Nghiên cứu ứng dụng bộ kit prepfiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định AND tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Xn Tồn

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH
CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC
GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Xn Tồn

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH
CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC
GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN HÀ

PGS.TS. BÙI PHƢƠNG THUẬN

Hà Nội - 2015


Lời cảm ơn
Để hoàn thành bản luâ ̣n văn này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơ

n sâu sắ c tới Đại

tá, PGS.TS. Nguyễn Văn Hà (Phó giám đốc Trung tâm giám định Sinh học Pháp lý
- Viê ̣n Khoa ho ̣c hình sự - Bô ̣ Công an ) và PGS .TS. Bùi Phương Thuận (Trường
Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội ) đã rấ t tâ ̣n tì nh hướng dẫn
tôi trong suố t quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luâ ̣n văn này .
Tôi xin chân thành cảm ơn Lañ h đa ̣o Viện Khoa học hình sự

, Lãnh đạo

Trung Tâm và các đồng nghiệp trong Trung tâm giám đinh
̣ Sinh ho ̣c Pháp lý - Viê ̣n
Khoa ho ̣c hình sự - Bơ ̣ Cơng an đã đơ ̣ng viên , giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình
làm luận văn.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầ y cô giáo thuô ̣c khoa Sinh học

,

trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tâ ̣n tin
̀ h truyề n đa ̣t kiế n thức và giú p đỡ tôi
trong suố t quá triǹ h ho ̣c tâ ̣p.
Cuố i cùng tôi xin bày tỏ lòng biế t ơn đế n gia đình và ba ̣n bè , đã đô ̣ng viên ,

góp ý và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu .
Hà Nợi, ngày tháng

năm 2015

Học viên

Lê Xn Tồn


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của r iêng tôi.
Các số liệu, kế t quả nêu trong luâ ̣n văn là trung thực và chưa từng đươ ̣c ai công
bố trong bấ t cứ công triǹ h nào khác .
Tác giả

Lê Xuân Toàn


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................6
1. Sự cần thiết của việc nghiên cứu đề tài....................................................................6
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................................7
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..............................................................................................9
1.1. Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự ...............................9
1.1.1. Lịch sử giám định ADN trong khoa học hình sự ...........................................9

1.1.2. Giám định ADN ...........................................................................................10
1.2. Các kỹ thuật tách chiết ADN ...........................................................................14
1.2.1. Phương pháp tách chiết hữu cơ (phương pháp tách chiết bằng phenol/
chloroform/ Isoamyl Alcohol)................................................................................14
1.2.2. Phương pháp tách chiết bằng chelex ..........................................................14
1.2.3. Phương pháp tách chiết bằng cột silica ......................................................15
1.2.4. Phương pháp tách chiết bằng bộ kit PrepFiler® ........................................16
1.3. Cấu tạo xƣơng, răng ngƣời và cơ sở để phân tích ADN xƣơng, răng .........19
1.3.1. Cấu tạo bợ xương người ..............................................................................19
1.3.2. Phân tích ADN từ xương người ...................................................................21
1.3.3. Cơ sở để sử dụng bợ kit PrepFiler® trong việc tách chiết ADN từ hài cốt
để phục vụ giám định ADN trong khoa học hình sự .............................................25
1.4. Các bộ kit khác có thể sử dụng để tách chiết ADN từ mẫu răng, xƣơng ....25
1.4.1. QIAamp Investigator DNA Kit ....................................................................25
1.4.2. PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit ..........................................26
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................27
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................27
2.2. Dụng cụ và hố chất thí nghiệm ......................................................................30
2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm .....................................................................................30
2.2.2. Hóa chất thí nghiệm ....................................................................................31
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................31

1


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

2.3.1. Phương pháp làm sạch mẫu ........................................................................31

2.3.2. Phương pháp nghiền mẫu............................................................................32
2.3.3. Phương pháp tách chiết ADN bằng bợ kit PrepFiler® ...............................32
2.3.4. Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết ..................................................39
2.3.5. Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR ....................40
2.3.6. Điện di và phân tích kết quả ........................................................................41
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................43
3.1. Kết quả định lƣợng sản phẩm ADN sau tách chiết .......................................43
3.2. Kết quả điện di đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian dƣới 2 năm ..46
3.2.1. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 1....................................................46
3.2.2. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 2....................................................48
3.2.3. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 3....................................................49
3.2.4. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 4....................................................50
3.2.5. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 5....................................................51
3.2.6. Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời
gian dưới 02 năm ...................................................................................................52
3.3. Kết quả tách chiết đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian từ 02 - 10
năm: ..........................................................................................................................53
3.3.1. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 6....................................................53
3.3.2. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 7....................................................54
3.3.3. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 8....................................................56
3.3.4. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 9....................................................58
3.3.5. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 10..................................................59
3.3.6. Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời
gian từ 02 đến 10 năm ...........................................................................................60
3.4. So sánh kết quả phân tích ADN ở các mẫu hài cốt .......................................62
3.5. Quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler® .66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................73

2

Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh kiểu gen của 03 người nghi có quan hê ̣ cha con
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm đối với nhóm hài cốt có thời gian dưới 02 năm
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đối với nhóm hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm
Bảng 2.3. Nồng độ mẫu chứng khi Realtime PCR
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng bộ kit Identifiler
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt được sử dụng cho phản ứng PCR
Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng bộ kit Identifiler
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt được sử dụng cho phản ứng PCR
Bảng 2.8. Thành phần của hỗn hợp điện di trên máy ABI 3130
Bảng 3.1. Kết quả định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 5 đối với
các mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm
Bảng 3.2. Kết quả định lượng ADN tổng số từ thì nghiệm 6 đến thí nghiệm 10 đối với
các mẫu hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm
Bảng 3.3. So sánh kiểu gen của mẫu R1, X1, R2, X2 với mẫu so sánh tương ứng
Bảng 3.4. So sánh kiểu gen của mẫu R3, X3, R4, X4 với mẫu so sánh tương ứng
Bảng 3.5. So sánh kiểu gen của mẫu R5, X5, R6, X6 với mẫu so sánh tương ứng
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh phân tích kết quả điện di bằng phần mềm GeneMapper ID v.3.2
Hình 1.2. Bơ ̣ kit PrepFiler®
Hình 1.3. Tỉ lệ thành cơng khi phân tích ADN ti thể tại các vị trí xương khác nhau trên
cơ thể người
Hình 1.4. Cấu tạo xương dài

3


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xn Tồn

Hình 1.5. Cấu tạo răng hàm
Hình 2.1. Mẫu răng, xương có thời gian dưới 02 năm
Hình 2.2. Mẫu răng, xương có thời gian từ 02 - 10 năm
Hình 2.3. Ảnh kết quả Realtime PCR trên máy Eco™ Real-Time PCR System
(hãng Illumina – Mỹ)
Hình 3.1. So sánh kết quả định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 4
đối với mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm (răng số 1 và xương số 1)
Hình 3.2. So sánh kết quả định lượng ADN tổng số giữa thí nghiệm 3,6,7,8 và 9
Hình 3.3. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 1 - răng số 1
Hình 3.4. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 2 - răng số 1
Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 3 - xương số 1
Hình 3.6. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 4 - răng số 1
Hình 3.7. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 2
Hình 3.8. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 3
Hình 3.9. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 6 - răng số 4
Hình 3.10. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - răng số 4
Hình 3.11. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - xương số 4
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 8 - răng số 4
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 9 - răng số 4
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 10 - răng số 5
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 10 - răng số 6

4

Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Danh mục chữ viết tắt
Chữ viết tắt

Cụm từ đầy đủ

ADN, DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit đêoxiribonucleic

Base pair

Cặp bazơ

DDT

Dithiothreitol

Dithiothreitol

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuếch đại gen

RFLP

Restriction Fragment Length

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

bp

Nghĩa tiếng việt

Polymorphism
rfu

Relative fluorescent units

Đơn vị huỳnh quang

rpm

Rovolutions per minute

Số vòng quay mỗi phút

STR

Short Tandem Repeat

Các trình tự lặp lại ngắn

5


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của việc nghiên cứu đề tài
Cùng với sự phát triển của xã hội, tình hình tội phạm càng ngày càng phức tạp,
phương thức thủ đoạn phạm tội ngày càng tinh vi nên chỉ sử dụng những phương pháp
giám định dấu vết truyền thống thông qua dấu vân tay, vải sợi… là không đủ cơ sở làm
bằng chứng trong các vụ án. Ngày nay, nhờ có sự phát triển của cơng nghệ sinh học,
với việc tìm ra cách tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào ở nhân tế bào người, khi
ứng dụng vào công tác điều tra, các điều tra viên có thể truy nguyên cá thể một cách
chính xác thơng qua những dấu vết tưởng chừng như rất nhỏ mà thủ phạm để lại như
dấu vết máu, tế bào trên đầu lọc thuốc lá, bã kẹo cao su...
Hàng năm, Viện Khoa học hình sự nhận được rất nhiều trưng cầu giám định
ADN, trong đó dấu vết để lại trong các vụ án hình sự khơng chỉ là máu, lơng tóc hay
tinh dịch mà cịn là tử thi chưa rõ tung tích hoặc chỉ là các bộ phận trên cơ thể. Khi đó
việc giám định ADN từ các mẫu mô là rất khó khăn do tử thi đã bị thối rữa nhiều
tháng, thậm chí đã phân hủy hoàn toàn qua nhiều năm, chỉ có thể giám định ADN
thơng qua răng và xương cịn sót lại của nạn nhân. Điển hình như các vụ án ―xác chết
khơng đầu‖, ―thẩm mỹ viện Cát Tường‖… là các vụ án rất được dư luận quan tâm.
Tuy nhiên, với các mẫu hài cốt, việc phân tích ADN nhân tế bào gặp rất nhiều
khó khăn, nhưng bù lại nếu phân tích được, dù chỉ một vài locus cũng rất có giá trị,
thậm chí giá trị truy nguyên còn cao hơn cả việc phân tích được tồn bộ gen ty thể của
hài cốt đó. Đặc biệt đối với việc xác định danh tính hài cốt liệt sĩ, nếu chỉ giám định

bằng hệ gen ty thể thì khơng thể phân biệt từng cá thể do đặc điểm di truyền theo dòng
mẹ. Nhưng nếu thu được vài locus gen nhân tế bào, đã có thể truy ngun chính xác
danh tính của liệt sĩ, thơng qua những người thân của họ. Mặt khác, đối với các hài cốt
liệt sĩ thì lượng răng và xương thu được là hạn chế, nên cần phải tiến hành phân tích
trên lượng mẫu tối thiểu do đó việc lựa chọn một quy trình tách chiết hiệu quả là bước

6


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

quyết định sự thành công trong công tác giám định ADN nhân tế bào từ các mẫu hài
cốt.
Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách
chiết ADN từ những dấu vết có số lượng ít, chất lượng thấp (hay còn được gọi là vi
vết) như: dấu vết tế bào để lại thông qua việc cầm, nắm hay dấu vết nước bọt trên
miệng chai nước, trên đầu lọc thuốc lá... cho kết quả tốt. Vậy có thể sử dụng bộ kit này
để tách chiết ADN từ hài cốt, một đối tượng cũng có hàm lượng ADN thấp và rất khó
tách chiết hay khơng?
Để góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, việc lựa chọn đề tài „Nghiên
cứu ứng dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt
phục vụ công tác giám định ADN tại Việt Nam‟ với mong muốn nâng cao hiệu quả
của việc tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương là rất cần thiết.
2. Mục đích nghiên cứu
2.1. Phân tích, đánh giá việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN
nhân tế bào từ hài cốt.
2.2. Đưa ra được quy trình tối ưu nhằm sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết
và phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt để phục vụ cơng tác giám định ADN hình sự.

2.3. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ
khám nghiệm hiện trường có các giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để
có khả năng phân tích được ADN tốt nhất.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler®.
3.2. Thiết kế các mơ hình thí nghiệm để tìm phương pháp tách chiết tối ưu.
3.3. So sánh hiệu quả tách chiết ADN nhân tế bào từ các mẫu hài cốt khác nhau
(răng và xương).

7


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng:
Các mẫu răng và xương được thu trực tiếp tại hiện trường hoặc thi thể của nạn
nhân trong các vụ án xảy ra từ năm 2005 đến nay.
4.2. Phạm vi nghiên cứu:
Nghiên cứu việc tách chiết ADN nhân tế bào bằng bộ kit PrepFiler đối với các
mẫu răng và xương thu từ các bộ hài cốt có thời gian từ 1 - 10 năm tính từ khi nạn
nhân bị chết.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp làm sạch mẫu.
5.2. Phương pháp nghiền mẫu.
5.3. Tách chiết ADN nhân tế bào từ răng xương bằng bộ kit PrepFiler®.
5.4. Định lượng sản phẩm ADN sau khi tách chiết.
5.5. Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR.

5.6. Điện di và phân tích ADN thu được.
6. Những đóng góp của đề tài:
6.1. Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết
ADN nhân tế bào từ hài cốt.
6.2. Đưa ra được quy trình tối ưu sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết và
phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định ADN từ hài cốt nói
riêng và giám định ADN hình sự nói chung. Từ đó ứng dụng vào thực tế phân tích
ADN hài cốt trong các vụ án hình sự.
6.3. Đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các
giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để có khả năng phân tích được ADN
tốt nhất.

8


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự
1.1.1. Lịch sử giám định ADN trong khoa học hình sự
Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong
nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể được xếp thành 23 cặp tương
đồng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. Riêng tế bào
trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). Thế hệ con cái nhận từ
mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế
bào tinh trùng. Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc
thể trong tế bào thường là 46. Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này
sang thế hệ khác. Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận

biết qua vân tay, nhận biết các yếu tố di truyền có bản chất là protein (xác định nhóm
máu, xác định một số yếu tố trong huyết thanh, xác định một số enzym) nhưng nói
chung khả năng phân biệt còn thấp.
Phải đến cuối thế kỉ 20, đặc biệt là trong thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình
sự mới ứng dụng cơng nghệ gen (DNA-Technology) vào trong xác định tội phạm.
Năm 1985, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester nước Anh khi
nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra
trình tự của các base nitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10 - 15 bp
hoặc vài chục bp, các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (Minisatellite) hay VNTR.
Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm đầu dò (probe) để
phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (Hypervariable regions) ở các
vật liệu di truyền khác nhau của người. Kỹ thuật để Jeffreys phân tích các đoạn lặp
VNTR là kỹ thuật RFLP. Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của
Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng. Các tiểu vệ tinh
được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong ADN của
người. Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì

9


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

khác nhau. Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau
giữa các cá thể. Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây. Phương pháp
RFLP này lần đầu tiên được sử dụng để xác định đối tượng trong một vụ hiếp dâm xảy
ra tại Anh vào năm 1986. Kể từ đó, việc kiểm tra truy nguyên cá thể bằng giám định
ADN được phổ biến rộng rãi.
Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Kary Mullis phát minh phản ứng chuỗi

nhân gen PCR. Phản ứng PCR có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng
kỹ thuật RFLP là chỉ cần một lượng rất ít ADN khn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ
phản ứng đã tạo ra được hàng triệu bản sao giống hệt nhau giúp cho việc phân tích
trình tự ADN được dễ dàng.
Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới thiệu, đó là
phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp ngắn (STR) có gắn chất huỳnh quang hay
còn gọi là Microsatellite. Các STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 bp.
Năm 1997, trên thế giới đã đưa ra thông báo rằng có thể phân tích được ADN từ
các vi vết trên các đồ vật đã được tiếp xúc với cơ thể con người. Từ đó mở ra cơ hội
thu thập vi vết ADN từ nhiều loại vật chứng hơn (bao gồm: các công cụ, quần áo,
phương tiện, súng, bao cao su, son mơi, ví tiền, trang sức, kính, da, giấy tờ, bàn chải
đánh răng).
1.1.2. Giám định ADN
Bằng việc sử dụng bộ kit Identifiler , Identifiler Plus và Identifiler Direct , cùng
hệ thống máy móc đồng bộ của hãng ABI

– Mỹ để phân tích 16 locus (gen) của các

phân tử ADN nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, các locus này có tính đặc trưng
và sự đa hình cao ở người Việt Nam. Đây là bộ kit được dùng phổ biến nhất và là bộ
kit chuẩn CODIS (Hệ thống chỉ số kết hợp ADN) của FBI, Mỹ gồm 15 locus STR trên
nhiễm sắc thể thường và 1 marker giới tính. Ưu điểm của bộ kit này là độ nhạy cao, tín
hiệu phân tích rõ nét và được sử dụng phổ biến nhất thế giới hiện nay (chiếm khoảng
80%) trong việc giám định ADN, xây dựng tàng thư ADN và xác định huyết thống. Ở

10


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Việt nam bộ kit này đã được Viện Khoa học hình sự - Bộ Cơng An thử nghiệm, xác
định tần số đa hình của chủng người Việt và xác nhận tính đa hình cao đối với chủng
người Việt từ năm 2006. Do vậy bộ kit này đã được Lực lượng Công an Việt Nam đưa
vào sử dụng trong truy nguyên cá thể và xác định huyết thống cha – con, mẹ - con.
Bộ kit Identifiler có 16 locus gen bao gồm các locus sau: CSF1PO, D2S1338,
D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433,
D21S11, FGA, TH01, TP0X, wWA và Amelogenin (giới tính).
Kế t quả đươ ̣c phân tích máy giải trình tự gen ABI Prism

3130 Genetic

Analyzer. Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau,
vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang
tương ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang.
Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange) tương
ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự
hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt huỳnh quang
hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng
thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở
những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.
Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm
GeneMapper ID v.3.2. để xác định các alen của mỗi locus. Mỗi locus bình thường có
từ 1 đến 2 alen, mỗi alen được thể hiện bằng một đin
̉ h riêng biệt với chiều cao xác
định. Các đỉnh được chấp nhận phải rõ nét, nhận đúng giá trị trong thang ladder, không
bị xẻ đin
̉ h và giữa hai đin̉ h trong cùng một locus không được chênh lệch nhau quá
nhiều về chiều cao. Các đin̉ h được chấp nhận có chiều cao tối thiểu từ 50 rfu.

Mỗi nhóm locus được biểu diễn bằng một màu sắc khác nhau, cụ thể:
-

Màu xanh da trời (blue): D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO.

-

Màu xanh lá cây (green): D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338.

11


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

-

Màu vàng (yellow) (trên hình biểu diễn bằng màu đen): D19S433, vWA,
TP0X, D18S51.

-

Màu đỏ (red): Amelogenin (giới tính), D5S818, FGA.

Hình 1.1. Hình ảnh phân tích kết quả điện di bằng phần mềm GeneMapper ID v.3.2
* Nguyên tắ c so sánh và truy nguyên cá thể dựa vào hệ Identifiler:
Kiể u gen của mỗi người sẽ đươ ̣c thố ng kê và so sánh với nhau ở từng locus

.

Những n gười cho nhận hết 16 locus với nhau sẽ c ó quan hệ huyết thống cha – con
(hoă ̣c me ̣ – con) với độ chính xác 99,9999%. Những n gười khơng cho nhâ ̣n 1 locus
trên tổng số 16 locus với thì không kết luận được quan hệ huyết thống cha-con (hoă ̣c
mẹ – con), mà sẽ làm thêm mẫu bổ sung hoă ̣c tiế n hành phân tích 24 locus (trường hợp
không thu được mẫu bổ sung ) để đưa ra kết luận cuối cùng chính xác nhất. Những

12


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xn Tồn

người khơng cho nhâ ̣n từ 2 locus trở lên sẽ không có quan hệ huyết thống cha-con
(hoă ̣c me ̣ - con). Cụ thể như trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. So sánh kiểu gen của 03 ngƣời nghi có quan hê ̣ cha con
LOCUS GEN

"Bố "

"Con 1"

"Con 2"

D8S1179

11; 12

12; 15

10; 12

D21S11

30; 32.2

30; 31

30; 31

D7S820

11; 13

11

12; 14

CSF1PO

11; 12

11; 12

10; 12

D3S1358

15; 17

15; 16

14; 17

7

7

6; 7

D13S317

8; 11

9; 11

8; 11

D16S539

9

9; 10

7; 8

D2S1338

19; 24

19; 24

18; 20

D19S433

14

13; 14

12; 14

vWA

17

15; 17

15; 17

TPOX

8; 11

8; 11

9

D18S51

13; 15

14; 15

13

D5S818

10; 13

11; 13

10; 12

FGA

21; 26

21; 25.2

21; 22

XY

XY

XX

TH01

AMEL

13


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Từ bảng 1.1:
Người có mẫu ký hiê ̣u ―Bố ‖ và người có mẫu ký hiê ̣u ―Con 1‖ có cho nhâ ̣n alen
ở tất cả các locus gen kể trên . Ngƣời có mẫu ký hiêụ “Bố ” là cha đẻ của ngƣời có
mẫu ký hiêụ “Con 1”.
Người có mẫu ký hiê ̣u ―Bố ‖ và người có mẫu ký hiê ̣u ―Con 2‖ không cho nhâ ̣n
alen ở 03 locus gen (D7S820, D16S539, D2S1338). Ngƣời có mẫu ký hiêụ “Bố ” không
phải là cha đẻ của ngƣời có mẫu ký hiệu “Con 2”.
1.2. Các kỹ thuật tách chiết ADN
1.2.1. Phương pháp tách chiết hữu cơ (phương pháp tách chiết bằng phenol/
chloroform/ Isoamyl Alcohol)
Phương pháp này chủ yếu dựa trên nguyên lý độ hòa tan khác nhau của protein
và axit nucleic trong các dung môi khác nhau. Sử dụng hỗn hợp sodium dodecyl
sulphat (SDS) và proteinase K để phá màng tế bào và màng nhân, sau đó loại bỏ các
thành phần không mong muốn trong mẫu bằng hỗn hợp phenol/chloroform/izoamyl
alcohol (biến tính protein nhưng khơng hịa tan axit nucleic). Cuối cùng thu lấy ADN
bằng cách tủa trong ethanol hoặc izopropanol.
Phương pháp tách chiết hữu cơ có ưu điểm là tách được lượng lớn ADN, có độ
tinh sạch cao. Tuy nhiên phương pháp này phải sử dụng hóa chất độc hại và tiến hành
nhiều thao tác nên mẫu dễ bị tạp nhiễm.
1.2.2. Phương pháp tách chiết bằng chelex

Chelex là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại đa hóa
trị. Nó là hỗn hợp chất trùng ngưng styrene divinylbenzene có chứa các cặp ion
imminodiaxetat hoạt động là nhóm tạo phức.
Tách chiết ADN bằng chelex là phương pháp vơ cơ, có ưu điểm thao tác đơn
giản, ít bị nhiễm và tốn ít thời gian. Tuy nhiên phương pháp này phải sử dụng lượng

14


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

mẫu lớn, các mẫu phải có chất lượng tốt nên không hiệu quả trong tách chiết mẫu hài
cốt.
1.2.3. Phương pháp tách chiết bằng cột silica
Sử du ̣ng cột s pin (spin column) chứa các hạt silica để tách chiết ADN hoặc
ARN có ưu điểm nhanh chóng và đơn giản hơn so với phương pháp tách chiết thủ
công. Tuy nhiên, phương pháp này cũng đòi hỏi những hiểu biết nhất định về bộ kit để
đạt được hiệu quả tách chiết cao nhất và tránh những sai sót trong quá trình thực hiện .
Cụ thể quy trình gồm các bước:
Bƣớc 1: Quá trình ly giải (lysis)
Thành phần và nồng độ đệm ly giải thay đổi tùy theo mục đích tách chiết là
ADN hoặc ARN, nhưng về cơ bản đều chứa các muối chaotropic (guanidine HCL,
guanidine thiocyanate, urea và lithium perchlorate) ở nồng độ cao, làm mất tính bền
vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước. Do đặc tính này,
các chất chaotropic có một số tác dụng sau: 1) ly giải màng tế bào, 2) biến tính protein,
ADN và các đại phân tử khác, 3) bất hoạt nuclease, 4) thúc đẩy quá trình gắn acid
nucleic vào silic. Ngồi ra, một số chất tẩy rửa (detergent) và enzyme (thường dùng là
proteinkinase hoặc lysozyme) cũng được sử dụng nhằm tăng hiệu quả hịa tan protein

và quá trình ly giải.
Bƣớc 2: Gắn ADN hoặc ARN vào cột sắc ký
Ngoài các muối chaotropic, cồn cũng được sử dụng để tăng khả năng gắn của
acid nucleic vào silic, thường dùng là ethanol hoặc đôi khi là isopropanol. Việc tối ưu
hóa lượng ethanol để tăng hiệu suất tách chiết acid nucleic cũng là vấn đề cần quan
tâm. Quá nhiều ethanol sẽ làm ADN bị đứt gãy thành nhiều đoạn nhỏ ảnh hưởng đến
khả năng đọc UV ở bước sóng 260nm, ngược lại quá ít ethanol sẽ gây khó khăn cho
bước rửa muối trên màng.

15


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Bƣớc 3: Rửa ADN (hoặc ARN)
Đây là bước cần thiết để loại bỏ các thành phần còn sót lại trên màng như
protein, polysaccharide hay thậm chí là chất màu nhằm đạt hiệu suất tách chiết và tinh
sạch ADN hoặc ARN cao. Muối còn sót lại làm giảm quá trình rửa giải acid nucleic
đưa đến kết quả đọc UV ở bước sóng A230 cao và tỷ lệ UV 260/230 thấp. Vì thế, một
vài bộ kit thực hiện bước rửa bằng ethanol tới 2 lần.
Bƣớc 4: Loại ethanol bằng cách làm khô
Thực hiện ly tâm làm khô cột nhằm loại ethanol. Nếu cột lọc vẫn cịn sót lại
ethanol, nucleic acid khơng thể bị hydrate hóa đầy đủ dẫn tới hiệu suất tách chiết ADN
thấp.
Bƣớc 5: Rửa giải ADN hoặc ARN đƣợc gắn vào cột
Đối với ADN, do đặc tính ổn định ở mơi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh
trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng
làm đệm rửa giải. Ngược lại ARN lại ổn định tốt trong mơi trường pH acid nhẹ và hịa

tan hồn toàn trong nước nên nước là dung dịch phù hợp để rửa giải (pH của nước
thường nằm trong khoảng 4-5). Quá trình rửa giải đạt hiệu quả cao nếu ủ dung dịch
rửa giải ở màng vài phút trước khi ly tâm.
1.2.4. Phương pháp tách chiết bằng bợ kit PrepFiler®
1.2.4.1. Sơ lược về bộ kit PrepFiler®
Nhà sản xuất: hãng Life Technologies™.
Tên đầy đủ: PrepFiler® Forensic DNA Extraction Kit
Đối tượng sử dụng: Mẫu chất lỏng (máu, nước bọt), mẫu dịch cơ thể (nước bọt,
tinh dịch) trên vải, mẫu máu trên giấy FTA hoặc trên vải, mẫu dịch cơ thể trên bông
gạc (nước bọt hoặc dịch cơ thể khác) và các mẫu vi vết…

16


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xn Tồn

Hình 1.2. Bơ ̣ kit PrepFiler®
1.2.4.2. Thành phần của bộ kit PrepFiler®
PrepFiler Lysis Buffer: có chứa các emzym phân hủy protein và các chất ổn
định DNA, có tác dụng tách ADN ra khỏi tế bào.
DDT (dithiothreitol): có tác dụng ổn định hoạt động các enzym, phân hủy
protein (cắt liên kết disulfide).
Hạt từ tính (Magnetic Particlec): có thể liên kết với ADN, có tác dụng thu lấy ADN.
Isopropanol: giúp dung dịch không tạo bọt khi lắc, làm dung mơi cho hạt từ
tính hoạt động.
PrepFiler Wash Buffer: dung dịch rửa ADN liên kết với hạt từ tính, giúp loại
bỏ các tạp chất lẫn cùng ADN.
PrepFiler Elution Buffer: dung dịch dùng để thu lấy ADN sau cùng, sau khi

tách ra khỏi hạt từ tính.
1.2.4.3. Quy trình thực hiê ̣n của bộ kit PrepFiler®
Bƣớc 1. Xác định lƣợng mẫu sử dụng
Sử dụng 40µl đối với mẫu dịch (máu, nước bọt) và 25 mm2 đối với vật mang
(giấy, vải..) cho 1 lần tách chiết ADN.

17


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Bƣớc 2. Ủ mẫu với Lysis Buffer
Mẫu được chuyển vào ống Eppendoft 1,5 ml, bổ sung 300 µl PrepFiler Lysis
Buffer, 3 µl DTT 1,0 M.
Tuýp mẫu được đưa vào máy lắc nhiệt, ủ ở 56oC với tốc độ 900 rpm trong một
thời gian (từ 20 phút đến 90 phút tùy loại mẫu).
Bƣớc 3. Loại bỏ cơ chất
Tuýp mẫu được đưa về nhiệt độ phòng và ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Sau
đó được hút phần dịch nổi bên trên chuyển sang ống Eppendoft 1,5 ml khác.
Bƣớc 4. Gắn ADN với các hạt từ tính (Magnetic Particles)
Tuýp PrepFiler Magnetic Particles được lắc trong 5 giây và lật ngược để có thể
chắc chắn rằng khơng có hạt từ cịn lại ở đáy tuýp. Hút 15 µl hạt từ tính bổ sung vào
tuýp chứa dịch mẫu và lắc ở tốc độ chậm 500 đến 1200 vòng/phút trong 10 giây, sau
đó ly tâm trong vài giây.
Tuýp chứa dịch mẫu được thêm 180 µl Isopropanol và lắc ở nhiệt độ phòng
trong 10 phút, tốc độ 1000 rpm.
Bƣớc 5. Rửa ADN liên kết với hạt từ
Ống Eppendoft được lấy ra khỏi máy lắc, ly tâm vài giây để đảm bảo khơng cịn

hạt từ bám trên thành ống. Sau đó được đưa vào giá từ, đợi đến khi hạt từ chuyển hết
về thành ống (khoảng 1 đến 2 phút) rồi được hút và loại bỏ hết phần chất lỏng nhìn
thấy được (khơng hút hạt từ).
Thực hiện bước rửa sau 3 lần:
a. Ống Eppendoft chứa hạt từ được thêm 300 µl PrepFiler Wash Buffer.
b. Ống được lấy ra khỏi giá từ và votex mạnh đến khi khơng cịn hạt cặn
từ bám trên thành ống.

18


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

c. Ống Eppendoft được để vào giá từ khoảng 30 đến 60 giây, sau đó hút
và loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy được.
Sau khi thực hiện bước rửa 3 lần thì mở nắp tuýp để làm khô hạt từ đã gắn với
ADN ở nhiệt độ phòng trong 5 – 10 phút.
Bƣớc 6. Thu ADN
Sau khi để khô, ống Eppendoft chứa hạt từ được thêm 30 µl PrepFiler Elution
Buffer và lắc tốc độ cao đến khi không có hạt từ nào bám vào thành tuýp. Lắc ủ nhiệt
ở 70oC trong 5 phút với tốc độ 900 rpm.
Sau 5 phút, Eppendoft được lấy ra khỏi máy lắc, ly tâm trong vài giây để khơng
cịn hạt từ nào bám dính vào thành ống và được đặt vào giá từ. Khi hạt từ dịch chuyển
hết về thành ống phía giá từ, hút phần chất lỏng trong ống Eppendoft (bao gồm ADN
đã được tách ra) cho vào ống Eppendoft 1,5 ml mới để sử dụng ngay hoặc bảo quản.
1.3. Cấu tạo xƣơng, răng ngƣời và cơ sở để phân tích ADN xƣơng, răng
1.3.1. Cấu tạo bợ xương người
1.3.1.1. Sự hình thành và phát triển của hệ xương [11]

Trong phơi thai, xương được hình thành từ lớp trung phơi bì và phát triển qua 3
giai đoạn: màng => sụn => xương (trừ một số xương ở vòm sọ, một vài xương mặt
không qua giai đoạn sụn và một phần xương sườn vẫn tồn tại sụn, không qua giai đoạn
xương).
Bộ xương màng ở người bắt đầu hình thành từ cuối tháng một của bào thai. Từ
tháng thứ hai thì màng biến thành sụn, và từ cuối tháng thứ hai thì sụn bắt đầu được
thay bằng mơ xương. Sau khi ra đời, quá trình hóa xương vẫn tiếp tục cho tới lúc
trưởng thành (nam khoảng 25 tuổi, nữ khoảng 23 tuổi).
Tuổi thiếu niên, sự hóa xương chưa hoàn tất, sụn vẫn còn nhiều. Đặc biệt các
đốt sống vẫn chưa cốt hóa hết, đĩa sụn gian đốt sống vẫn còn mềm.

19


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

1.3.1.2. Thành phần hóa học và tính chất sinh lý của xương [11]
Trong xương có 2 thành phần chủ yếu:
- Thành phần hữu cơ: chiếm 30% gồm prôtêin, lipit, mucopolysaccarit.
- Chất vô cơ: chiếm 70% gồm nước và muối khoáng, chủ yếu là CaCO3,
Ca3(PO4)2. Các thành phần hữu cơ và vô cơ liên kết phụ thuộc lẫn nhau đảm bảo cho
xương có đặc tính đàn hồi và rắn chắc. Nhờ đó xương có thể chống lại các lực cơ học
tác động vào cơ thể. Xương người lớn chịu được áp lực 15kg/mm2, gấp khoảng 30 lần
so với gạch, hoặc tương đương với độ cứng của bê tông cốt sắt.
- Tỉ lệ các thành phần hóa học của xương ở mỗi người khơng hồn toàn giống
nhau. Tỉ lệ đó phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, tuổi tác, bệnh lý. Cơ thể càng non,
chất hữu cơ trong xương càng nhiều nên xương trẻ em mềm dẻo hơn. Khi về già, tỉ lệ
vô cơ tăng dần lên nên xương giòn, dễ gãy.

Do cấu trúc còn nhiều tế bào, nên xương của trẻ em sẽ dễ tách chiết ADN hơn
so với xương người đã trưởng thành.
1.3.1.3. Hình dáng của xương [11]
Bộ xương người gồm 206 xương, trong đó có 85 xương chẵn và 36 xương lẻ và
được chia thành 3 phần: xương đầu, xương thân, xương chi. Mỗi phần có nhiều xương
khác nhau. Dựa vào hình dáng chia xương thành 5 loại chính: xương dài, xương ngắn,
xương dẹt, xương khó định hình, xương vừng.
- Xương dài: Có hình ống, gồm 3 phần: đoạn giữa là thân xương cấu tạo bằng
mô xương chắc, trong có ống chứa tủy. hai đầu xương phình to hơn, có sụn bao bọc,
cấu tạo bằng mô xương xốp, trong chứa tủy xương (Ví dụ : Xương cẳng chân, xương
cẳng tay…).
- Xương ngắn: Hình dáng và cấu tạo nói chung giống xương dài, nhưng cấu tạo
chủ yếu là mơ xương xốp (Ví dụ: xương ngón tay, ngón chân…).

20


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

- Xương dẹt : Là những xương rộng, mỏng với 2 bản xương đặc nằm 2 bên,
giữa là mơ xương xốp (Ví dụ: xương bả vai, các xương ở hộp sọ).
- Xương khó định hình: Là loại xương có hình dáng phức tạp (Ví dụ: xương
bướm, xương hàm trên…).
- Xương vừng: Là loại xương có hình bầu dục giống như hạt vừng (Ví dụ :
xương bánh chè).
Tuy nhiên cần lưu ý rằng, sự phân chia này chỉ có tính chất tương đối. Vì có
một số xương có thể xếp vào loại này hay loại kia (như xương sườn, xương ức có thể
xếp vào loại xương dẹt, cũng có thể xếp vào loại xương dài). Một số xương sọ như

xương bướm, xương sàng, xương hàm trên… là những xương dẹt nhưng trong khoang
xương lại khơng chứa tủy đỏ mà chứa khí. Đây là một đặc điểm thích nghi của bộ
xương người.
1.3.2. Phân tích ADN từ xương người
1.3.2.1. Cơ sở khoa học để có thể phân tích ADN từ xương người
Giống như các bộ phận khác trên cơ thể, trong xương có những tế bào sống
mang đầy đủ ADN, làm nhiệm vụ liên kết, nuôi dưỡng và duy trì cấu trúc xương. Đặc
biệt ở các xương dài, xương cột sống và răng còn có tủy sống chứa một lượng lớn tế
bào, đủ để có thể tiến hành phân tích ADN.
1.3.2.2. Các xương được ưu tiên trong phân tích ADN
Theo nghiên cứu của tiế n si ̃ Timothy McMahon khi phân tích 5946 mẫu hài cố t
có thời gian trên 50 năm thì kế t quả phân tić h ADN ty thể ta ̣i các vi ̣trí khác

nhau củ a

bô ̣ xương đươ ̣c thể hiê ̣n trong Hình 1.3. Theo đó sẽ lựa cho ̣n phầ n xương để tiế n hành
thí nghiệm theo tiêu chí:
-

Phầ n xương tớ t nhấ t cho viê ̣c phân tích ADN: xương đùi.

-

Phầ n dễ thu thâ ̣p nhấ t: răng (răng hàm ).

21