phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ giấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ GIẤM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. HUỲNH XUÂN PHONG

NGUYỄN TRÚC VY
MSSV: 3113770
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ GIẤM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. HUỲNH XUÂN PHONG

NGUYỄN TRÚC VY
MSSV: 3113770
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014


PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. Huỳnh Xuân Phong

Nguyễn Trúc Vy

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học này, ngoài sự cố gắng của chính bản
thân tôi thì còn có sự đóng góp rất quan trọng của nhiều người, mà nếu thiếu đi sự ủng
hộ và giúp đỡ tận tình đó tôi sẽ không thể thành công trong công việc của mình.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến:
Cô Ngô Thị Phương Dung và thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất tôi có thể hoàn thành luận văn.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phạm Hồng Quang và cô Nguyễn Thị
Liên – là cố vấn học tập, người đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học
đại học.
Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh B i Hoàng Đăng
Long - c n bộ phòng thí nghiệm CNSH Thực ph m, qu Thầy Cô và anh chị c n bộ
c c phòng thí nghiệm của Viện NC PT CNSH đã h tr , đóng góp

kiến và tạo điều

kiện thuận l i để tôi thực hiện tốt đề tài luận văn.
Xin đư c gửi lời c m ơn chân thành đến tất cả c c qu Thầy Cô đã tận tình truyền
dạy cho tôi kiến th c h u ích để ph c v đề tài.
Xin chân thành cảm ơn c c anh chị học viên cao học, c c bạn sinh viên của phòng
thí nghiệm CNSH Thực ph m đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong qu trình thực hiện đề tài.
Cuối c ng tôi xin bày t lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về m t vật chất c ng như tinh thần trong suốt thời
gian qua để tôi v ng tin thực hiện đề tài.
Tôi xin kính chúc đến qu Thầy Cô c ng c c bạn sinh viên luôn dồi dào s c
kh , công t c tốt.
Nguyễn Trúc Vy

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC
Vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt là những vi sinh vật đang rất được quan tâm hiện
nay vì chúng có khả năng lên men ở điều kiện nhiệt độ cao giúp tăng hiệu suất quá
trình lên men và giảm chi phí điều nhiệt. Mục tiêu của đề tài là phân lập và tuyển chọn
được các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt độ cao từ nguồn nguyên liệu là giấm
ăn. Giấm ăn là một chất lỏng có chứa thành phần chính là acid acetic, một sản phẩm
lên men chính của vi khuẩn acid acetic. Tổng cộng đã thu 15 mẫu giấm ăn, kết quả đã

phân lập được 27 chủng vi khuẩn acid acetic. Kết quả phân loại của 27 chủng, giống
Acetobacter là 24 chủng và 3 chủng thuộc giống Gluconobacter. Sơ tuyển được 8
chủng (BD1.1, BD1.3, CTI2.3, ĐTIII1, KG1, ST1.1, ST1.2 và ST2.2) có khả năng sinh
acid mạnh (đường kính vòng phân giải >20 mm). Về khả năng chịu acid acetic, tất cả
các chủng đều phát triển được ở 0,5%, ở 1% chỉ có 8 chủng phát triển được, ở 1,5 %
có 2 chủng (BD1.1 và ST1.1), 2% còn duy nhất 1 chủng (ST1.1). Thử nghiệm khả năng
chịu nhiệt, ở 30oC và 37oC, tất cả các chủng đã phân lập đều phát triển tốt, nhưng
nhiệt độ càng tăng, khả năng phát triển của các chủng càng giảm. Ở 43oC, chỉ có 8
chủng phát triển (BD1.1, BD1.3, CTI2.3, ĐTIII1, KG1, ST1.1, ST1.2 và ST2.2) và ở
45oC, 2 chủng ĐTIII1 và ST2.2 vẫn phát triển tốt. Kết quả, đã tuyển chọn được 8
chủng để tiếp tục thử nghiệm khả năng lên men acid acetic ở các nhiệt độ khác nhau
(30oC, 37oC, 38oC và 39oC). Khi lên men trên môi trường YPGD bổ sung 4% ethanol
cho thấy 2 dòng KG1 và ST2.2 phát triển và sinh acid tốt hơn so với 6 chủng còn lại.
Nồng độ acid khi lên men ở 37, 38 và 39oC đạt lần lượt là 0,6% w/v, 1,8% w/v và
2,16% w/v đối với chủng KG1 và 0,84% w/v, 4,84% w/v và 5,04% w/v đối với chủng
ST2.2. Kết quả, tuyển chọn được 2 chủng AAB là KG1 và ST2.2 có khả năng chịu nhiệt
tốt nhất so với những dòng đã được phân lập.
Từ khóa: Acetobacter, chịu nhiệt, giấm, Gluconobacter, lên m n acid ac tic, vi khu n
acid acetic

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................................i
TÓM LƯỢC .................................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................... vii
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................... 3
2.1 Quá trình lên men từ Vi sinh vật ........................................................................... 3
2.1.1. Bản chất của qu trình lên m n từ vi sinh vật ................................................ 3
2.1.2. C c yếu tố chính ảnh hưởng đến qu trình lên men....................................... 4
2.2 Sơ l

c về giấm ăn ..................................................................................................4

2.2.1. Giấm ăn .......................................................................................................... 4
2.2.2. Quy trình lên m n giấm.................................................................................. 6
2.3 Acid acetic ................................................................................................................ 8
2.3.1. Giới thiệu chung về acid ac tic ...................................................................... 8
2.3.2. Bản chất của qu trình lên m n acid ac tic .................................................... 8
2.3.3. Cơ chế phản ng của qu trình lên m n acid ac tic ....................................... 9
2.3.4. C c yếu tố ảnh hưởng đến qu n trình lên m n acid ac tic........................... 10
2.4 Vi khuẩn acid acetic .............................................................................................. 11
2.4.1. Đ c điểm vi khu n acid ac tic ..................................................................... 11
2.4.2. Một số loài vi khu n acid ac tic

nghĩa ...................................................... 12

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
3.1 Ph ơng tiện nghiên cứu ........................................................................................ 15
3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................... 15
3.1.2 Nguyên liệu .................................................................................................. 15
3.1.3 Thiết bị - d ng c và hóa chất ...................................................................... 15
3.2 Ph ơng pháp nghiên cứu...................................................................................... 16
3.2.1 Phân lập c c chủng vi khu n acid ac tic ...................................................... 16

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

3.2.2 X c định hình th i, sinh l , sinh hóa c c chủng vi khu n acid ac tic .......... 16
3.2.3. Sơ tuyển c c chủng vi khu n có khả năng sinh acid ac tic ......................... 18
3.2.4. Khảo s t khả năng chịu acid ac tic của AAB .............................................. 18
3.2.5 Khảo s t khả năng chịu nhiệt của vi khu n acid ac tic ................................ 19
3.2.6 Tuyển chọn vi khu n acid ac tic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh ... 19
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 20
4.1 Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic ............................................................ 20
4.2 Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic .............. 21
4.2.1. X c định hình th i ........................................................................................ 22
4.2.2. X c định sinh l , sinh hóa ............................................................................ 24

4.2.3. Phân loại ....................................................................................................... 25
4.3 Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic ............................... 26
4.4 Khảo sát năng khả năng chịu acid acetic của các chủng acid acetic ................ 29
4.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic .................................... 30
4.6 Tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh ....... 32
CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ VÀ KẾT LUẬN ............................................................. 40
5.1 Kết luận .................................................................................................................. 40
5.2 Đề nghị.................................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 41
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 0

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Nh ng đ c điểm kh c biệt gi a c c loài Acetobacter ...................................... 14
Bảng 2. Kết quả phân lập vi khu n acid ac tic (AAB) ................................................. 21
Bảng 3. Hình dạng, kích thước khu n lạc và tế bào vi khu n ....................................... 22
Bảng 4. Đ c điểm sinh l , sinh hóa của c c chủng AAB .............................................. 24
Bảng 5. Kết quả phân loại và đường kính v ng s ng vàng của AAB ........................... 27
Bảng 6. Kết quả phân loại và đường kính v ng s ng vàng của AAB đư c lựa chọn ... 28
Bảng 7. Kết quả khả năng sinh acid ac tic ở c c nồng độ acid ac tic kh c nhau ......... 30

Bảng 8. Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của c c chủng AAB ........................ 32
Bảng PL1. Kết quả thống kê hàm lư ng acid (% w/v) khi lên m n 30o C.................. PL2
Bảng PL2. Kết quả thống kê hàm lư ng acid (% w/v) khi lên m n 37 o C.................. PL6
Bảng PL3. Kết quả thống kê hàm lư ng acid (% w/v) khi lên m n 38 o C................ PL10
Bảng PL4. Kết quả thống kê hàm lư ng acid (% w/v) khi lên m n 39o C................ PL13
Bảng PL5. Mô tả khu n lạc và hình dạng vi khu n của c c chủng AAB ................ PL16
Bảng PL6. X c định sinh l , sinh hóa của c c chủng AAB ..................................... PL17
Bảng PL7. Phân loại và sơ tuyển chủng AAB có khả năng sinh acid ...................... PL18
Bảng PL8. Kết quả thí nghiệm khả năng chịu acid ac tic ........................................ PL19
Bảng PL9. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của c c chủng AAB ........................... PL20
Bảng PL10. Mật số (OD550nm) của 8 chủng AAB lên m n 7 ngày ở nhiệt độ 30oC,
37oC, 38oC và 39oC ................................................................................. PL21
Bảng PL11. Hàm lư ng acid hình thành của 8 chủng AAB ở c c nhiệt độ 30OC, 37oC,
38oC và 39oC ........................................................................................... PL22

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Qu trình oxy ho rư u thành acid ac tic ........................................................... 9
Hình 2 . Acetobacter aceti ............................................................................................. 13
Hình 3. Acetobacter xylinum ........................................................................................................ 13

Hình 4. Khu n lạc tạo vòng halo trên môi trường (a và b), môi trường đối ch ng có
CaCO3 (c) và không có CaCO3 (d) ................................................................................ 20
Hình 5. Biến đổi của môi trường chỉ thị (a và b) ........................................................... 26
Hình 6. Biến đổi môi trường chất chỉ thị (a và b), môi trường đối ch ng (c) ............... 26
Hình 7. Sự ph t triển của c c chủng vi khu n trên môi trường YPGD bổ sung 1,0%
acid ac tic (a, b, c, d và ) ............................................................................................. 29
Hình 8. Sự ph t triển của c c chủng vi khu n trên môi trường YPGD bổ sung 1,5% và
2,0% acid acetic ............................................................................................................. 29
Hình 9. Sự ph t triển của c c chủng vi khu n trên môi trường YPGD ở c c nhiệt độ
kh c nhau ....................................................................................................................... 31
Hình 10. Sự ph t triển của 8 chủng AAB ở 30oC .......................................................... 34
Hình 11. Hàm lư ng acid sinh ra của 8 chủng AAB ở 30oC......................................... 34
Hình 12. Sự ph t triển của 8 chủng AAB ở 37oC .......................................................... 35
Hình 13. Hàm lư ng acid sinh ra của 8 chủng AAB ở 37oC......................................... 36
Hình 14. Sự ph t triển của 8 chủng AAB ở 38oC .......................................................... 37
Hình 15. Hàm lư ng acid sinh ra của 8 chủng AAB ở 38oC......................................... 37
Hình 16. Sự ph t triển của 8 chủng AAB ở 39oC .......................................................... 38
Hình 17. Hàm lư ng acid sinh ra của 8 chủng AAB ở 39oC......................................... 39

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

CÁC TỪ VIẾT TẮT

A.

Acetobacter

AAB

Acetic Acid Bacteria

et al.

Et alia

G.

Gluconobacter

NADH

Nicotinamide adenin dinucleotide photphate

PL

Ph l c

YPGD

Yeast Polypepton Glycerol D-Glucose

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Acid ac tic đư c ng d ng nhiều trong công nghiệp: công nghiệp tổng h p h u
cơ, công nghệ thực ph m, công nghệ chế biến mủ cao su và muối chua rau quả. Acid
ac tic thường đư c sản xuất th o phương ph p tổng h p và phương ph p sinh học.
Tuy nhiên, lư ng acid ac tic đư c sản xuất th o phương ph p sinh học chỉ chiếm 10%
sản lư ng thế giới.
Acid ac tic là thành phần chủ yếu có trong giấm. Giấm ăn đư c d ng trong công
nghệ thực ph m để bảo quản th c ăn, chế biến đồ hộp, rau quả và gia vị,… do đó, việc
sử d ng giấm ăn không chỉ mang tính chất thủ công mà đã trở thành ngành công
nghiệp ở nhiều nước trên thế giới.
Acid ac tic có t c d ng chống đông mủ cao su trong công nghiệp chế biến mủ
cao su. Thông thường, người ta sẽ sử d ng dung dịch acid ac tic 2,5% với 3,5-10 tấn
dung dịch mủ cao su. Ở Việt Nam, tuy ngành tổng h p h u cơ còn non trẻ nhưng nhu
cầu sử d ng acid ac tic trong đời sống và trong hoạt động công nghiệp rất lớn.
Ngày nay, vì l i nhuận mà người ta sản xuất giấm bằng phương ph p tổng h p
hóa học với tên gọi là “giấm ăn”. Do một lít giấm nuôi đắt gấp 10 lần so với một lít
giấm tổng h p hóa học. Vì l do là để sản xuất giấm bằng phương ph p h u cơ thì tốn

nhiều thời gian và độ chua không cao nên ít người sử d ng. tuy nhiên, trong giấm hóa
học ngoài ch a thành phần chính là acid ac tic, còn ch a nhiều thành phần ph gây
ung thư: acid formic, methanol, methylacetace,… Còn giấm nuôi đư c coi là thực
ph m an toàn vì ngoài thành phần chính là acid ac tic, nó còn ch a một số vitamin và
acid amin cần thiết.
Bên cạnh đó, Việt Nam nằm trong v ng nhiệt đới, có khí hậu nóng m, nhiệt độ
quanh năm kh cao. Nh ng năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu là một thử
th ch trong việc lên m n thực ph m vì nh ng hệ thống làm lạnh tiêu tốn kh nhiều
năng lư ng ở việc gi nhiệt độ. Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn đư c nh ng
chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên c u.
Và như chúng ta đã biết thì acid ac tic là thành phần chủ yếu của giấm, nhưng nh ng
nghiên c u gần đây cho thấy (Huỳnh Xuân Phong, 2011 và Đ ng Thị Th y Vân, 2009)
AAB đư c phân lập từ nhiều nguồn kh c nhau (sản ph n lên m n, tr i cây chín, hoa
cây ăn quả,…) và số lư ng mẫu giấm đư c phân lập còn hạn chế. Do đó chúng tôi đề

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

nghị đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ giấm”, với
m c tiêu sẽ sưu tập đư c một số chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt có khả năng lên
m n acid ac tic tốt, góp phần bổ sung vào nguồn giống vi sinh vật bản địa có đ c tính
tốt. Qua đó có thể tiến tới một quy trình sản xuất giấm hoàn chỉnh hơn và c c sản ph n

lên m n từ AAB mang lại hiệu quả kinh tế cao.
1.2 Mục tiêu đề tài
Đề tài nhằm m c tiêu phân lập và tuyển chọn đư c c c chủng vi khu n acid
ac tic chịu nhiệt từ giấm ăn có khả năng lên m n ac tic.
Nội dung thực hiện:
- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khu n có khả năng sinh acid acetic.
- X c định hình th i, sinh l , sinh hóa của vi khu n.
- Tuyển chọn c c chủng vi khu n acid ac tic chịu nhiệt, sinh acid mạnh.
- Khảo s t khả năng chịu acid ac tic của AAB.
- Khảo s t khả năng lên m n ở c c m c nhiệt độ kh c nhau của c c chủng vi khu n
acid acetic đư c tuyển chọn.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Quá trình lên men từ Vi sinh vật
2.1.1. Bản chất của quá trình lên men từ vi sinh vật
Công nghệ lên m n từ vi sinh vật là công nghệ vi sinh và c ng chính là một trong
c c ngành quan trọng của công nghệ sinh học. Công nghệ lên m n vi sinh là một qu
trình đư c ng d ng nhiều trong sản xuất tạo ra c c sản ph m bằng kỷ thuật lên m n
với sự tham gia của c c chủng vi sinh vật kh c nhau.

Qu trình lên m n là một qu trình sinh học diễn ra liên t c, bắt đầu từ khâu tạo
giống, nhân giống sinh khối, lên m n và thu nhận sản ph m cuối c ng và c c giai đoạn
này có liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng lại lẫn nhau và hàng loạt c c phản ng
sinh hóa diễn ra với sự tham gia xúc t c của c c hệ nzym vốn đư c sinh ra từ c c
chủng vi sinh tham gia trong qu trình.
Bản chất của công nghệ lên m n là nh ng phản ng oxy hóa khử sinh học, oxy
hóa c c h p chất h u cơ do c c hệ nzym oxy hóa khử của vi sinh vật. C c qu trình
này diễn ra trong điều kiện yếm khí ho c hiếu khí. Lên m n yếm khí là qu trình biến
đổi đường hay c c chất ph c tạp thành c c chất đơn giản dưới t c d ng của nzym vi
sinh vật trong điều kiện không có sự tham gia của oxy, ví d lên m n acid lactic hay
lên m n butylic. Lên m n hiếu khí là qu trình phân giải đường có sự tham gia của oxy
không khí và sản phản cuối c ng của qu trình oxy hóa là CO 2 và H2O.
T y th o hệ nzym tham gia vào qu trình lên m n và t y thuộc vào chủng vi
sinh vật mà người ta chia qu trình lên m n thành 3 nhóm chính:
- Lên m n nhờ vi khu n như lên m n acid ac tic, acid latic, rư u butylic,…
- Lên m n nhờ nấm mốc như lên m n acid citric, gluconic, p nicillin,…
- Lên mên nhờ nấm m n như lên m n bia, rư u, m n b nh mì,…
Công nghệ lên m n thường đư c chia thành 3 giai đoạn: (1) giai đoạn gi giống
gốc, nhân giống sinh khối và giống cung cấp cho sản xuất; (2) giai đoạn lên m n và (3)
giai đoạn thu nhận sản ph m lên m n và c c sản ph m ph (Trần Minh Tâm, 2000).
C c qu trình lên m n và c c qu trình diễn ra ph c tạp, có nhiều sản ph m trung gian
đư c hình thành và t y vào điều kiện mà qu trình xảy ra th o nhiều hướng kh c nhau
và hầu hết đề thải năng lư ng. Nh ng vi sinh vật tham gia trong qu trình lên m n
muốn sinh trưởng và ph t triển đều cần năng lư ng đư c thải ra do qu trình oxy hóa
khử và phân hủy c c chất trong qu trình lên m n.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.2. Các yếu tố chính ảnh h ởng đến quá trình lên men
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: M i vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự ph t
triển của chúng. Đối với chủng ưa nhiệt trung bình thì nhiệt độ thích h p cho sự ph t
triển sinh khối và lên m n là 30-32oC. Ở nh ng nhiệt độ không thích h p, hoạt tính
nzym giảm hẳn và đôi khi xảy ra hiện tư ng lên m n ph ph c tạp.
- Ảnh hưởng của pH: Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến
hoạt động của vi sinh vật. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích c c chất của v tế
bào, làm tăng ho c giảm m c độ th m thấu c c chất dinh dưỡng c ng như chiều hướng
của qu trình lên m n. Đối với vi khu n lactic, khi pH nh hơn 4 thì vi khu n ngừng
hoạt động trong khi nấm m n vẫn hoạt động bình thường và ph t triển mạnh. C c loài
vi khu n, xạ khu n, nguyên sinh động vật ph t triển thích h p ở pH từ 6,5-7,5; nấm
m n và nấm mốc ph t triển thích h p ở pH 3,0-6,0. Trong khi đó vi khu n acid ac tic
chịu đư c acid cao, một số vẫn ph t triển ở pH = 3,2 ( Lương Đ c Ph m, 1998).
- Ảnh hưởng nồng độ dịch lên m n: Nồng độ dịch lên m n là cơ chất của qu
trình lên m n. Nếu nồng độ đường qu cao sẽ dẫn đến làm tăng p suất th m thấu và
làm mất cân bằng trạng th i sinh l của vi sinh vật. Bình thường dịch lên m n có nồng
độ chất tan từ 16-18%, tương đương với khoảng 15% đường đối với qu trình lên m n
rư u và khoảng 10% đường đối với qu trình lên m n acid ac tic.
2.2 Sơ l

c về giấm ăn

2.2.1. Giấm ăn

Giấm là một chất l ng có tính acid sản xuất từ sự lên m n của thanol, giấm
đư c làm từ sự lên m n của c c chất có ch a tinh bột và đường, thanol là kết quả đầu
tiên của qu trình lên m n đường sau đó bị oxy hóa thành acid ac tic bởi vi khu n acid
acetic. Vi khu n Acetobacter là t c nhân chính trong qu trình lên m n acid acetic, m i
thơm đ c trưng, màu trắng đ c ho c hơi vàng, giấm có pH từ 2,4-3,4, chủ yếu là acid
acetic, ngoài ra còn ch a một ít đường, prot in,…
Giấm ăn là một chất l ng có vị chua ch a 3% acid ac tic, đư c hình thành từ sự
lên m n của ethanol (C2H5OH). Từ xưa, giấm đã là một nhân tố quan trọng và đư c sử
d ng rộng rãi trong m thực, nội tr và ngày nay giấm còn đư c sử d ng như là một
loại dầu, k m làm trắng da, mư t tóc cho ph i đẹp và đư c sử d ng rộng rãi hơn ph t
triển th o nhu cầu ngày càng cao của con người.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

Giấm gạo hay còn gọi là giấm cất, d ng lương thực, ngủ quả, đường làm nguyên
liệu chính nhờ qu trình lên m n của vi khu n acid acetic. Thành phần dinh dưỡng bao
gồm đường, acid acetic, acid h u cơ, vitamin và muối vô cơ,… rất tốt cho việc tiêu
hóa của cơ thể. T y th o v ng nguyên liệu ở m i nước kh c nhau sẽ cho ra c c loại
giấm mang hương vị đ c trưng từng v ng miền.
Giấm pha chế hay còn gọi là giấm hóa học đư c sản xuất dựa trên nguyên liệu
chính là acid acetic tinh luyện, pha thêm nước mà thành, không có thêm thành phần

dinh dưỡng kh c loại này thường d ng trong công nghiệp luyện kim ho c s t khu n,…
T y th o nhu cầu sử d ng giấm kh c nhau mà người ta chia :
- Giấm dùng để nấu nướng: ch a acid acetic 4-5%, có vị nồng, thơm dịu, t y m i
tanh của c , giúp tươi thịt, c c hải sản.
- Giấm ăn với cơm và rau trộn: Độ acid acetic 3-4%, vị ngọt, thơm thích h p cho
trộn rau, nước chấm, ăn với phở, mì quảng, điểm tâm,…
- Loại bảo vệ sứ khỏe: Acid acetic khoảng 1-2%, kh u vị kh ngon, m i khi làm
về mệt ho c học hành mệt m i thì pha giấm với đường, thêm đ lạnh vào uống sảng
kho i, giải kh t, rất tốt cho s c kh .
* Các thành phần dinh dưỡng có trong giấm
- Số acid amin phong phú: Gồm 18 loại acid amin mà cơ thể không tổng h p
đư c thì đều có trong giấm, có 8 loại acid amin thực vật cung cấp, còn lại là sinh ra
trong qu trình lên m n.
- Do giấm có vị ngọt thanh nên giấm trở nên đều h p ng vị giúp cơ thể hấp th
dễ tiêu hóa th c ăn, kích thích hệ m n đường ruột hoạt động tốt hơn.
- Trong giấm còn có các vitamin B1, B2, C,… bắt nguồn từ kết quả trao đổi chất
vi sinh vật trong qu trình lên m n th c ăn và nguyên liệu. Một số sinh tố dinh dưỡng
loại này tạo thành m n ph của một số m n trong qu trình trao đổi chất của cơ thể.
- Thành phần muối vô cơ có trong giấm rất phong phú như Na, K, Ca, F , Cu,
Zn,… một số kho ng chất lấy từ nguyên liệu giấm, đồ ch a th c ăn trong qu trình
trao đổi chất hay tăng thêm do người gia công thêm vào. Nh ng nguyên tố đó giúp cho
giấm tăng thêm hương vị, cân bằng môi trường kiềm, acid trong cơ thể.
- Các nguyên tố vi lượng Ca, Fe, Cu, P,… giúp qu trình lão hóa, già yếu giảm,
là thành phần không thể thiếu trong qu trình trao đổi chất, vận chuyển O 2 vào m u đi
nuôi cơ thể.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.2. Quy trình lên men giấm
Qu trình sản xuất giấm ăn hay lên m n ac tic gồm có nh ng giai đoạn sau:
1) Chu n bị môi trường,

2) Lên m n,

3) Hoàn thành ph m.

Nguyên liệu d ng để sản xuất là c c loại nước quả (chưa ho c đã lên m n rư u),
rư u và bia kém ph m chất, c c loại dịch đường, nhưng chủ yếu vẫn là c c loại rư u.
Trong đó, nước nho và rư u nho là nguyên liệu sản xuất giấm có chất lư ng cao. Rư u
tylic là nguồn nguyên liệu đư c d ng phổ biến trong công nghiệp lên m n acetic. C c
loại quả chín đư c ép lấy nước và c c loại dịch đường có lẫn nấm m n rư u sẽ xảy ra
qu trình lên m n rư u, biến c c loại đường thành rư u tylic và thu đư c dịch rư u
nhẹ. C ng có trường h p người ta bổ sung nấm m n Saccharomyces vào c c loại dịch
trên trước khi làm giấm. Qu trình lên m n rư u tư nhiên (ho c có thêm rư u nhẹ) kéo
dài 2-3 tuần, x c m n lắng xuống phía dưới và ta gạn lấy dịch trong có nồng độ rư u
thấp để cho lên m n ac tic.
Nồng độ rư u thích h p cho lên m n acetic là 10-13%, trường h p cao hơn sẽ c
chế giống vi khu n acetic ph t triển và một phần rư u không bị oxy hóa thành giấm,
còn trường h p rư u qu thấp sẽ xảy ra hiện tư ng oxy hóa triệt để biến giấm thành
CO2 và nước. Trong môi trường dinh dưỡng, ngoài rư u tylic, cần phải có đủ c c chất
đảm bảo cho vi khu n sống và hoạt động, gồm có c c nguồn cacbon, nitơ, c c chất

kho ng: K, Mg, Ca, F , P, S,…
Nguồn carbon ở đây có thể là đường, nguồn nitơ là c c acid amin, peptone ho c
muối amonium. C c chất kho ng d ng ở dạng muối vô cơ ho c h p chất h u cơ. Nước
mạch nha, bia, nước hoa quả, dịch nấm m n,… là nh ng nguồn dinh dưỡng rất tốt đối
với vi khu n acetic. Nhưng sử d ng c c nguồn này phải c n thận, vì d ng với liều
lư ng cao sẽ làm cho vi khu n ph t triển mạnh, kém khả năng lên m n ho c tạo điều
kiện cho c c vi sinh vật kh c ph t triển.
Trong sản xuất người ta thường d ng môi trường có thành phần như sau: c 100
lít cồn tuyệt đối thêm 25 g sup rphotphate, 25 g amonium sulfate, 0,9 g kali carbonate,
500 g glucose ho c dịch đường thủy phân từ tinh bột tương đư ng với lư ng đường
glucos . Có thể d ng saccharose thay cho glucos . Nước pha thành 800-1000 lít môi
trường.
Vi khu n acid ac tic thường tiêu hóa rất ít c c chất dinh dưỡng. Để có đư c giấm
có chất lư ng cao và tr nh hiện tư ng nhạt ở phoi bào cần phải bổ sung c c chất dinh

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

dưỡng làm nhiều lần, nhưng m i lần với lư ng thấp. Nếu trường h p lên m n bị yếu,
thì có thể bổ sung vào môi trường dịch malt ho c bia.Môi trường nhân giống ho c lên
m n cần đư c acid hóa bằng chính acid acetic nhằm kích thích giống ph t triển và c
chế c c vi khu n kh c.

Trong qu trình lên m n nhanh có thể d ng hệ vi khu n ac tic thuần khiết tự
nhiên, có nghĩa là lúc đầu tạo điều kiện cho một số loài c ng một nhóm nhiễm từ
không khí ph t triển luôn luôn ở môi trường acid ac tic. Nhưng trong sản xuất còn
d ng c c chủng thuần khiết và thu đư c hiệu quả cao. C c chủng thường d ng là
Acetobacter schiitzenbachii ho c Acetobacter curvum 86 và 96. Trước khi cho lên m n
ở th ng lớn cần phải nhân giống ở bình tam gi c và th ng nh . Trong bình tam gi c có
dịch đường nồng độ 5-6oBx và 3-5% rư u. Th ng nhân giống có cấu tạo giống th ng
lên m n nhưng nh hơn. C c phoi bào đã vô tr ng trong th ng nhân giống đư c acid
hóa bằng acid ac tic 6-9%. C ch làm như sau: trong th ng nh xếp c c phoi bào đã
đư c nấu sơ bộ đã diệt tr ng, rồi t m ướt phoi bào bằng dung dịch acid acetic. Thanh
tr ng th ng có phoi bào ở nồi hấp 1 atm trong 30 phút. Làm nguội tới 30oC, cấy giống
từ bình tam gi c sang. Sau khi cấy giống người ta đổ vào th ng nhân giống h n h p
6% acid ac tic và 3% rư u tylic. Nuôi ở 30oC khoảng 5-7 ngày. Sau đó chuyển dịch
giống sang th ng lên m n. Trước khi cấy chuyền giống này, th ng lên m n đư c rửa
sạch, xếp phoi bào và cho hơi nóng đi qua, rồi thấm ướt phoi bào bằng dung dịch acid
ac tic 6%, hấp ở 70oC trong 15 phút. Phương ph p lên m n nhanh với chủng thuần
khiết có nhiều ưu điểm: Qu trình lên m n ngắn ngày, dễ kiểm tra, gi thành hạ.
Trong qu trình sản xuất nếu lên m n liên t c không nghỉ thì có thể không phải
nhân giống lại. Ở c c th ng lên m n chậm khi đạt đư c độ chua của giấm cần thiết,
người ta rút dịch ra kh i th ng và lại cho thêm dịch mới. Trong khi thao t c không làm
vỡ v ng c i giấm. C c th ng lên m n nhanh chúa c c phoi bào đã t m acid acetic cho
phun m dịch rư u nhạt chảy từ trên xuống và thổi khí từ đưới lên liên t c, không phải
nhân giống lại mà hiệu suất m n vẫn bảo đảm. Ở đây cần chú

qu trình thổi khí phải

liên t c không đựơc gi n đoạn.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

2.3 Acid acetic
2.3.1. Giới thiệu chung về acid acetic
Acid ac tic có công th c phân tử là CH3COOH, là một acid h u cơ (acid
carboxylic), mạnh hơn acid carbonic. Phân tử gồm có nhóm m thyl (-CH3) liên kết với
nhóm carboxyl (-COOH), khối lư ng phân tử 60,5 kg/kmol.
Acid ac tic là một chất l ng không màu, có m i sốc, vị chua, có khả năng hút m
từ không khí. Nhiệt độ nóng chảy ở 16,63oC, nhiệt độ sôi 118oC, tỷ trọng 1,049; độ
nhớt ở 20oC là 1,21.10-3 Ns/m2.
Trong dung dịch acid ac tic tồn tại c c dạng (CH 3COOH)2, (CH3COOH)3, sự tồn
tại c c phân tử kép như trên là do c c liên kết hydro gi a c c phân tử với nhau.
Acid ac tic tan trong nước và c c dung môi thường (rư u ac tone, ethanol, eter,
chloroform,…) với bất kỳ tỷ lệ nào, chúng hoàn toàn không tan trong CS 2. Ngoài ra nó
c ng là dung môi tốt cho nhiều h p chất h u cơ (nhựa, tinh dầu,...) Đ c biệt acid
ac tic hoà tan tốt ngay cả c llulos và c c h p chất của nó. Acid ac tic rất bền với c c
chất oxy ho như acid chromic, p rmanganate. Acid ac tic có t c d ng phân huỷ da,
gây b ng, ăn mòn nhiều kim loại và h p kim, hoà tan tốt nhiều chất vô cơ.
Acid ac tic là một loại acid h u cơ đư c ng d ng rộng rãi trong đời sống và
trong sản xuất công nghiệp Trong công nghệ thực ph m, với hàm lư ng 2-5%, người
ta gọi dung dịch này là giấm ăn. Giấm ăn đư c sử d ng trong công nghệ thực ph m để
chế biến đồ hộp, rau quả, gia vị trong c c b a ăn gia đình. Lư ng giấm ăn sử d ng
trong công nghiệp thực ph m là rất lớn, do đó việc sản xuất giấm ăn không thể mang

tính chất thủ công truyền thống mà đã trở thành một ngành sản xuất th o quy mô công
nghiệp ở nhiều nước trên thế giới.
2.3.2. Bản chất của quá trình lên men acid acetic
Lên m n acid ac tic là qu trình oxy ho cồn thành acid ac tic nhờ vi khu n acid
ac tic trong điều kiện hiếu khí. Mọi qu trình muốn hoạt động đư c đòi h i phải có
năng lư ng, để thực hiện đư c c c hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và ph t
triển thì vi sinh vật cần phải có năng lư ng.
Qu trình lên m n là qu trình oxy ho khử sinh học để thu năng lư ng và c c
h p chất trung gian cho tế bào sinh vật nhưng tế bào sống chỉ sử d ng năng lư ng
dưới dạng ho năng tàng tr trong mạch carbon và đư c phóng ra do sự chuyển
l ctron từ m c năng lư ng này sang m c năng lư ng kh c.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

C c phản ng sinh ho xảy ra trong c c qu trình lên m n là nh ng phản ng
chuyển hydro nhưng sự chuyển hydro c ng tương đương với sự chuyển l ctron vì
nguyên tử hydro có thể t ch thành proton H+ và l ctron. C c nzyme xúc t c qu trình
t ch nguyên tử hydro kh i cơ chất gọi là nzym d hydrog nas .
Trong qu trình lên m n giấm, rư u tylic đư c oxy ho thành acid ac tic. Ở đây
sự chuyển hydro đư c thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP (Nicotinamid ad nin
dinucleotide phosphate dạng oxy ho ). Hydro đư c NADP nhận (trở thành NADPH 2)

đư c chuyển qua chu i hô hấp để thu năng lư ng, song cơ chất không bị phân giải
hoàn toàn nên đư c gọi là qu trình oxy ho không hoàn toàn.
2.3.3. Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic
Vi khu n giấm, còn gọi là vi khu n acid ac tic, đư c đ c trưng bởi khả năng
chuyển đổi rư u thyl (C2H5OH) thành acid acetic (CH3CO2H) bởi qu trình oxy hóa
như dưới đây;
2C2H5OH  2CH3CHO  2CH3CO2H + 2H2O
Hầu hết c c chủng vi khu n giấm có thể bị oxy hóa acid ac tic thành CO2 và
H2O (San Chiang Tan, 2005)
CH3COOH + 2O2 = 2CO2 + 2H2O
Đây chính là sự “qu oxy ho ” rất có hại cho qu trình lên m n giấm. Vì vậy,
trong dịch lên m n phải còn dư một lư ng rư u khoảng 0,3-0,5% để đảm bảo không
bao giờ cho oxy ho hết rư u nhằm tr nh hiện tư ng “qu oxy ho ”.

Hình 1. Quá trình oxy hoá r

u thành acid acetic

(*Nguồn: Kehrer, 1921)

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.4 Các yếu tố ảnh h ởng đến quán trình lên men acid acetic


Ảnh hưởng của oxy (sự thoáng khí)

Th o cơ chế phản ng, ta nhận thấy phản ng giấm hóa là phản ng oxy hóa
trong đó oxy đóng vai trò nhận hydro nên sự có m t của oxyl đóng vai trò quan trọng
trong qu trình lên m n:
Phương trình tổng qu t: C2H5OH + O2  CH3COOH + H2O +117Kcal
Ta thấy về m t l thuyết, để oxy hóa hết 1 mol rư u thì cần 1 mol oxy tự do, t c
là để oxy hóa hết 1kg rư u than cần 2,3 m3 không khí ở điều kiện tiêu chu n. Trong
sản xuất, điều kiện tho ng khí càng tốt thì qu trình lên m n càng nhanh. Trong
phương ph p chậm, dịch lên m n tiếp xúc với không khí và hấp th oxy qua bề m t
tho ng. Do hạn chế của bề m t tiếp xúc nên phương ph p này chậm, năng suất thấp.
Trong phương ph p nhanh, do đư c bổ sung c c vật liệu xốp (v bào, than g ,
cốc,…) nên làm tăng bề m t tiếp xúc gi a môi trường dinh dưỡng và không khí, cải
thiện điều kiện không khí do đó thúc đ y qu trình lên m n. Ở phương ph p chìm thì
người ta s c khí mạnh liên t c qua dung dịch lên m n nhờ đó đã phân t n đều không
khí vào môi trường lên m n, tạo nên bề m t tiếp xúc pha lớn làm tăng qu trình lên
men. Như vậy, phương ph p nào tạo đư c bề m t tiếp xúc pha gi a không khí và dịch
lên m n lớn hơn sẽ là phương ph p có hiệu quả và năng suất cao hơn.


Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự ph t triển của vi sinh vật và
hiệu quả lên m n. Vì vậy, trong thực tế sản xuất, người ta sử d ng yếu tố này đề điều
chỉnh vận tốc phản ng. Nhiệt độ thích h p để vi khu n giấm sinh trưởng và ph t triển
đối với m i loài vi khu n kh c nhau.

- Vi khu n Acetobacter aceti ph t triển tốt trong khoảng 25-30oC.
- Vi khu n Acetobacter schuitzenbachi ph t triển tốt ở nhiệt độ lớn nhất 29oC.
- Đối với vi khu n Acetobacter kutzingianum lại ph t triển tốt ở khoảng 35-37oC.
Nhìn chung, khoảng nhiệt độ để c c vi khu n giấm tồn lại và ph t triển kh rộng
từ 15-34oC. Tuy nhiên cần lưu

nếu nhiệt độ qu thấp thì tốc độ qu trình lên m n sẽ

chậm. Ngư c lại, khi nhiệt độ qu cao sẽ làm tổn thất do bay hơi rư u, acid ac tic. Do
đó nhiệt độ thích h p cho qu trình sản xuất giấm là 30-34oC.


Nồng độ acid acetic

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

Môi trường acid (pH=3) là điều kiện thuận l i đối với vi khu n acid ac tic. Acid
ac tic tích t trong môi trường đến một m c độ nào đó sẽ c chế hoạt động của chính
vi khu n. Khi dung dịch tích t đư c 8% acid ac tic thì hoạt động của c c vi khu n trở
nên ngày càng giảm dần và ngừng hoạt động khi lư ng acid đạt đư c 12-14%.


Nồng độ ethanol

T y từng loài mà chúng có khả năng tồn tại, thường người ta sử d ng nồng độ
rư u 6-14%. Nếu trong môi trường không còn rư u thì vi khu n tiếp t c oxy hóa acid
ac tic để tiếp t c thu năng lư ng d ng trong sự sống, vì thế đây là một qu trình có
hại. Trong sản xuất người ta thường để lại trong môi trường sau lên m n độ rư u 0,30,5%. Dir s (1973) cho rằng lư ng rư u sót trong giấm có t c d ng c chế sự tổng h p
nzym oxy hóa acid ac tic và muối ac tate.
2.4 Vi khuẩn acid acetic
2.4.1. Đặc điểm vi khuẩn acid acetic
Vi khu n acid ac tic là c c trực khu n, thuộc vi khu n Gram âm, hiếu khí, hình
qu , không sinh bào từ, ph t triển trong điều kiện tho ng khí, có thể g p chúng ở một
số dạng chuyển động ho c bất động thuộc họ Acetobacteraceae (Holt et al., 1994;
Ruiz et al., 2000; Du Toit and Pretorius, 2002; Lương Đ c Ph m, 1998). Vi khu n
AAB có thể xếp thành chu i dài hay ngắn, có thể đ ng riêng lẻ (Trần Minh Tâm,
2000). Ngoài ra, A’ng l (2005) còn ph t hiện thêm c c chủng vi khu n Acetobacter có
dạnh hình lip, từ đó cho thấy sự đa dạng về hình dạng của loài vi khu n này. C c loài
của vi khu n AAB có 5 đ c điểm chính: có m t catalas , oxy hóa thanol qua acid
ac tic tới CO2 và H2O, oxy hóa lactat thành carbonat , oxy hóa glyc rol thành DHP
và sinh acid gluconic từ glucos (Kiều H u Ảnh, 1999).
AAB, đ c biệt là loài Acetobacter và Gluconacetobacter, có thể chịu đư c nồng
độ acid acetic cao, và do đó cả hai chi đã đư c sử d ng trong công nghiệp như sản
xuất giấm. AAB đã đư c nghiên c u rất nhiều trong hơn một thế kỷ. Th o De Ley et
al. (1984), AAB xếp vào họ Acetobacteraceae trong 2 chi Acetobacter và
Gluconobacter. Chúng thuộc Gram âm ho c là Gram biến đổi, hình dạng lip đến qu ,
chuyển hóa hiếu khí bắt buộc với oxy như chất nhận l ctron cuối. Nhiệt độ thích h p
nhất cho chúng ph t triển là 25-30oC và với Gluconobacter thì không ph t triển ở 37oC
pH tối ưu cho sự ph t triển của Acetobacter là 5,4-6,3 và Gluconobacter là 5,66,0. Tuy nhiên, đối với hầu hết c c chủng ph t triển tốt ở pH thấp hơn. C c chủng

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

thuộc chi Acetobacter đư c phân biệt với chủng của chi Gluconobacter bởi khả năng
thích ng đối với thanol và khả năng "oxy hóa qu m c" ac tat thành CO2 và nước.
Gần đây, AAB đư c phân loại bằng c c kỹ thuật mới sử d ng phân tích trình tự
16S rRNA. Hiện nay, chúng đư c phân loại trong 10 chi, c thể là Acetobacter,
Gluconobacter, Acidomonas, Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia, Swaminathania,
Saccharibacter, Neoasaia và Granulibacter trong họ Acetobacteraceae, lớp
Alphaproteobacteria. Đ c tính phổ biến của AAB (ngoại trừ nh ng chi Asais) là khả
năng oxy hóa ethanol thành acid ac tic trong điều kiện trung tính và acid. AAB đóng
vai trò tích cực trong việc sản xuất nh ng món ăn và nước uống chọn lọc, nhưng c ng
có thể ph hoại một số th c ăn và nước uống kh c.
Ngoài ra, Granulibacter bethesdensis đư c nhận biết như là mầm bệnh cho
người. Trong 10 chi miêu tả ở trên thì chi Acetobacter đư c định tính dựa trên thành
phần hóa sinh bởi Q-9, một quinon hô hấp lớn một quinon hô hấp phần lớn trong khi
nh ng loài kh c có Q10.
2.4.2. Một số loài vi khuẩn acid acetic ý nghĩa
Acetobacter pasteurianus: Vi khu n acid ac tic oxy hóa rư u và đường thành
acid ac tic và acid h u cơ tương ng, tương ng bằng c ch sử d ng nzym alcohol
d hydrog nas . Ac tald hyd và thyl ac tat c ng có thể đư c sản xuất.
Tất cả AAB chuyên cho qu trình oxy hóa nhanh chóng và hiếu khí nghiêm ng t
do đó sẵn sàng oxy là rất quan trọng. Tăng trưởng và trao đổi chất của họ đư c nâng

cao rõ rệt với việc bổ sung oxy cho môi trường của họ. A. pasteurianus thích tăng
trưởng ở m c pH kh c nhau, 5,5-6,3 và ở nhiệt độ 25-30oC. Nguồn carbon ưa thích là
glucos , mannitol và thanol. A. pasteurianus IFO 3283 (NBRC 3283) đư c phân lập
từ một màng m ng đư c hình thành trên bề m t của qu trình lên m n giấm gạo truyền
thống Nhật Bản.
Acetobacter pasteurianum: là trực khu n ngắn, hình th i gần giống loài trên, chỉ
kh c là chúng bắt màu xanh thẫm với iod. Tạo thành khu n lạc hình nhăn nh o trên
môi trường đ c. Có khả năng tích t 6,2% acid acetic.
Acetobacter curvum: có đ c tính tương tự như Acetobacter schiitzenbachii, tạo
thành acid cao, không tạo màng chắc, không làm b n v bào và làm đ c giấm. Nhiệt
độ tối thích 35-37oC, nâng nhiệt độ qu giới hạn này giống sẽ ph t triển yếu và tạo
thành acid kém.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 2 . Acetobacter aceti
(*Nguồn: Kenneth C. Fugelsang and Charles G. Edwards, 2007)

Acetobacter aceti: là trực khu n hình qu ngắn, không sinh bào tử, không chuyển
động và chúng có khả năng liên kết với nhau thành chu i dài. Chúng bắt màu vàng với
iot và có khả năng chịu nồng độ ethanol kh cao (11%) và tích t đư c 6% acid acetic.

Nhiệt độ ph t triển tối ưu của chúng là 34oC, nếu nhiệt độ lên qu 40oC sẽ xảy ra hiện
tư ng co tế bào và sẽ tạo ra hình quả lê. Thường thấy chúng ph t triển trong bia.
Acetrobacter aceti là gi trị kinh tế bởi vì nó đư c sử d ng trong sản xuất giấm
bằng c ch chuyển đổi thanol trong rư u thành acid acetic. Acid ac tic đư c tạo ra bởi
A. aceti c ng đư c sử d ng trong sản xuất tơ nhân tạo ac tat , sản xuất nhựa, sản xuất
cao su, và công nghệ hóa ảnh. A. aceti đư c x m là một sinh vật ưa acid có nghĩa là nó
có thể sống sót trong môi trường acid. Điều này là do có một tế bào chất đư c acid hóa
gần như tất cả c c prot in trong hệ g n để ph t triển ổn định acid. Acetobacter aceti đã
trở nên quan trọng trong việc giúp chúng ta hiểu đư c qu trình mà c c prot in có thể
đạt đư c sự ổn định acid.

Hình 3. Acetobacter xylinum
(*Nguồn: Annisa Shaira Dewi, 2011)

Acetobacter xylinum: là trực khu n không chuyển động. Khi lên m n tạo màng
giấm dày như s a trên bề m t dung dịch, màng này ch a nhiều h mic nlulos nên khi
nhộm với I2 và H2SO4 thì cho màu xanh.
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

Chúng tích t đư c 4-5% acid acetic và có như c điểm là oxy hóa tiếp t c acid
ac tic thành CO2 và H2O nên làm giảm hiệu suất thu hồi. Chúng đư c sử d ng trong

ngành sản xuất nước uống lên m n có gas. Acetobacter xylinum có bao nhầy cấu tạo
bởi c llulose.
Acetobacte kutzinguanum: Khi nhộm I2 cho màu xanh thẫm, tạo thành màng
nhầy, không bền dính vào thành bình.
Acetobacter orleanense: là trực khu n không chuyển động, có kích thước trung
bình. Khi tăng nhiệt độ chúng tạo thành tế bào hình dài ho c hình s i ho c không tạo
hình. Chúng ph t triển trong dịch nho loãng, có khả năng tồn tại ở nồng độ cồn từ 1112% và tích luỹ acid ac tic đến 9,5%.
Acetobacter schiitzenbachii: hình qu kết h p chu i, không sinh bào tử, không
chuyển động, Gram âm. C c tế bào già tạo thành màng ch c nhưng không chắc. Vì
vậy, giống này có thể dung để sản xuất giấm th o phương ph p chìm và có thể tạo
thành 11,5-12% acid ac tic trong dung dich nuôi cấy. Nhiệt độ tối thích là 28oC.
Bảng 1. Những đặc điểm khác biệt giữa các loài Acetobacter
Đặc điểm

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

d

+

nd

-

-

-

-

nd

-

d

Tạo acid từ D-Glucose

+

+

+

+

+

+

+

+

Tạo 2-Keto-D-gluconate
từ D-glucose

Tạo 5-Keto-D-gluconate
từ D-glucose

+

+

+

+

+

-

+

+

-

-

-

-

-

Ph triển ở 30% glucose

-

-

nd

-

-

Ph t triển ở 10% ethanol

-

nd

-

-

Phân giải nitrate 1

-

nd

-

+

Catalase
Tạo keto-gluconate từ
glycerol

10. 11.

12.

13.

14.

-

+

+

+

-

-

+

-

-

+

d

-

w

+

+

+

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

nd

-

-

-

-

nd

-

-

-

nd

-

-

+

-

-

-

-

d

d

nd

-

d

+

-

nd

-

+

Ghi chú : (+): 90% ho c nhiều hơn là dương tính; (w): phản ng dương tính yếu; (d): 11–89% là c c chủng
dương tính; (−): 90% ho c nhiều hơn là âm tính; và (nd): không x c định.
1., A. aceti; 2., A. cerevisiae; 3., A. cibongensis; 4., A. estunensis; 5., A. indonesiensis; 6., A. lovaniensis;
7., A. malorum; 8.,A. orientalis; 9., A. orleanensis; 10., A. pasteurianus; 11., A. peroxydans; 12., A. pomorum;
13., A. syzygii; and 14., A. tropicalis.
1

Nitrate reduction was tested in nitrate peptone according to Franke et al. (1999).

Data from Sokollek et al. (1998b), Lisdiyanti et al. (2000), Lisdiyanti et al. (2001), and Cleenwerck et al. (2002).

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Ph ơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 06/2014 đến 11/2014.
Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực ph m, Viện Nghiên c u
và Ph t triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Nguyên liệu
Thu thập khoảng 200 mL mẫu giấm ăn ở một số tỉnh :
- Cần Thơ và Hậu Giang: 2 mẫu
- Vĩnh Long: 3 mẫu
- Đồng Th p: 3 mẫu
- Sóc Trăng, Bến Tr , Bạc Liêu, Kiên Giang: 1 mẫu
3.1.3 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất
a. Thiết bị - dụng cụ
C c thiết bị và d ng c thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực ph m.
M y lắc ủ Epp ndorf (Đ c), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), m y ly tâm lạnh
(H ttich, Đ c), tủ lạnh để tr mẫu (Sanyo, Nhật), tủ cấy vi sinh vật (Ph p), cân điện tử
(Sartorius, Đ c), nồi khử tr ng nhiệt ướt (Pbi- int rnational, Đ c), bộ micropip tt
P10, P20, P100, P1000 (Bio-Rad, USA), pH kế (Schott, Đ c), m y vort x (Đ c).
Ngoài ra còn có c c d ng c kh c như: đĩa p tri, ống nghiệm, bình tam gi c, ống
đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, pp ndorf, đèn cồn, qu cấy.
b. Hóa chất
- Môi trường phân lập vi khu n acid acetic (YPGD – Yeast Polypeptone Glycerol
D-Glucose)
Yeast extract

5,0 g

D (+)-Glucose

5,0 g

Polypeptone

5,0 g

Glycerol

5,0 g

Canxi carbonate

5,0 g

Agar

20 g

Nước cất

1.000 mL

Sau khử tr ng bổ sung 4% thanol
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học