Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập tại rừng quốc gia hoàng liên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------


Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRỊNH THÀNH TRUNG

Hà Nội - Năm 2013
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Thành Trung,
người đã dẫn dắt, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn cao
học này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi
sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong
quá trình hoàn thành luận văn.


Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học
nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên,
giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Học viên

Phan Lạc Dũng

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

3

1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens

3

1.1.2. Lịch sử phát hiện

4

1.1.3. Phân loại

5

1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên

5

1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

5

1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp

5

1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh

6

1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh

6

1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics

7

1.3. MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG

7

1.3.1. Xylanase

7

1.3.2. α-amylase

10

1.3.3. Protease

13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG

15

2.2. NGUYÊN LIỆU

15

2.2.1. Chủng vi sinh vật

15

2.2.2. Môi trường

15

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16

2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động

16

2.3.2. Phân tích trình tự đa gen

16

2.3.3. Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu

18

2.3.4. Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng
sinh enzyme ngoại bào cao
20
2.3.5. Phương pháp xác định protein

21

2.3.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào

21

2.3.7. Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào

25

2.3.8. Xác định đặc tính enzyme ngoại bào

27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

28
28

3.1.1. Tuyển chọn chủng

28

3.1.2. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA

28

3.1.3. Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen

29


3.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901

30

3.2.1. Đặc điểm hình thái

30

3.2.2. Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901

31

3.3. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO

38

3.3.1. Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp

38

3.3.2. Tinh sạch enzyme ngoại bào bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 41
3.3.3. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel

43

3.3.4. Xác định trọng lượng phân tử xylanase bằng điện di SDS-PAGE

44

3.3.5. Hiệu quả tinh sạch xylanase từ chủng SP 1901

45

3.4. ĐẶC TÍNH ENZYME

46

3.4.1. Nhiệt độ tối ưu

46

3.4.2. Khả năng bền nhiệt

47

3.4.3. pH tối ưu

48

3.4.4. Khả năng bền axít

49

3.4.5. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất

50

3.4.6. Sắc ký lớp mỏng

51

KẾT LUẬN

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác nhau.

33

Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại đường………………………………….

34

Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đường…………………………………...

35

Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit API
ZYM………………………………….……………………………………

37

Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) của
chủng SP 1901………………………………….………………………………

40

Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bước tinh sạch………………………

46


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống
enzyme xylanolytic………………………………….…………………………
8
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin…………………….

11

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide………

13


Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA……………………………….

21

Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose……………………………..

22

Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose…………………………….

23

Hình 2.4. Đồ thị đường chuẩn theo thang L-tyrosine…………………………

24

Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại
rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa trên
phân tích trình tự 16S rDNA………………………………….…………..
28
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B.
subtilis………………………………….……………………………………..
30
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm

gram (b) và soi nổi (c) ………………………………….…………………….
31
Hình 3.4. pH sinh trưởng tối ưu (a). Khả năng chịu muối NaCl (b). Khả năng
chịu dịch dạ dày (c). Khả năng chịu muối mật (d) ……………………………
31
Hình 3.5. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP 1901
sau 24, 48 và 72 giờ………………………………….………………………
32
Hình 3.6. Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ
(a). Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trưởng của cây ngô sau 10
ngày trồng (b) ………………………………….…………………………
32
Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a).
Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ………………………
36
Hình 3.8. Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API
ZYM………………………………….………………………………………
37
Hình 3.9. Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phương pháp
khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E. coli (a). Vi khuẩn Shigella
sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ………………………………………
38
Hình 3.10. Khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau (a, b) và hoạt
độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 loại môi
trường ở các giờ khác nhau………………………………….……………….
39
Hình 3.11. Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi nuôi cấy
trên môi trường có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể tại các
giờ khác nhau………………………………….…………………………
39

Hình 3.12. Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trường
có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể……………………
40


Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
41
Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….…………
42
Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
42
Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

43

Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

44

Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………

44

Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36……………………

45

Hình 3.20. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ
chủng SP 1901……………………………………………………………
46
Hình 3.21. Khả năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng
SP 1901………………………………………………………………
47
Hình 3.22. pH hoạt động tối ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ
chủng SP 1901………………………………………………………………
48
Hình 3.23. Khả năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng
SP 1901………………………………………………………………
49
Hình 3.24. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36, amylase
và protease từ chủng SP 1901…………………………………………………
50
Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ cơ
chất xylan bởi xylanase của chủng SP 1901……………………………………
52

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BSA

Bovine serum albumin

CMC

Carboxymethyl cellulose

DNA

Deoxyribonucleic axít

DNS

Dinitrosalicylic

IAA

Indole-3-acetic axít

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic axít

SDS

Sodium dodecyl sulfate


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở
nên rất phổ biến. Con người đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh
vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con người
đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm như vacxin, kháng sinh, hormone,
vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con người. Trong nông
nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã được sản xuất để
diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong công nghiệp thực phẩm,
con người đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế
phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngoài ra, vi sinh vật
còn được ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nước thải trong sản xuất công
nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật
đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện
chất lượng cuộc sống của con người.
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả
trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19.
Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh
nội bào tử. Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến
dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dương. Ngoài
các loài vi khuẩn gây bệnh cho con người như B. anthracis và B. cereus, nhiều loài
vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có tính ứng dụng cao trong
nhiều lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và xử lý môi
trường. Do đó, các loài thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi
sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng.
Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng
dụng của các loài thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi
khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng
Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau:
(i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng
Quốc gia Hoàng Liên.

(ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng
vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài.


(iii)
Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn được lựa
chọn.
(iv)
Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của
chủng vi khuẩn nghiên cứu.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.

VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

1.

Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis
[45]. B. subtilis được Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên
của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Năm 1872, nhà sinh học
người Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis.
Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để phòng
bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi. Từ đó đến nay, B. subtilis đã được
nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới. Thuật ngữ “Subtilis therapy” (điều trị
bằng subtilis) ra đời từ đó và B. subtilis ngày càng được sử dụng rộng rãi để phòng
ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột,

viêm đại tràng và tiêu chảy. Hiện nay, B. subtilis đã được chứng minh có tiềm năng
to lớn trong nhiều lĩnh như chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường [8].
Vi khuẩn B. subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trường tự nhiên. Phần lớn
cư trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Ngoài ra,
chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì B.
subtilis chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực phẩm như
mắm, tương và chao [12].
B. subtilis có vai trò to lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh vật đường ruột
bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác
do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó. Công trình nghiên cứu của
Work và cộng sự năm 1959 đã cho thấy B. subtilis có hệ thống enzyme tương đối
hoàn chỉnh, có khả năng thủy phân carbohydrate và protein. Ngoài ra, B. subtilis
còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh như bacitracin, bacilysin,
bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin. Những chất này có
tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác. Chúng tác dụng
lên cả vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm gây bệnh [9].
Nhóm B. subtilis gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B. amyloliquefaciens, B.
atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis, B. sonorensis, B.
tequilensis, B. vallismortis và B. velezensis. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S
rRNA cho thấy mức độ tương đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Bên cạnh đó,


phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào
và bào tử cũng như các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài
này. Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ chung là
nhóm vi khuẩn B. subtilis [45].
Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học
đã sử dụng phương pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến
cấp độ loài và dưới loài [25]. Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phương pháp
phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong

nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như B. subtilis được phân thành B.
subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp.
inaquosorum; B. amyloliquefaciens được phân thành B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42].
Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens
nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại. Hiện
nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một
loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dưới loài dựa trên việc
phân tích trình tự đa gen.
2.

Lịch sử phát hiện

B. amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng
sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chưa được xếp loại
trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ
luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B. amyloliquefaciens mới được công
bố [43].
Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác của B. subtilis hay
loài phụ B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều
đặc điểm tương đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng
các phương pháp phân loại thông thường rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm
1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả
lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B.
pumilus [43].
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh
thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã được công bố. Năm 2010, Borriss và
cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng
kỹ thuật microarray, tính tương đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt

tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm B. amyloliquefaciens DSM7 không
có khả năng và một nhóm B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng
sinh rễ cây thực vật. Dựa vào kết quả thu được, Borriss đã đề xuất tách B.
amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B. amyloliquefaciens subsp. plantarum
(có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) và B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens (không có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) [23].
3.
Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974) [24], B. amyloliquefaciens thuộc:

4.

Giới:

Bacteria

Ngành :

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Chi:

Bacillus

Nhóm:

Bacillus subtilis

Loài:

Bacillus amyloliquefaciens

Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên

B. amyloliquefaciens thường có mặt trong các mẫu đất tự nhiên. Đây là loài
vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, sinh nội bào tử, có khả năng di động và
kích thước tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm. Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23].
2.

ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

5.

Sản xuất enzyme công nghiệp

Loài vi khuẩn này được biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại

enzyme ngoại bào đa dạng. Từ những năm 1943, B. amyloliquefaciens đã được sử
dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là α-amylase và protease [43]. Enzyme
từ B. amyloliquefaciens như amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có
nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền
nhiệt. Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã được ứng dụng nhiều trong công
nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp
sản xuất chất tẩy rửa [21].


Bên cạnh đó, nhóm B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật
có khả năng sinh phytase đã được công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã
được biểu hiện thành công trên chủng B. subtilis MU331 [31]. Phytase là enzyme
phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo-inositol và các
dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật. Vì vậy, phytase đã
được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho
nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường do hàm lượng
phosphate dư thừa thải ra môi trường nước [29].
6.

Sản xuất chất kháng sinh

Các loài thuộc nhóm B. subtilis đã được biết đến nhờ khả năng sinh các chất
kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi
bậc hai khác như chất kháng virus, chất kháng ung thư và chất ức chế miễn dịch
[47]. Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide được tổng hợp qua
ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ kháng khuẩn
hẹp và thường ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất kháng sinh có bản
chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã được công bố từ loài B.
amyloliquefaciens như bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và
bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38].

Bacylicin là chất dipeptide được tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm Lanticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh
cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động như chất tẩy rửa trên màng tế bào. Chất
này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và
bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu
gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả
năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22]. Difficin là chất kháng
sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế
Erwinia amylovora. Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào
prokaryotes. Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dương.
7.

Sản xuất phân bón vi sinh

Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật
có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng Indole-3-acetic axít (IAA). Chất này sẽ
tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật như quang hướng động,
địa hướng động, ưu thế chồi ngọn và sự tượng rễ. Yao và cộng sự (2012) đã thử
nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB24 lên cây bông.


Kết quả cho thấy, sản lượng bông thu hoạch được tăng 30% so với đối chứng bổ
sung đạm NPK [56]. Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả đã thử khả
năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít của chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm. Kết quả cho thấy, trọng lượng tươi của bèo
tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng. Loài vi khuẩn B.
amyloliquefaciens đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân
bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trưởng
thực vật [31].
8.

Sản xuất chế phẩm probiotics

B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as
safe; GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống
nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột, qua đó ngăn ngừa và phòng chống các bệnh
tiêu chảy thường gặp. Ngoài ra, vi sinh vật trong probiotics còn tăng cường khả
năng chuyển hóa lactose, điều hòa hệ thống miễn dịch và tăng cường sức khỏe con
người [48] [49]. Nhiều bằng chứng cho thấy B. amyloliquefaciens đã được sử dụng
trong chế phẩm probiotics [53].
1.
3.

MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG

9.

Xylanase

1.3.1.1. Cấu trúc xylan
Xylan là thành phần chính của hemicellulose và là polysaccharide phổ biến
thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Chúng được tìm thấy trong thành tế bào
thực vật [50].
Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic giữa đường xylopyranose với
acetyl, arabinosyl và glucuronisyl [39].


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme
xylanolytic [34].
Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl được nối với nhau bằng liên

kết β-1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các
monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3. Thông thường, xylan chiếm
khoảng 15-30% trọng lượng khô của cây hạt kín và khoảng 7-15% của cây hạt trần.
Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng khô của chúng
[35].
Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có
hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tương
hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đường [34].
1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase
Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi
khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57].
Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng
chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn
trong công nghiệp [39].
1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase
Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10]. Sự
thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống
enzyme xylanolytic (hình 1.1.).

Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể như


sau:
• β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase
Enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò
chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan. Trong đó, β -1,4-endoxylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase tấn
công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide. Hai
enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh
ra, chẳng hạn như các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum,

Bacillus, Clostridium và Streptomyces [55].
Ferulic axít esterase là enzyme ngoại bào exoglycosidase thủy phân các
oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose [57]. Trong số các cơ chất,
xylobiose thường là cơ chất tốt nhất [39]. Hầu hết các ferulic axít esterase được
nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế ngược bởi xylose, một sản phẩm thủy phân
của chúng.
• α-L-Arabinofuranosidase
α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3 và 1,5-αL-arabinofuranosyl trong arabinoxylan giải phóng arabinose. Khi giải phóng
arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra
xylooligosaccharide [55].
• α-D-Glucuronidase
α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axít glucuronic và gốc
xylose trong phân tử glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác
nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme [39].
• Acetyl xylan esterase
Acetyl xylan esterase là enzyme có thể cắt đứt liên kết giữa các nhóm acetyl
với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự
nhiên [34]. Enzyme này thường được sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm.
1.3.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase
Xylanase được ứng dụng trong sản xuất nước hoa quả và làm trong rượu.
Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 6070oC) nên có thể ngăn chặn được sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nước hoa quả ở


nhiệt độ cao [27].
Xylanase còn được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như trong công
nghệ sản xuất bánh nướng, hỗ trợ quá trình đường hóa lignocellulose (một
polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật). Xylanase còn được sử
dụng để loại lignin khỏi bột giấy.
Trong công nghiệp sản xuất giấy và vải sợi, xylanase tham gia vào quá trình
tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng. Xylanase

giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11].
Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức
ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm
sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô
nhiễm môi trường.
10.

α-amylase

1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen
Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm
carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt như khoai
lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau
đều có cấu tạo từ 20-30% amylose và 70-80% amylopectin.
Amylose được cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên
kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin được
cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và
α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14].
Glycogen được ví như tinh bột của động vật. Glycogen có cấu tạo giống với
tinh bột nhưng mức độ phân nhánh mạnh hơn. Cấu tạo của chúng gồm các phân tử
glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside. Ở các vị trí phân nhánh glucose
nối với nhau băng liên kết α-1,4-glucoside. Glycogen có ở động vật và người,
chúng tập trung chủ yếu ở gan.
1.3.2.2. Nguồn sản sinh α-amylase
Amylase là hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Vi khuẩn và nấm sợi là
những nhóm sinh amylase chính. Amylase của vi khuẩn có ưu điểm chịu nhiệt tốt
hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 85-95oC [34].

Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Có 6 loại amylase được xếp
vào 2 nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase gồm α-amylase và nhóm
enzyme khử nhánh. Exoamylasse gồm có β-amylase và glucoamylase.
1.3.2.3. Đặc tính hoạt động của α-amylase
Đây là một enzyme kim loại, nếu không có sự hiện diện của ion canxi trong
phân tử enzyme thì chúng sẽ không hoạt động được. α-amylase có khả năng phân
cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu


nhiên không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà
chúng còn có khả năng thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy.
Quá trình thủy phân tinh bột bở α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai
đoạn: dextrin hóa  đường hóa  phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen
 sản phẩm thủy phân gồm maltotetrose, maltotriose và maltose.
Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh
bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị
thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất
này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose.
Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose.
Sau phản ứng, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87%
maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì
không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đường
nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose [1].

1.3.2.4. Ứng dụng của α-amylase
Với khả năng thủy phân tinh bột nên α-amylase đã được con người sử dụng
từ rất sớm. Trong công nghiệp thực phẩm, người ta thường bổ sung α-amylase vào
bột chế biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo. Hoạt động của α-amylase sẽ làm
tăng lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa
khử. Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị và màu hấp dẫn [2].
Cả α-amylase và β-amylase đều được sử dụng trong sản xuất bánh mì. Các
loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường, nhờ đó nấm men
Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO 2, làm
tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2].
Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thường sử dụng α-amylase có trong
mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có sẵn trong đó. Cồn công nghiệp được sản


xuất bằng phương pháp lên men. Cồn được lên men từ nguyên liệu chứa đường
hoặc từ nguyên liệu chứa carbohydrate. Trong đó, α-amylase đóng vai trò chuyển
hóa tinh bột để tạo thành dextrin [15].
11.
Protease
Protease là nhóm các enzyme có khả năng phân giải các liên kết peptide
trong phân tử protein tạo thành các đơn vị nhỏ như các đoạn peptide hay các phân
tử amino axít [5].

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide [34].
1.3.3.1. Nguồn sản sinh protease
Protease được sản xuất chủ yếu từ 3 nguồn chính là động vật, thực vật và vi
sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và là nguồn
nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [16]. Ngày
nay, hướng sản xuất enzyme từ vi sinh vật đang dần thay thế enzyme từ động vật và
thực vật bởi: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme được tách chiết từ vi

sinh vật có hoạt tính cao và vi sinh vật là giới sinh vật phù hợp cho sản xuất theo
quy mô công nghiệp. Các đối tượng vi sinh vật thường được dùng để tách chiết
protease là nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn.
1.3.3.2. Phân loại protease
Protease được xếp vào nhóm enzyme thủy phân. Tuy nhiên, do sự đa dạng
về đặc tính hoạt động và cấu trúc nên protease còn được phân loại theo nhiều cách
khác nhau dựa vào pH hoạt động tối ưu hay vị trí hoạt động trong tế bào [51].
• Dựa vào pH hoạt động tối ưu: protease được phân thành protease axít,
protease trung tính và protease kiềm tương ứng với pH tối ưu < 7, = 7 và >7.
• Dựa vào vị trí phân bố trong tế bào : protease bao gồm protease nội bào và
ngoại bào (enzyme được tiết ra bên ngoài tế bào). Trong giới hạn luận văn
này chúng tôi tập trung nghiên cứu các protease ngoại bào.
• Theo vị trí xúc tác: protease được chia thành hai nhóm: exopeptidase và
endopeptidase. Exopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt từ hai


đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Endopeptidase là những enzyme có khả
năng phân cắt liên kết peptid nằm phía trong phân tử protein [44].
1.3.3.3. Ứng dụng của protease
Trong công nghiệp chế biến thủy sản, đồ hộp và đồ đông lạnh, protease được
dùng làm mềm thịt nhờ khả năng thủy phân một phần protein có trong thịt. Hoàn
toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân [3].
Trong công nghệ chế biến sữa, protease tham gia vào quá trình thủy phân
protein trong sữa tạo thành các sản phẩm như pepton, axít amin. Protease có mặt tự
nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ
76-78oC. Trương Thị Hòa và cộng sự (1994) đã thử nghiệm sử dụng protease được
tách chiết từ Aspergillus oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều
kiện xử lý bia tốt hơn [7].
Trong công nghiệp thuộc da, trước khi bị xử lý da thường bị cứng do có
nhiều collagen. Protease được sử dụng làm mềm da nhờ khả năng thủy phân

collagen. Quá trình đó đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm
dẻo nhất định.
Ngoài ra, protease còn được phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme
được bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG
Các thiết bị và máy móc của bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi
Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
• Máy đọc trình tự ADN 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, Mỹ).
• Máy khuếch đại gen Gene Amp PCR System 9700 (Eppendorf,
Mỹ).
• Máy ly tâm lạnh Centrifuge C30P (Satorius Group, Đức).
• Máy đo quang phổ UV 1600(Thermo, Mỹ).
• Máy lắc ổn nhiệt (B.Braun, Mỹ).
• Kính hiển vi (Olympus, Nhật).
• Máy ly tâm 6K15 (Sigma, Đức).
• Máy ly tâm Centrifuge 5417R (Eppendorf, Đức).
• Bộ chạy điện di đứng cho protein (Biorad, Mỹ).
• Máy lọc tiếp tuyến 17525-001 (Sartorius Stedim, Mỹ).
2.

NGUYÊN LIỆU

1.

Chủng vi sinh vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ vi sinh vật được phân lập tại
rừng Quốc gia Hoàng Liên và các ruộng canh tác nông nghiệp lân cận [13].
2.

Môi trường
• Môi trường hoạt hóa: Môi trường NA (g/l): pepton-5; cao thịt-3; thạch-16.
• Môi trường nuôi giống khởi động: Môi trường NA dịch thể (như môi trường
NA nhưng không có thạch).
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường khoáng (g/l): CaCl2-0,5; NH4NO3-5;
KCl-0,5;

MgSO4.7H2O-0,25;

FeSO4.7H2O-0,01;

MnSO4.H2O-0,01;

KH2PO4-1 [33] có bổ sung một trong số các nguồn carbon: D-glucose, tinh
bột tan, casein, CMC, xylan, chitin, tributyrin và pectin.


3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.

Nuôi cấy giống khởi động
Để nuôi cấy khởi động chủng giống, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy qua

đêm trên môi trường NA dịch thể ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
4.

Phân tích trình tự đa gen

2.3.2.1. Tách chiết DNA của vi khuẩn
Phương pháp tách chiết DNA của vi khuẩn được thực hiện theo Sakiyama và
cộng sự (2009) [46]. Vi khuẩn đuợc nuôi trên môi trường dịch thể với thời gian
thích hợp. Sau đó hút 1,5 ml dịch vào ống eppendorf và ly tâm ở 15.000 v/p trong
15 phút để lấy sinh khối tế bào. Hòa sinh khối tế bào trong 100 µl TAE. Thêm 0,4
mg lysozyme rồi trộn đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Thêm 100 µl SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút, ủ ở 37oC trong 30 phút.
Thêm một thể tích tương đương phenol : chloroform : isoamyl alcohol, trộn đều. Ly
tâm 15.000 v/p trong 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendorf khác.
Bổ sung 8 µl RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. Thêm 12 µl
proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ ở 56 oC trong 15 phút. Tiếp tục thêm 1/10 thể
tích natri acetate 3M và 1 ml ethanol 100% rồi trộn đều. Đặt hỗn hợp trong đá 30
phút.
Ly tâm hỗn hợp 15.000 v/p trong 15 phút. Hút bỏ lớp dịch trên, rửa phần tủa
bằng ethanol 70%. Làm khô phần tủa bằng máy cô quay chân không. Hoà tan tủa
trong 50-100 µl nước MQ hoặc đệm TAE.
2.3.2.2. Phản ứng khuếch đại DNA
Thành phần phản ứng khuếch đại DNA bao gồm 10 µl đệm PCR 10x, 10 µl
dNTP 2 mM, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngược, 2 µl tag polymerase, 1-2 µl DNA
khuôn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 25 µl.
Trình tự cặp mồi đã sử dụng (xem phụ lục B).
Chu trình nhiệt của của phản ứng này bao gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3
bước: (i) gây biến tính DNA bằng cách đun hỗn hợp ở 95 oC trong 30 giây, (ii) sau