Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam

MỞ ĐẦU
Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện
nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc
lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao. Với tốc độ lây truyền nhanh
và tỷ lệ tử vong cao như vậy, hiện nay bệnh lao được xếp vào một trong
những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Tuy nhiên theo ước tính tỷ lệ phát
hiện bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy số bệnh nhân mắc lao nhưng không được
phát hiện và chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất
khó kiểm soát. Theo đánh giá của WHO Việt Nam là một quốc gia đang phát
triển và có tỉ lệ nhiễm lao đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân mắc
lao cao nhất thế giới (WHO 2004). Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dương,
Việt Nam đứng thứ 3, chỉ sau Trung Quốc và Philipine [2, 11, 74].
Trước diễn biến nghiêm trọng đó, tổ chức Y tế Thế giới đã kêu gọi các
quốc gia trên thế giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm soát bệnh
lao. Bệnh lao ngày càng trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa
thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy càng cần thiết trong việc phát hiện và điều
trị sớm. Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh và
chính xác. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn. Ở Việt
Nam, phương pháp phổ biến nhất hiện nay vẫn là nhuộm Ziehl- Neelsen. Tuy
nhiên phương pháp này chỉ phát hiện ra trong trường hợp số lượng vi khuẩn
lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, do vậy sẽ để sót nhiều bệnh nhân do kết quả
âm tính giả. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường LowensteinJensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8
tuần nuôi cấy mới cho kết quả. Trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT,
BACTEC cũng mất đến 2 tuần, do vậy rất khó đáp ứng yêu cầu giám sát và
kiểm soát bệnh lao [4, 19].

1


Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học chúng ta đã khắc
phục được nhược điểm này. Việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử trong

chẩn đoán lao đã rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn hai ngày. Phương
pháp này có độ nhậy và độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt chính xác các
loài có khả năng gây bệnh lao cũng như phát hiện khả năng kháng thuốc
thông qua các gen đặc trưng. Hiện nay, một số cơ sở trong nước đã áp dụng
sinh học phân tử trong chẩn đoán lao nhưng chủ yếu vẫn sử dụng các kít chẩn
đoán cũ nhằm vào nhân đoạn IS6110, đây là trình tự đặc trưng của vi khuẩn
lao [28, 34]. Tuy nhiên, gần đây một số nghiên cứu đã công bố tỷ lệ nhất định
các chủng lao không chứa trình tự IS6110, đặc biệt là các chủng được tìm
thấy ở Ấn Độ và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam [34, 72]. Vì vậy rất dễ
bỏ sót các bệnh nhân có mang vi khuẩn lao khuyết IS6110. Do vậy cần thiết
kế những loại primer mới để chẩn đoán lao ở Việt Nam một cách hiệu quả và
chính xác.
Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết, ngoài đoạn gen IS6110 còn
có một số gen đích khác như IS1081 và 23SrDNA có mặt ở tất cả các chủng
lao gây bệnh. Do vậy khi sử dụng cùng lúc các cặp mồi đặc hiệu để khuếch
đại các đoạn IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ rất thuận lợi trong việc phát
hiện M. tuberculosis complex, tránh bỏ sót bệnh nhân [13].
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu
tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở Việt
Nam” nhằm chẩn đoán nhanh, chính xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm soát và
nâng cao hiệu quả chẩn đoán lao. Đề tài có hai mục tiêu sau:
1. Tạo kit multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23SrDNA
chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
2. Đánh giá hiệu quả của kit trên panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm
sàng nghi lao.

2


Chương 1

TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới
Lao là một bệnh truyền nhiễm mãn tính đã xuất hiện từ rất lâu. Hàng
nghìn năm trôi qua, nó đã lây lan và giết chết hàng triệu người, số người chết
vì bệnh lao còn lớn hơn cả do AIDS và sốt rét cộng lại.
Ngày nay, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn do xuất hiện các
chủng lao kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng và lao đồng nhiễm
HIV/AIDS. Cùng với AIDS và sốt rét, lao đang được xếp vào một trong ba
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất thế giới [2, 53]. Do tính chất có thể lây
truyền qua tiếp xúc và qua không khí như các bệnh cúm nên tốc độ lan truyền
rất nhanh và khả năng kiểm soát bệnh lao rất phức tạp. Các kết quả thống kê
lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới (khoảng 2,2 tỷ
người) bị lây nhiễm tiên phát với M. tuberculosis và 10% trong số đó sẽ phát
triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời. Mỗi năm có khoảng 9
triệu bệnh nhân mới được phát hiện, hiện tại hàng năm trên thế giới có
khoảng trên 49 triệu bệnh nhân lao lưu hành, con số này đang ngày càng gia
tăng. Bệnh lao giết chết 8000 người mỗi ngày, gần 3 triệu người mỗi năm
[73]. Đáng báo động là hiện nay bệnh lao đã trở thành nguyên nhân hàng đầu
giết hại nhiều thanh thiếu niên và người lớn, chủ yếu là nhóm tuổi đang là
nguồn lao động chính của xã hội (từ 20 tới 49 tuổi) [78].
Số bệnh nhân lao ở những nước đang phát triển chiếm 95% trong tổng
số bệnh nhân lao trên toàn thế giới. Khoảng 80% số bệnh nhân lao trên toàn
thế giới tập trung vào 22 quốc gia có gánh nặng bệnh tật cao. Bệnh lao chiếm
25% nguyên nhân gây tử vong ở các nước này. Tính riêng tại Ấn Độ, hàng

3


năm có khoảng trên 500.000 người chết vì căn bệnh này, tương đương tỷ lệ

cứ 1 phút lại có một người ở quốc gia này chết vì lao [63, 73].
Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đông Nam Á có số người
nhiễm lao chiếm tới 34% trên toàn thế giới. Còn ở cận Sahara châu Phi thì tỷ
lệ này cao gấp đôi so với Đông Nam Á, tỷ lệ nhiễm lao ở đây là 343 ca trên
100.000 người dân. Thông báo gần đây nhất năm 2007 của tổ chức y tế thế
giới cho biết bệnh lao được xác định bước đầu đã ổn định và giảm đi ở cả 6
vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn
tăng lên và tập trung ở châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình
hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn không giảm nguy hại đối với loài người.
Hiện nay tỷ lệ điều trị lao thành công trên toàn cầu đạt 82%, tuy nhiên
còn rất nhiều bệnh nhân chưa được phát hiện và không được chữa trị, những
bệnh nhân này tiếp tục lây cho cộng đồng. Theo ước tính của WHO thì tỷ lệ
phát hiện bệnh nhân mới chỉ đạt 37% trong tổng số người mới nhiễm lao [63].
Sự gia tăng của bệnh lao trên quy mô toàn cầu cùng với mối liên quan với
HIV và sự xuất hiện của chủng kháng thuốc đang là một vấn nạn về y tế cộng
đồng. Điều này càng khiến cho bệnh lao trở nên khó khăn trong việc kiểm
soát và điều trị. Đến năm 1993 WHO phải tuyên bố tình trạng khẩn cấp về
bệnh lao trên toàn cầu để kêu gọi các quốc gia trên thế giới chung tay phòng
chống lao [64].
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Theo báo cáo vào năm 2006 trong chương trình chống lao quốc gia thì
Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao nhất thế
giới. Tại khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ 3 chỉ sau
Trung Quốc và Philipine về tổng số bệnh nhân lao đang lưu hành và số bệnh
nhân lao mới phát hiện. Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao
kháng thuốc là một vấn đề cấp bách [2, 10, 53].

4

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao
toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách
thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam
đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương
trình y tế Quốc gia trọng điểm. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình
chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ
phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao
phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 10, 53].
Theo WHO thì Việt Nam là nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu
với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Tỷ lệ lao mới mắc các thể là 173/100.000
dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) mới là 77/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là
225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong do lao là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm
lao/HIV trong các bệnh nhân lao mới là 5% [2], trên thực tế số liệu về nhiễm
lao có thể cao hơn những con số thống kê ở trên. Vấn đề đồng nhiễm HIV và
lao không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn làm giảm hiệu quả điều trị
bệnh, tăng tỷ lệ tử vong. Đó cũng chính là khó khăn, thách thức lớn đối với
công tác phòng chống lao quốc gia.
Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam đang ngày càng gia tăng, tỷ
lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa
thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%. Như vậy, mỗi ngày có gần 400
người mắc, trong đó có 178 người mắc lao phổi ho khạc ra vi khuẩn làm lây
nhiễm cho cộng đồng và 55 người chết vì bệnh lao. Hiện nay, nguy cơ nhiễm
lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% [2].
Thực tế hiện nay, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt khoảng 44% và tỷ lệ chữa khỏi là
81% [2]. Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR

5


vào chẩn đoán lao là một bước đột phá mang lại nhiều kết quả khả quan. Tuy

vậy kĩ thuật này vẫn còn những điểm chưa thực sự hoàn thiện và cần có
những nghiên cứu bổ sung, cải tiến nhằm đem lại hiệu quả tối ưu.
1.2. VI KHUẨN LAO
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ
Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống
Mycobacterium [75].
Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis
Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm hai
nhóm:
+

Mycobacterium

tuberculosis

complex

(MTBC)

gồm:

M.

tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. Microti. Trong đó M. tuberculosis
và M. bovis gây bệnh lao điển hình.
+ Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M. avium,
M. ortuitum, M.govdovac, M. kansasii… Nhóm này không gây bệnh lao [33,
[58, 61].
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc

1.2.2. 1. Cấu trúc hình thái
Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước
đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0,3 µm. Nhuộm
Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất
màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid
fast bacilli-AFB). Dựa vào đặc điểm này có thể giúp phát hiện vi khuẩn lao
trong các mẫu bệnh phẩm bằng cách soi AFB. Một số giả thiết cho rằng mức

6


kháng với axit là do độ dài của các chuỗi axit mycolic. Trực khuẩn lao duy trì
tính kháng axit trong dịch huyền phù trong một khoảng thời gian rất dài ngay
cả khi có tác dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các
cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme co-factor
thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 12].

Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis
( />
Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen
( />
7


1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào
Thành tế bào của Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc đặc biệt, chia
thành 4 lớp:
1- Lipid ngoài
2- Axit mycolic
3- polysaccharides

(arabinogalactan)
4- peptidoglycan
5- màng sinh chất
6- lipoarabinomannan (LAM)
7- phosphatidylinositol
mannoside
8- Khung thành tế bào
Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao
( />
Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi
khuẩn lao, phát triển trong tế bào có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp
cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống chịu các enzyme phân giải từ các
lyzozyme của tế bào. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc
trong đại thực bào, M. tuberculosis tích lũy một capsule giả không bám.
Thành phần của capsule này chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid.
Cấu trúc của capsule có thể bung ra bên trong các đại thực bào. Màng tế bào
của vi khuẩn lao gây bệnh hầu như giống với màng của các Mycobacterium
trong cùng một giống, bao gồm cả các Mycobacterium không gây bệnh.
Lớp tiếp theo được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các
chất lipit phức tạp. Đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả
năng chống thấm nước của thành vi khuẩn, chống lại sự hủy diệt của đại thực
bào và các tế bào miễn dịch [1]. Gắn với peptidoglican là một poysaccaharide
phân nhánh và arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được este hóa

8


với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic. Các axit mycolic được
sắp xếp theo tính đặc hiệu loài nên có thể xác định loài Mycobacterium bằng
sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí khí lỏng [57]. Các axit

mycolic đặc hiệu của M. tuberculosis là alpha - keto và mythoxymycolate
chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có
các phân tử lipid tự do như phthiocerol dilycoserosates (PDIM), phenolic
glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL). Xuyên
qua toàn bộ lớp màng là những glycolipid như phosphatidyl- myoinositol
mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM) được đính vào
màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào, trong đó LAM có tính đặc
hiệu loài. Thành tế bào Mycobacterium chứa các protein nằm rải rác, một vài
protein này tham gia vào cấu trúc thành tế bào, các protein porin hình thành các
kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp
axit mycolic [58, 67].
Lớp thứ ba gồm các peptidoglican liên kết với đường arabinose và các
phân tử axit mycolic tạo nên bộ khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho
vi khuẩn có độ cứng nhất định. Thành tế bào của Mycobacterium có cấu trúc
phức tạp với các thành phần hóa học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức
độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào của M. tuberculosis là 70 đến
80% trong khi ở E. coli là 20-30% [58].
Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các
photpholipit. Các photpholipit gồm 2 nhóm, nhóm ưa nước hướng vào bên
trong, nhóm kị nước hướng ra phía ngoài vỏ [1]. Màng sinh chất giữ vai trò
điều hòa áp suất thẩm thấu giữa tế bào chất và môi trường. Ngoài ra các
protein của màng giữ các chức năng khác nhau như protein nhạy với nồng độ
của các phân tử trong môi trường , protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi
chất và bộ máy di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến

9


quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng. Các enzyme xuyên màng và tổng
hợp màng, tạo vách ngăn trong quá trình phân chia tế bào [3, 4, 12].

M. tuberculosis không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng
không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan
nhưng do đặc điểm thành tế bào gắn với các phân tử lipit chứ không phải là
protein hay polycharcaride nên M. tuberculosis không được xếp vào nhóm vi
khuẩn Gram (+). Trên mẫu nhuộm Gram chúng không giữ lại tinh thể màu
tím xuất hiện trong nhuộm Gram. Thành tế bào của M. tuberculosis không
thẩm thấu aniline và các chất khác sử dụng trong nhuộm trừ khi chúng được
kết hợp với phenol.
Màng của tế bào vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi khi
phát triển hoặc tồn tại trong các môi trường khác nhau. Trong điều kiện thiếu
oxi thành tế bào dầy lên. Trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ và trong khoang
đại thực bào thì sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các porin dường như
được điều hòa ngược. Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao tồn tại 3-4 tháng,
trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể bảo quản trong nhiều năm. Dưới ánh
sáng trực tiếp của mặt trời vi khuẩn lao bị tiêu diệt sau 5 phút, dưới ánh sáng
của tia cực tím vi khuẩn lao tồn tại từ 2-3 phút. Ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn lao
ngừng phát triển, ở 80oC vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8].
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
1.2.3.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị
khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC , ở nhiệt độ dưới 37oC và trên 42oC vi
khuẩn lao hầu như không mọc. Vi khuẩn lao không sinh trưởng trong môi
trường thông thường mà phải nuôi trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh
dưỡng gồm trứng, khoai tây, citrat, glixerol, asparagin, xanh malachite. Môi
trường thường dùng là môi trường Loewenstein đặc đã được cải tiến bởi Jensen

10


hoặc môi trường lỏng Sauton. Trong môi trường đặc, trực khuẩn lao mọc rất

chậm, phải mất 4 đến 6 tuần mới mọc khuẩn lạc điển hình dạng R.

Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen
( />
Sau một thời gian nuôi cấy trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh sẽ phát triển
thành các khuẩn lạc có bề mặt dính và xù xì. Các Mycobacterium không gây
bệnh và các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc
khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đám trong môi trường nuôi cấy [3, 4, 12, 58].
1.2.3.2. Chu kì tế bào
Trong điều kiện phòng thí nghiệm cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân
chia một lần. Chu kì tế bào của M. tuberculosis khá dài, điều này có thể do
tính thẩm thấu của thành tế bào gây hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh
dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Theo Harshey và
Ramakrishnan sự tổng hợp RNA là tác nhân liên quan đến thời gian sống kéo
dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA ở M.
tuberculosis chậm hơn 10 lần so với E.coli. Một đặc điểm nữa là chỉ có một

11


operon duy nhất cần thiết trong tổng hợp RNA. Mặt khác khi trực khuẩn
chuyển từ trạng thái ổn định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên
hai lần, khiến cho việc tổng hợp protein bị chậm lại [58].
1.2.4. Khả năng gây bệnh
Độc lực của trực khuẩn lao có liên quan trực tiếp đến yếu tố “Cord”
(trehalose-6,6’-dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu,
gây nên những u hạt mãn tính. M. tuberculosis sinh ra ngoại độc tố nhưng
không có ý nghĩa gây bệnh.
Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường. Thường là qua đường
hô hấp, có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt…Sau khi gây tổn thương

tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ
quan khác gây tổn thương thứ phát. Nhiều cơ quan như phổi, thận, màng não,
xương, da, hạch... đều có thể bị bệnh lao, nhưng thường bị hơn cả là phổi, vị
trí thường gặp ở phổi là đỉnh phổi.
Miễn dịch trong lao là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Đáp
ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của trực khuẩn lao, gây hạn chế sự lan
tràn của vi khuẩn và cuối cùng làm phá hủy trực khuẩn. Đáp ứng miễn dịch
trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá mẫn muộn. Một số trường hợp vi
khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại
dưới dạng ngủ ở trong các u hạt nên cơ thể không thanh toán được. Đặc biệt
là trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không thanh toán được vi
khuẩn và các thuốc cũng không tác động được, đây là một vấn đề nan giải
trong điều trị lao [1].

12


1.2.5. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao
1.2.5.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacterium tuberculosis
Hệ gen của chủng H37Rv được công bố năm 1998 có chiều dài
4.411.529 cặp base. Trong đó có 3.918 gen và các gen này đều được dự đoán
là có mã hóa protein, tỷ lệ G+C chiếm 65,61% không thay đổi ở các vị trí
khác nhau trong toàn bộ hệ gen. Genome của Mycobacterium tuberculosis có
tới 90,8% trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [25, 31, 58].
Ở Mycobacterium có một nhóm gồm 172 gen có tỷ lệ G-C >80% mã
hóa cho họ protein PE (Pro-Glu) hoặc PPE (Pro-Pro-Glu). Trong đó 104 gen
mã hóa PE và 68 mã hóa PPE, chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis.
Trình tự PE và PPE có ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều
dài xấp xỉ 110 và 180 amino axit. Các protein PE và PPE đóng vai trò quan
trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của Mycobacterium trong các môi

trường khác nhau. Họ PE được chia thành 3 phân họ, trong đó họ quan trọng
nhất gồm 61 thành viên chứa các trình tự đa hình giàu G-C (PGRS). Các
protein được mã hóa bởi 104 gen mã hóa cho họ protein PE được chia nhỏ
hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai
gồm 8 protein trong đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập 9, lớp
thứ 3 gồm 67 protein tạo thành dưới họ PE-PGRS. PGRS (polymorphic GCrich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C
mở rộng với sự lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn. Chức năng
của các họ này vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số
protein này có liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M. tuberculosis
trong quá trình lây nhiễm. Các protein PE-PGRS đặc trưng cho M.
tuberculosis có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ
hoà hợp tổ chức (MHC) lớp đầu tiên. Một số gen PE mã hoá cho các protein
chỉ chứa vùng 110 axit amin được đi kèm gần với một gen mã hoá một

13


protein PPE. Trong một số trường hợp, cặp PE-PPE (Rv2431c-Rv2430c) biểu
hiện cùng nhau và có thể tạo thành một phức hệ [31, 58, 61, 65].
Một số ít gene với tỷ lệ G+C < 50% mã hoá cho các protein xuyên
màng hoặc enzyme polyketide synthase. Hơn 200 gen đã được nghiên cứu mã
hoá cho các enzyme của quá trình trao đổi axit béo, chiếm 6% tổng số. Trong
số này có khoảng 100 gen được dự đoán về chức năng trong oxy hoá β của
các axit béo, trong khi E. coli chỉ có 50 enzyme liên quan đến chuyển hoá axit
béo. Số lượng lớn các enzyme ở M. tuberculosis được cho là sử dụng axit béo
có thể liên quan đến khả năng gây bệnh phát triển trong mô của vật chủ nơi
mà axit béo có thể là nguồn carbon chính [31, 58, 64].
Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon
RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu
sao mã (losus oriC). Phần lớn vi khuẩn có nhiều hơn một operon rrn định vị

gần locus oriC để tăng quá trình sao mã. Vi khuẩn lao chỉ có một operon rrn
đơn ở một vị trí tương đối xa so với oriC do đó gây ra kiểu hình phát triển
chậm. Có hai thể tiền thực khuẩn được phát hiện trong genome, cả hai giống
nhau về độ dài và cách tổ chức. Một là prophage PhiRv1 có trong hệ gen của
M. tuberculosis H37Rv phá vỡ trình tự lặp lại của họ 13E12. Hệ gen của M.
tuberculosis chứa 7 vị trí cho PhiRv1 chèn vào do đó các chủng có những vị
trí biến đổi cao trong hệ gen. Prophage thứ hai PhiRv2 ổn định hơn, ít biến
đổi hơn giữa các chủng. Các gen mã hoá protein ở M. tuberculosis H37Rv mã
hoá cho 3.924 ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG
được sử dụng trong 35% trường hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus
subtilis hoặc Escherichia coli. Từ trình tự hệ gen cho thấy M. tuberculosis có
khả năng chuyển từ một con đường trao đổi chất này thành con đường trao
đổi chất khác bao gồm cả hiếu khí (quá trình phosphoryl hoá oxy hoá) và hô
hấp kỵ khí (quá trình khử nitrate). Tính linh hoạt này rất có lợi cho sự thích

14


nghi bên trong các môi trường khác nhau như trong cơ thể người cả khi trạng
thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí trong các
nang lao. Một đặc tính khác của hệ gen M. tuberculosis là có các gen tổng
hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các phân tử
phức như axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250 enzyme
khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen của E.
coli [37, 78]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố
sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase)
tương ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân
tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số. Số lượng
tương ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức
năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [65].

Phân tích hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis thấy có một
hệ thống sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác rất
cao. Hệ gen của M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa
trên mutS nhưng được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến
các cơ chế sửa chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã
hoá cho enzyme chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự
bắt cặp sai giữa các cặp base trong quá trình sao chép [25, 31, 58].
1.2.5.2. Gen 23S rDNA
Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền rRNA bao gồm các vùng 16S
rDNA, 23S rDNA và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng đệm (Internally
Transcribed Spacer - ITS). DNA trong vùng 16S-23S có sự thay đổi lớn về độ
dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân biệt loài ở prokaryotes
[24, 39].
ITS giữa 16S rDNAvà 23S rDNA có tính đa hình nucleotide cao hơn so
với 16S rDNA nhưng không thể phân biệt giữa những loài vi khuẩn có quan

15


hệ gần nhau như những loài thuộc M. tuberculosis complex. IST này có trình
tự và tính đa hình thấp hơn so với gen 23S rDNA [73], gen 23S rDNA là đoạn
gen mã hóa cho tiểu phần 23S của ribosome. Ngoài ra theo tác giả Mekonnen
Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng
lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại vùng gen đích 23S
rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện M. tuberculosis complex trong
những trường hợp không có trình tự IS6110 ở một số chủng M. tuberculosis
complex. Trình tự 23S rDNA ở M. tuberculosis khác với các loài đã phát hiện
ở 7 vị trí, đây là các vị trí thích hợp cho việc thiết kế các primer và probe. Sự
khác nhau đáng kể giữa các loài không phải Mycobacterium và
Mycobacterium có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng

này trong chẩn đoán [24, 45]. Trình tự 23S rDNA cũng có thể được sử dụng
để phân biệt M. tuberculosis và M. bovis và cũng được sử dụng để phân biệt
các chủng lao gây bệnh trong các Mycobacterium [36, 44].
1.2.5.3. Các trình tự chèn
Các trình tự chèn (IS – Insertion sequences) không có chức năng mã
hoá mà chỉ liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các yếu
tố cis, các trình tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này
được mã hoá bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu như toàn bộ độ
dài của trình tự chèn.
Đa số các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều ở hai đầu
(IR-Inverted Repeat), các trình tự này có chiều dài khoảng 10 đến 40 bp. IR
được phân thành hai vùng chức năng, một định vị trong IR và liên quan đến
chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan
đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các
trình tự chèn. Các promoter của IS thường định vị một phần bên trong trình tự
IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này có thể cung cấp một cơ chế tự điều

16


hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc
hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc ở gần đầu IR và đóng vai trò kích
hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase.
Tpase có hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein
được quy định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở
vùng C. Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với
các trình tự đích trên IS.

Hình 1.5. Cấu trúc của IS [69]
- IRL - left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái

- IRR - right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải
- Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình tự IRR.
- XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn của IS
vào vị trí đích
- p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận đầu
của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase. Vùng II chứa
các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc hiệu và gắn của Tpase

Một đặc điểm nữa của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự
DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ
2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định.
Chức năng của IS:
Kiểm soát sự biểu hiện của các gen bên cạnh: Một số trình tự chèn
có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen gần kề, trong trường hợp di

17


chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới có khả năng điều khiển
sự biểu hiện của các gen bên cạnh. Khi hai yếu tố đứng cạnh nhau theo kiểu
đầu-đuôi thì có thể tạo thành các promoter mạnh dẫn đến sự biểu hiện Tpase ở
mức cao làm tăng hoạt tính di chuyển của IS.
Điều khiển hoạt tính di chuyển: Thông qua biểu hiện và hoạt động
của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã,
kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã và độ bền của Tpase [58].
Các trình tự chèn không có chức năng mã hóa mà chỉ liên quan đến đặc
tính biến đổi và di chuyển.
• IS6110
IS 6110 là một trình tự chèn có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số
lượng bản copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và

chủng. IS 6110 tồn tại rải rác nhiều nơi trong genome của M. tuberculosis.
IS6110 có chiều dài 1355 bp, đã được xác định là có mặt trong các chủng M.
tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài nucleotid giữa các bản copy với
nhau, IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó nó được chọn làm gen đích trong
phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện M. tuberculosis [15].

Hình 1. 6. Một số bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis [61]

18


Hiện nay IS6110 typing là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho
các nghiên cứu dịch tễ học phân tử bởi vì có độ phân biệt cao. Ở một số vùng
số lượng bản copy IS6110 thấp (<5 copy) chiếm 25% số chủng, thậm chí có
một số chủng không có IS6110 [20, 69]. Sự thay đổi này là nền tảng của tính
đa hình và thường được sử dụng trong fingerprinting M. tuberculosis. Các
trình tự chèn có các vị trí ưu tiên đã được xác định cho sự hợp nhất vào hệ
gen của Mycobacteria, gọi là các “điểm nóng”. Các nghiên cứu gần đây cho
thấy quá trình chuyển vị trí của IS6110 là không ngẫu nhiên và cũng có các
điểm nóng nhất định cho quá trình hợp nhất với hệ gen. Một số ít điểm nóng
đã được xác định, 3 nghiên cứu đã cho thấy các vùng DR là một trong số các
điểm nóng đó. Ba vùng ưu tiên khác cho sự hợp nhất của IS6110 với hệ gen
cũng đã được mô tả là locus ipl, vùng hợp nhất dnaA-dnaN và vùng nằm giữa
Rv1754c và Rv1762c. Bằng phân tích sự phân bố của các đoạn RFLP-IS6110,
McHugh và cộng sự đã cho thấy rằng có bằng chứng về các yếu tố IS6110 có
thể có nhiều hơn các điểm nóng. Warren và cộng sự đã xác nhận điều này và
cũng cho thấy mô hình RFLP có thể thay đổi mặc dù yếu tố IS6110 vẫn được
xác định vị trí là ở trong các điểm nóng, có nghĩa là vùng gần điểm nóng có
tần số đột biến cao tạo nên những vị trí giới hạn mới cho enzyme giới hạn.
Những chủng chứa ít bản copy IS6110 hơn thì giống nhau hơn trong các mô

hình fingerprint so với các chủng chứa nhiều bản copy. Oligonucleotide có
nguồn gốc từ trình tự này được sử dụng cho phát hiện M. tuberculosis trong
các bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật PCR [39, 68].
• IS1081
Trình tự IS1081 có độ đa hình thấp hơn so với IS6110, theo Collins và
Stephens năm 1991, IS1081 là một trình tự chèn có độ dài 1324 bp có ở M.
tuberculosis complex, và có từ 5 đến 6 bản copy trong hệ gen. IS1081 có các
tận cùng lặp lại ngược chiều và chứa khung đọc mở lớn (ORF) [26]. IS1081

19


có độ đa hình thấp hơn so với IS6110 bởi IS1081 có hoạt tính di chuyển yếu.
Số lượng bản copy cũng thấp hơn IS6110, do đó có những hạn chế trong việc
sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học. Nó cũng không được sử dụng thường
xuyên để phân biệt B. bovis - BCG với các thành viên khác thuộc M.
tuberculosis complex [20]. IS1081 không liên quan mật thiết với các yếu tố
DNA khác nhưng transposase của IS1081 giống với IS 256 của
Staphylococcuc aureus . Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích cho các thao tác
di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis
dựa trên phản ứng PCR và multiplex PCR . Một trong những ưu điểm mà
IS1081 được chọn là để nhằm khắc phục hiện trượng khuyết gen IS6110 ở các
chủng lao tại Đông Nam châu Á, Việt Nam và Ấn Độ và qua đó khắc phục
được hiện tượng phản ứng PCR cho kết quả âm tính giả, nâng cao được hiệu
quả chẩn đoán vi khuẩn lao [7, 77].
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO
1.3.1. Phương pháp soi trực tiếp
Nhuộm Ziel-Neelsen: Do đặc tính kháng cồn kháng toan nên sau khi
nhuộm đỏ bằng fucsin dù tẩy màu bằng axit và cồn, nhuộm lại bằng xanh
methylen vi khuẩn lao vẫn có màu đỏ fucsin, không bắt màu xanh methylen

như các vi khuẩn khác. Phương pháp nhuộm Ziel-Neelsen mẫu bệnh phẩm và
soi dưới kính hiển vi có thể thu được kết quả trong vòng vài giờ. Tuy nhiên số
lượng vi khuẩn phải có từ 103 đến 104 vi khuẩn trên 1ml bệnh phẩm trở lên.
Chương trình chống lao quốc gia qui định đọc kết quả như sau:
- 0 vi khuẩn / 300 vi trường: âm tính.
- 1-299 vi khuẩn / 300 vi trường = (+)
- 1-10 vi khuẩn / 1 vi trường = ( ++ )
- > 10 vi khuẩn / 1 vi trường = ( +++ ).

20


Phương pháp này vừa không đặc hiệu cho M. tuberculosis vừa không thể
phân biệt M. tuberculosis với các Mycobacterium khác.
Phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh quang được sử dụng
gần đây nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của vi khuẩn
trong các mẫu đờm. Phương pháp này được đề xuất để phát hiện sớm và
chính xác vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá thành
còn cao [29, 37].
1.3.2. Phương pháp nuôi cấy
Khi bệnh phẩm có ít vi khuẩn lao phải nuôi cấy hoặc tiêm truyền cho
chuột lang. Phương pháp tiêm truyền chỉ áp dụng trong phòng thí nghiệm để
nghiên cứu, vì tốn kém, thời gian phát hiện sau 2 – 4 tuần. Phương pháp nuôi
cấy có thể được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán lao. Tuy nhiên khi
nuôi cấy trên môi trường Lowenstein phải sau 4 – 8 tuần mới có kết quả do
M. tuberculosis sinh trưởng chậm. Môi trường nuôi cấy phải đảm bảo giàu
chất khoáng, đạm, vitamin…Các Mycobacterium không điển hình mọc nhanh
trong 1 tuần, M. tuberculosis mọc chậm hơn ở tuần thứ 3 đến tuần thứ 8.
Ngày nay với những phương pháp nuôi cấy mới như MGIT (Mycobacteria
growth indicator tube), BACTEC 460... có thể phát hiện vi khuẩn lao sớm

nhất là 12 ngày. Kĩ thuật nuôi cấy MGIT 960 được phát triển bởi Becton
Dickinson, đây là một kĩ thuật tự động sử dụng huỳnh quang. Sự phát triển
của vi khuẩn được phát hiện dựa vào việc sử dụng oxi của Mycobacterium,
điều này làm tăng khả năng phát quang của thuốc nhuộm có trong ống, qua đó
sẽ định lượng được sự phát triển của vi khuẩn thong qua mối liên hệ tuyến
tính với độ phát quang. Phương pháp này giúp phát hiện nhanh
Mycobacterium (7 đến 12 ngày). Phương pháp BACTEC là một phương pháp
tự động dựa trên việc đo lượng 14CO2 phóng xạ được giải phóng ra bởi quá

21


trình trao đổi chất của Mycobacterium từ axit palmitic đánh dấu phóng xạ 14C
(cơ chất) được thêm vào môi trường nuôi cấy Middlebrook 7H12 cải tiến. Hệ
thống này giúp phát hiện nhanh Mycobacterium từ ngày thứ 5 đến ngày thứ
10 [18, 71].
1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng nguyên kháng thể
Các kháng nguyên tự do của Mycobacterium được phát hiện trong các
loại dịch cơ thể khác nhau ở một nồng độ nhỏ nhất từ 3 đến 20 µg/ml. Các
kháng nguyên được sử dụng nhiều nhất là PPD, glycolipid, sulpholipid,
lipopolysacharide, kháng nguyên 5 (38 kDa), kháng nguyên A60, 45/47 kDa,
KP90, 30 kDa, P32, lipoarabinomannan (LAM), yếu tố thừng (cord factor trehalose-6, 6’dimycolate), và kháng nguyên phenolglycolipid-lipid. Phương
pháp phát hiện kháng nguyên M. tuberculosis bao gồm ELISA, gắn latex.
Phương pháp Dipstick phát hiện LAM ở các mẫu bệnh phẩm thuộc phổi và
ngoài phổi với độ nhậy 93% và độ đặc hiệu 95% [59, 71].
Kháng thể kháng với các kháng nguyên mycobacteria có trong mẫu
bệnh phẩm lâm sàng được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể đơn
dòng và đa dòng. TB STAT PAK là một xét nghiệm sắc ký miễn dịch có thể
phân biệt lao hoạt động và lao không hoạt động bằng cách xét nghiệm máu,
huyết tương hoặc huyết thanh. Isocitrate dehydrogenase (ICD) được mã hoá

bởi gen icd-2 của Bacille Calmette Guérin (BCG) là một chất chẩn đoán rất
nhậy trong các xét nghiệm kháng thể, hiệu quả của phương pháp này đã được
công nhận toàn cầu [59, 71].
Một số lượng lớn kháng nguyên đã được sử dụng để chẩn đoán nhưng
không một kháng nguyên đơn lẻ nào đạt được độ nhậy 100%, do đó cần phải
tập trung vào xác định sự kết hợp một cách tốt nhất các kháng nguyên để chẩn
đoán. Một số phòng thí nghiệm đã tạo ra một hỗn hợp các kháng nguyên tinh

22


sạch từ thành tế bào M. tuberculosis H37Rv kết hợp với các hạt liposome bề
mặt. Hỗn hợp này phản ứng với kháng thể đặc hiệu có trong các mẫu bệnh
phẩm lâm sàng tạo ra ngưng kết màu xanh. Xét nghiệm này phân biệt được
những người khoẻ mạnh, những người đã tiêm vaccine BCG với những bệnh
nhân có lao hoạt động. ASSURE TB rapid test (Gene labs Diagnosis Pte Ltd.,
Singapore) là một xét nghiệm sắc ký miễn dịch pha lỏng để phát hiện kháng
thể trong mẫu bệnh phẩm. Xét nghiệm sử dụng một protein gắn kháng thể kết
hợp với hạt vàng keo và một hỗn hợp các kháng nguyên mới (Mtb11, Mtb8,
Mtb48, Mtb81 và 38 kDa được cố định trên màng [71].
Tuy nhiên phương pháp này cần tập trung nhiều loại kháng nguyên vi
khuẩn lao để đạt được độ nhậy và độ đặc hiệu cần thiết và rất khó áp dụng đối
với các trường hợp số lượng bệnh phẩm ít hoặc lao ngoài phổi. Các phương
pháp tinh sạch kháng nguyên mycobacteria không được phổ biến nên thu
được các kết quả khác nhau ở các phương pháp khác nhau.
Ngoài ra còn một số phương pháp chẩn đoán khác cũng được đề cập tới
như phương pháp γ-interferon (IFN-γ), phương pháp BacT/Alert 3D. Tuy
nhiên phương pháp này chủ yếu được dùng để đánh giá mức độ sản xuất IFNγ của các tế bào T, qua đó đánh giá khả năng đáp ứng của hệ thống miễn dịch
trong quá trình điều trị lao. Ngoài ra giá thành, thời gian cũng như độ chính
xác của những phương pháp này cần xem xét lại. Do vậy chúng không được

phổ biến trong chẩn đoán lao.
1.3.4. Phương pháp γ-interferon
Kháng nguyên của M. tuberculosis là ESAT-6 được nhận biết bởi các
tế bào T ở các bệnh nhân lao nhưng không được nhận ra bởi các tế bào T ở
những người khoẻ mạnh chưa tiêm vaccine và những người đã tiêm vaccine
BCG. Mức γ-IFN trong máu ngoại vi của bệnh nhân tăng lên trong trong quá

23


trình điều trị so với các bệnh nhân chưa điều trị. Vì vậy việc phát hiện các tế
bào sản xuất γ-IFN để kiểm tra, đánh giá điều trị lao. Trong phương pháp γinterferon, các tế bào đơn nhân được kích thích in vitro và dùng ELISA đo
mức độ sản xuất γ-IFN từ các tế bào T nhạy. Độ nhậy của phương pháp này
không khác nhau nhiều trong các trường hợp lao phổi và lao ngoài phổi
(tương ứng 83% và 74%), các trường hợp soi âm tính và dương tính (tương
ứng 80% và 71%). Đây là một phương pháp hoá sinh rất tốt để xác định mức
độ hồi phục trong điều trị [70]. Tuy nhiên phương pháp này thường không
dùng để chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao mà chỉ đánh giá mức độ sản suất γIFN của các tế bào T để đánh giá khả năng đáp ứng của hệ thống miễn dịch
quá trình điều trị lao.
1.3.5. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao
1.3.5.1. Kĩ thuật PCR
Kĩ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) được phát minh bởi nhà
hóa sinh học người Mỹ Kary Mullis vào năm 1985. Đây là một kỹ thuật cho
phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu trong môi trường invitro như
trong quá trình phân bào. Kỹ thuật này đã mang lại giải Nobel hóa học cho
Kary vì những ứng dụng rộng rãi của nó trong rất nhiều lĩnh vực như khoa
học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm
bệnh…[4, 14, 16, 22, 30].
Kỹ thuật PCR sử dụng trong chẩn đoán lao cho phép phát hiện nhanh,
chính xác M. tuberculosis trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, xác định các

loài thuộc giống Mycobacterium, phát hiện tính kháng thuốc và nghiên cứu
dịch tễ học vi khuẩn lao. Để chẩn đoán lao trình tự đích được sử dụng thường
xuyên nhất là IS6110, đây là trình tự có ở hầu hết các chủng M. tuberculosis

24


complex. Ngoài ra người ta còn sử dụng các trình tự đích khác để chẩn đoán
như IS1081, 23S rDNA, 16S rDNA.
Những nghiên cứu gần đây về các yếu tố DNA lặp lại trong vi khuẩn
lao M. tuberculosis có liên quan tới sự đa dạng DNA trong nhiễm sắc thể của
vi khuẩn lao. Sự đa dạng này giúp phân biệt được các chủng lao khác nhau.
Do đó các yếu tố này rất quan trọng và cần thiết trong các nghiên cứu dịch tễ
học bệnh lao, như nghiên cứu sự lây truyền trong cộng đồng, sự bùng nổ dịch
và đặc biệt là đường lây của các chủng kháng thuốc. Có 2 dạng yếu tố lặp lại
trong vi khuẩn lao đó là:
-Yếu tố IS6110: yếu tố này có khả năng di chuyển, đoạn gen đích có chiều
dài 1300 cặp base.
-Yếu tố lặp lại trực tiếp DR
Trong 2 loại trên, yếu tố IS6110 là yếu tố được sử dụng nhiều nhất trong
các nghiên cứu dịch tễ học vì nó có ở nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau.
Kĩ thuật PCR đã được chứng minh là công cụ hữu ích trong chẩn đoán
nhanh các bệnh truyền nhiễm. Một số xét nghiệm bằng PCR sử dụng các cặp
mồi đặc hiệu loài cho phép phát hiện một loài hoặc một số loài
Mycobacterium nhất định và nó cũng hữu ích trong việc phát hiện và xác định
các loài thuộc họ Mycobacterium.
1.3.4.2. Kĩ thuật multiplex PCR
Để tăng cường khả năng chẩn đoán và vượt qua những thiếu sót của
PCR, Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên mô tả, phát triển kỹ
thuật multiplex PCR vào năm 1988. Trong kỹ thuật multiplex PCR, nhiều gen

đích được khuyếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản
ứng. Kỹ thuật multiplex PCR tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất
quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa
hình DNA, phân tích định lượng, phân tích đột biến và phát hiện RNA. Trong

25