thẩm thấu cho nên di chuyển chậm lại và nếu
không vượt được nó thì cũng bị cuốn đi về phía cực âm. Các phân tử không tích
điện sẽ di chuyển cùng tốc độ với dòng điện thẩm.
CZE là mô hình phân tích đơn giản nhất của CE. Hệ thống phân tích CZE

cũng chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác. Từ xuất phát điểm là một
mao quản với một dung dịch điện ly nền nhất định, người sử dụng chỉ cần thêm vào
một hay nhiều chất phụ gia thích hợp là có thể chuyển sang các kỹ thuật điện di
khác. Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào thì sẽ có nhiều kỹ thuật khác nhau.
1.4.6. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) [8,15]
Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết
ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử
dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis)
và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation

13


mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược. Nó là
một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho
việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết
ion). Vì thế nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.
Nguyên lý tách của phương pháp giống như sắc ký nhưng phương pháp MEKC sử
dụng hiện tượng điện động học để thực hiện quá trình phân bố chất phân tích.
MEKC sử dụng điện áp cao tạo ra dòng EOF mang chất phân tích di chuyển dọc
mao quản và phân bố vào các mixen. Sự khác nhau về linh độ điện di của các chất
phân bố trong và ngoài mixen và linh độ của dòng điện thẩm là bản chất của quá
trình tách.. Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC được
điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện di. Khi chất
hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình
thành Mixen, CMC: Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt
SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9 mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu
phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành (hay tạo ra)
trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS. Nó chính là các Mixen (pha
tĩnh giả). Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nước của chất hoạt động bề mặt,

định hướng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu ưa nước của nó ra ngoài và sẽ
tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Nghĩa là đầu mang điện tích của chất
hoạt động bề mặt sẽ hướng ra chất đệm. Cấu trúc tiêu biểu của Mixen được mô tả
trong hình 2.3. Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh. Các phân tử của chất
mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong
pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố K i xác định, trong
những điều kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan X i sẽ có
một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó. Nếu các Ki của các chất tan là
khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt.
Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có
điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là
cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất

14


hoạt động bề mặt và cấu trúc của Mixen . Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ
như SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của
dòng EOF. Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di
chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen
là theo hướng của dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương
tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng
rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để
tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình
điện di.

Hình 1.3. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC
: dòng EOF. O: Chất hoạt động bề mặt. ': Chất tan (chất PT).⇒ : Dòng điện di của
chất.
Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào

trong Mixen và ở ngoài Mixen theo một cân bằng động học có hằng số phân bố K i
nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng động học
này gây ra sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất
phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách
này được gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó tồn
tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các
chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF.

15