Phân lập và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS gây bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển hải phòng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI
KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN
THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Ở VÙNG BIỂN HẢI PHÒNG

Giáo viên hướng dẫn : TS. Phạm Thị Tâm
Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Vân Anh
Lớp: 11-02

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa
Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em
có thể thực tập và hoàn thành đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Phạm Thị Tâm
Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người đã trực tiếp tận
tình hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và hoàn thành đề tài.
Em không thể quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân, các anh
chị khóa trước, bạn bè đã luôn bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên trong suốt
thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài.
Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính mong các
thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu và hoàn thiện.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014.
Sinh viên

Đỗ Thị Vân Anh


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Brain Heart Infusion Broth

BHI Broth

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

TCBS

Lubria – Bertani

LB

Kligler Iron Agar

KIA

Đường kính

D

Resistant

R

Intermediate

I

Susceptible

S

Giờ

H

Deoxyribonucleotide Acid

DNA

Base pair

Bp

Polymerase Chain Reaction

PCR

Tế bào

tb

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là một quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây của Biển Đông, có bờ biển
dài hơn 3.260 km trải dài từ Bắc tới Nam; tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành và
phát triển kinh tế, đặc biệt là nghề nuôi trồng thủy hải sản. Nuôi trồng thủy sản là
ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất trên thế giới, mang lại
những tiềm năng to lớn để chúng ta đẩy mạnh chiến lược phát triển kinh tế biển.
Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn),
tổng sản lượng thủy sản nuôi trồng trong 8 tháng đầu năm 2014 ước đạt 543 nghìn tấn,
trong đó sản lượng khai thác 244 nghìn tấn, sản lượng nuôi trồng 299 nghìn tấn, đưa
tổng sản lượng thủy sản 8 tháng đầu năm xấp xỉ 4,0 triệu tấn, tăng 4,0%, trong đó sản
lượng khai thác 1,9 triệu tấn (tăng 4,9%), sản lượng nuôi trồng 2,1% (tăng 3,1%). Tổng
cục Thủy sản cũng cho biết, giai đoạn 2011 - 2015 ngành thủy sản sẽ hướng tới sự phát
triển bền vững là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có khả năng cạnh tranh cao và hội
nhập vững chắc thế giới.
Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong
phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng đang ngày càng khẳng định được vị trí của mình.
Đây là mô hình được áp dụng cho nhiều loài cá có giá trị kinh tế cao. Cá khi nuôi trong
lồng phải chịu rất nhiều yếu tố gây stress do phải thích nghi với môi trường sống mới,
tập quán sinh sản và kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hưởng. Vì thế, cá nuôi
lồng thường mắc một số bệnh do vi khuẩn và virus gây ra. Đáng lưu ý nhất là bệnh
hoại tử gan thận trên cá biển do chủng vi khuẩnVibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt
hại không nhỏ đến người nuôi cá biển.
Bệnh hoại tử gan thận xuất hiện ở hầu hết các loài cá biển (cá mú, cá chẽm, cá
giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt là cá nuôi lồng, xuất hiện ít ở cá nước ngọt. Khi vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, gây hoại tử lên các nội
quan của cá (đặc biệt là gan, thận), lở loét lớp biểu bì.

Gan và thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá
biển chết hàng loạt. Bệnh thường xảy ra ở các giai đoạn của cá, vì vậy tìm ra phương
pháp phòng và trị bệnh có thể hạn chế những tổn thất do dịch bệnh gây ra là hết sức
cần thiết.
Thực tế trong nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất và
kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thể gây hiện
tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao. Vi khuẩn này có khả năng tạo ra
màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuẩn và kháng sinh. Chính vì thế, dịch bệnh
thường bùng phát trở lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng. Mặt khác, dư lượng
kháng sinh trong sản phẩm từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá
và sức khỏe của con người.
Để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh và đảm bảo chất lượng sản
phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là tương đối cần thiết.
Bước đầu tiên để tạo ra vắc-xin là phải phân lập và sàng lọc được các chủng có tính đại
diện kháng nguyên để làm cơ sở cho việc tạo chủng có khả năng tạo kháng thể bảo hộ.
Xuất phát từ thực trạng nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân lập
và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh
hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển Hải Phòng” làm cơ sở ban
đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển trên quy
mô công nghiệp.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Phân lập được các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm
trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận ở vùng biển
Hải Phòng.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Phân lập được 6- 8 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm
trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận.

-Xác định các đặc tính sinh học điển hình của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus:
đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa, khả năng gây bệnh, tính kháng kháng sinh.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vikhuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận
trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) từ các mẫu bệnh phẩm.
- Xác định được đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh phân lập được.
- Đánh giá mức độ kháng kháng sinh và đặc tính gây bệnh trên một số loài cá
biển của 6 8 chủng vi khuẩn đã chọn lọc được.
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả xác định các đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở cá là cơ sở khoa học trong nghiên cứu
dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Là cơ sở khoa học nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm
độc lực để sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận ở cá. Vắc-xin là giải pháp hữu hiệu
trong việc hạn chế dịch bệnh làm tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất cá biển.


PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Trên thế giới
Ngành nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng ngành nuôi
trồng thủy hải sản theo hướng hiện đại thực sự ra đời từ những năm 1930, và chỉ thật
sự bùng nổ từ những năm 80 khi tôm giống sản xuất ra với số lượng lớn cung cấp cho
người nuôi.
Hiện nay trên thế giới ngành nuôi trồng thủy sản rất phát triển, có thể kể đến các

nước đứng đầu về sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ,
Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile, Nhật Bản, Na Uy và Philippines.
Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy hải sản đang bị gây trở ngại bởi nạn dịch bệnh lây
lan khắp nơi. Các dịch bệnh thường xảy ra đối với thủy hải sản là bệnh đốm trắng,
bệnh đầu vàng, bệnh còi,… ở tôm nuôi, bệnh xuất huyết do virus, bệnh Indivirus… ở
cá, bệnh do nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng
thủy hải sản.[27]
Một trong những tác nhân gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do nhóm
vi khuẩn Vibriosp. Gây ra cho động vật thủy hải sản (tôm, cá). Chúng có thể gây bệnh
qua tất các giai đoạn của động vật thủy sản và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại
nghiêm trọng trên giống thủy hải sản. Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện
ở Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan trên nhiều loài thủy hải
sản khác nhau. Các sự giảm sút gần đây trong ngành nuôi trồng thủy hải sản ở Việt
Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc chủ yếu là do tác động của nhóm
vi khuẩn Vibriosp. [27]
Theo dự báo của Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang
phát triển sẽ chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu và 79% tổng sản lượng thuỷ
sản thế giới. Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản ở các nước


đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các nước
phát triển sẽ chỉ tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn. [27]
1.1.2. Tại Việt Nam
Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có nghề nuôi thủy sản phát
triển và cũng là nước có lịch sử nuôi trồng thủy hải sản lâu đời. Nghề nuôi thủy sản
truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề nuôi
thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng. Trong những năm qua, ngành thủy
sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự
phát triển kinh tế - xã hội nước nhà. Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao
động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, và đang phấn đấu trở

thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao trên thị
trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững. Thực phẩm thuỷ hải sản còn
giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần xoá đói giảm nghèo. Thực phẩm
thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm động vật cho người dân Việt
Nam.[27]
1.1.3. Một số khó khăn trong nuôi trồng thủy hải sản
Vai trò của nuôi trồng thủy sản là rất to lớn trong việc cung cấp thực phẩm, y học,
công nghiệp, nông nghiệp hay giúp xoá đói, giảm nghèo và phát triển kinh tế - xã hội
nói chung của nhiều quốc gia. Tuy nhiên, với sự thâm canh hoá ngày càng cao độ, nghề
nuôi đang đối mặt với nhiều thách thức lớn như về ô nhiễm môi trường, suy thoái
nguồn lợi, dịch bệnh thủy sản, an toàn vệ sinh thực phẩm, phân cách và mâu thuẫn xã
hội...
Các mô hình chiến lược sẽ được phát triển trong thời gian tới có thể gồm: Nuôi
thâm canh với hệ thống hoàn chỉnh; nuôi tuần hoàn, nuôi kết hợp và nuôi lồng biển
khơi. Nhằm phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản, hiện nay, nhiều tổ chức đã nổ lực
rất lớn trong việc phát triển các phương thức – qui tắc quản lý tổng hợp đối với nghề
nuôi thủy sản và đã bước đầu đã được ứng dụng ở nhiều nơi như: nuôi sạch, thực hành
quản lý tốt hơn, và nuôi có trách nhiệm.
1.2. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio


1.2.1. Trên thế giới
Nhóm vi khuẩn Vibrio được xác định là tác nhân gây bệnh phổ biến ở các loài cá
biển trên thế giới. Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết khi nhiễm Vibrio có
thể trên 50% trong một đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn mê, màu sắc cơ thể biến đổi và
xuất hiện vùng hoại tử. Khi cá bệnh nặng nội quan có thể xuất huyết hoặc bên
trong chứa đầy dịch lỏng [29].
Vibrio anguillarum là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibriođược phát hiện
gây bệnh trên cá và nó đã được phân lập từ cá chình nuôi ở Địa Trung Hải bởi
Canestrini vào năm 1883. Và những năm tiếp sau đó, người ta cho rằng các tác nhân

gây bệnh Vibriosis chính loài vi khuẩn này là nguyên nhân.
Tuy nhiên, sự quan tâm ngày càng nhiều đối nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp
cho vấn đề dịch bệnh được hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ
thống nuôi và vai trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh. Chẳng
hạn, V. alginolyticusđược xác định là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh đối với cá
tráp (Sparus aurata) nuôi ở Israel khi loài cá này bị thương tổn (Colorni và cộng sự,
1981). Trong khi đó, V.vulnificus là tác nhân gây bệnh cho cá chình ở Nhật bản được
thông báo bởi Muroga và cộng sự năm 1979 và Bioscas vào năm 1991. Cùng với
Vibrio anguillarum, V.ordalii (Schiewe et al. 1981) và V.salmonicida (Egidius et al.
1986) đã xuất hiện và là những tác nhân gây bệnh rất nguy hiểm cho cá hồi nuôi ở Thái
Bình Dương và Đại Tây Dương.
Qua quá trình tồn tại và phát triển, các giống loài Vibrio gây bệnh đã có sự biến
đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc này đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, có
tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của nghề nuôi thuỷ sản nói chung và nuôi cá
biển nói riêng [27].
V. parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại
vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hàu…Người ta đã xác định đuợc
21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người
gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus[28].


V. cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới cả chân Mỹ, gây bệnh dịch
tả cho một số vùng châu Á, Ấn Độ và Đông Nam Á. Chúng từng gây đại dịch do lây
truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm và côn trùng.
V. parahaemolyticus là vi sinh vật biển, tồn tại tự nhiên trong nước biển, thường
gặp ở các loại hải sản loại nhuyễn thể và giáp sát trong nước biển.
Năm 2001, Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá bớp
có dấu hiệu lở loét tại Đài Loan (Rajan et al 2001). Đến năm 2006 Vibrio vulnificus
được xác định chính là nguyên nhân gây bệnh trên cá bớp. Tuy nhiên, chưa có nghiên
cứu chính thức nào về cá bớp bị lở loét nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong bài

báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi
khuẩn và xác định độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với vi khuẩn phân
lập được nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị bệnh hiệu quả [29].
Ngoài ra, những người dân sống ven sông và vùng duyên hải tại Canada thường
có thú đào vớt nghêu sò. Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản này đôi khi
là mối đe dọa về sức khỏe. Cũng như bất cứ loài thủy sản nào khác, sò ốc cũng có thể
bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E. coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus,
Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus
bệnh viêm gan A.
Bệnh viêm ruột do V. parahaemolyticus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo
đường ăn uống. Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra hai hội chứng lâm sàng khác biệt
nhau là tiêu chảy kiểu tả nhẹ và tiêu chảy phân có nhiều máu, kèm theo đau bụng và
sốt, kiểu lỵ trực khuẩn. Thông thường bệnh nhẹ và ít nguy hiểm, song nếu phát hiện
chậm và không được điều trị kịp thời cũng có thể gây tử vong.
Hiện nay, V. parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ
ngộ độc thức ăn do ăn cá biển và hải sản. Trong khoảng 50 năm qua, người ta đã
nghiên cứu nhiều về loại vi khuẩn này. Các nhà khoa học lo ngại do biến đổi khí hậu,
nhiệt độ tăng lên dẫn đến sự tăng vọt bất ngờ và đột ngột của V. parahaemolyticus loại vi khuẩn một thời có vẻ như chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ. Dịch tễ học của vi khuẩn đã


thay đổi và những týp huyết thanh mới phát hiện đã được thừa nhận là nguyên nhân
của sự thay đổi này.

1.2.2. Tại Việt Nam
Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú.
Đặc biệt những năm gần đây, người dân chú ý đến khả năng nuôi cá mú, đặc biệt là cá
mú chấm nâu (Epinephelus coioides) là loài được nuôi phổ biến ở các tỉnh Phú Yên,
Khánh Hòa, Vũng Tàu, Quảng Ninh, Hải Phòng do đặc điểm lớn nhanh, thịt thơm ngon
và nguồn giống cung cấp cho người nuôi ổn định. Mặc dù nghề nuôi cá mú đã mang lại
hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi cá biển nhưng rủi ro do dịch bệnh xảy ra cũng gây

ảnh hưởng không nhỏ đến nghề nuôi cá mú. Có nhiều nguyên nhân gây thiệt hại cho
nghề nuôi cá mú, trong đó có nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. gây chết cá
nuôi. Cá mú bị bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. gây ra thường có các biểu hiện khác nhau
như: Hiện tượng mắt lồi và mù mắt hay hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể. Ngoài ra,
vi khuẩn Vibrio sp. còn gây bênh phổ biến trên một số loài cá khác như cá hồng, cá
giò, cá chẽm, cá bớp…Trong đó, hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể ở cá là chủ yếu
với các biểu hiện da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ trên thân và tại các đốm đỏ này
bắt đầu lở loét dần dần và lan rộng ra xung quanh. Cùng với đó là sự xuất huyết miệng,
vây, hậu môn và đuôi cá. Cá thường bơi gần mặt nước, sát bờ ao hay lưới lồng nuôi.
Khi giải phẫu nội tạng có thể nhìn thấy gan cá có màu nhợt nhạt hay có chất dịch trong
xoang bụng ở một số trường hợp cá bị bệnh nặng.
V. parahaemolyticus có thể gây ra viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết thương
và nhiễm trùng huyết ở người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh
vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc các độc tố của chúng sinh ra có thể tồn tại lâu dài và
lưu thông trong máu. Tác nhân vi khuẩn Vibrio gây xuất huyết cơ thể, xuất hiện các vết
lở loét ở thân, cuống đuôi và vây thối rữa ở cá mú giống và cá mú thịt là do vi


khuẩn Vibrio parahaemolyticus, V.alginolyticus (Leong tak Seng,1994; Somkiat
Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy et al., 2009)[28]; gây hội chứng đường
ruột ở cá mú là do vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. carchariae (Lee và cs, 1995; Yii
và cs, 1997)[28]; gây triệu chứng mắt lồi và mù mắt ở cá mú là do nhóm vi
khuẩn Vibrio gây ra, chúng phá hủy cấu trúc đặc trưng của mắt, làm khả năng bắt mồi
của cá kém đi, từ đó làm cá yếu dần và chết (Sindermann, 1970; Richardol, 1972;
Lom, 1970)[28].
Bệnh lở loét được ghi nhận đã xuất hiện và làm chết cá vào mùa hè năm 2008 2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu, thuộc tỉnh Phú Yên và Cam Ranh thuộc
tỉnh Khánh Hòa. Trong năm 2010 và đầu năm 2011, bệnh cũng xuất hiện nhiều ở các
vùng nuôi cá mú trong ao và trong lồng nổi trên biển thuộc các tỉnh Phú Yên, Khánh
Hòa và Vũng Tàu. Bệnh xuất hiện nhiều vào mùa hè và nhất là vào lúc giao mùa, gây tỉ
lệ chết cao.

1.3. Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thể kí sinh trên rất nhiều loài cá biển có giá
trị kinh tế phân bố ở các vùng biển khác như các loài cá ở vùng biển ấm như cá chẽm
(Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú
(Epinephelus spp.). Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra được báo cáo đã gây
thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá biển ở nhiều nước trên thế giới 1, 3, 12, 18.
Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra đặc trưng bởi sự xuất hiện các đốm
đỏ, xuất huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong). Vẩy cá bị tróc, rụng, tạo nên các
vết loét ngày càng lan rộng và sâu. Vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác. Giải phẫu mẫu cá
bệnh cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng (đặc biệt là gan và thận) và xuất huyết
trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc chết rải rác khi ở
thể thứ cấp tính.
Đặc điểm bệnh hoại tử ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban đầu là cá
thường bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ
trên thân. Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra xung quanh, kèm theo biểu


hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi. Giải phẫu nội quan thường thấy gan nhợt
nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp bệnh nặng.
Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước
lợ và nước mặn. Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện kịp thời có khả năng gây
chết rất cao. Bệnh thường xuất hiện vào mùa nóng và đầu mùa mưa, khi môi trường
thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc. Hơn nữa, vi khuẩn tổng số trong nước có xu hướng
tăng khi nhiệt độ tăng. Đây là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh và đặc
biệt gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi. Vi khuẩn V. parahaemolyticus có
ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước và gây bệnh trên
khoảng 48 loài cá biển.
Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra được chẩn đoán dựa vào những dấu
hiệu bệnh lý đặc trưng như đã mô tả ở trên. Nuôi cấy phân lập Vibrio trên môi trường
chọn lọc và phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 4. Ngoài ra, nhận biết V.

parahaemolyticus bằng các phương pháp sinh học phân tử như phân tích trình tự gen
16S ribosomal DNA (rDNA) 11hoặc các gen độc tố đặc trưng 5.
Để điều trị được bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, một số nghiên cứu đã đề xuất
biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách cho ăn, tắm hoặc tiêm kháng sinh.
Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn

như trộn tetracyline 75-100 mg/kg cá,

streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7
đến 10 ngày cũng cải thiện được tình trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio 3. Nhìn
chung, kháng sinh là phương pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh do vi khuẩn. Mặc dù
kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định trong một số trường hợp, nhưng việc
lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc gây khó khăn cho quá
trình điều trị. Nghiên cứu của Shyne và cộng sự (2008) về khả năng nhạy cảm với
kháng sinh của vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh. Kết quả cho
thấy hầu hết các chủng đều kháng lại sulphadiazine và amoxicillin, 87% kháng lại
gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và oxytetracycline 22.Ngoài ra, tồn dư kháng
sinh trong sản phẩm thủy sản còn ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi
trường. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không


nên khuyến khích và cần cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp. Chính vì những
mặt trái do sử dụng kháng sinh, việc phòng bệnh cho cá nuôi vẫn luôn được chú ý
trong suốt quá trình nuôi. Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi
áp dụng như sát trùng bể, ao và dụng cụ trước mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước
trước khi đưa vào sử dụng. Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn
thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ để phòng các loại bệnh ký sinh trùng
và chú ý chất lượng thức ăn. Tuy nhiên, đây chỉ là những biện pháp phòng bệnh đơn
giản với mục đích giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang
tiếp tục diễn ra và gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển. Hiện nay, giải pháp nâng

cao sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách sử dụng các chất gây kích thích miễn dịch
và vắc-xin phòng bệnh là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao,
đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới. Song, để chế tạo ra
các loại vắc-xin đặc hiệu hay chọn lựa được các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại
hiệu quả bảo hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thử thách không nhỏ đối với khoa học
hiện nay.
1.4. Vi khuẩnVibrio parahaemolyticus
1.4.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.4.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Dưới kính hiển vi quang học, Vibrio parahaemolyticus là phẩy khuẩn gram âm,
có tiên mao ở một đầu và có khả năng di động, không sinh bào tử [28].


Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
quan sát dưới kính hiển vi điện tử.
Vị trí phân loại:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Loài: Vibrio parahaemolyticus
Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên môi trường TCBS có màu
xanh đậm,dạng tròn đều và bóng với kích thước từ 2- 3 mm [28].

Hình 1.2: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus


Chúng có thời gian thế hệ 8-9 phút [9], thường sống ở các cửa sông và ven biển

của hầu hết các vùng ven biển trên thế giới. Người ta cũng đã phân lập được chúng
trong cát, bùn và nước biển cũng như hải sản [22].
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có khả năng hình thành màng bao sinh học
(biofilm), sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt
vật chủ. Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp "keo" giúp cho chúng
gắn chặt vào bề mặt vật chủ. Khi đã hình thành các màng bao sinh học chắc chắn trên
dạ dày tôm, các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao là hợp chất exopolysaccharides sẽ
hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử
trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các
hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
1.4.1.2. Đặc điểm sinh học
Sự phân bố của Vibrio parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ
nước. Ở những vùng nước có nhiệt độ trên 150C, chúng có mặt quanh năm trong nước,
chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước 7, 15. Ngoài ra,
pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn này. Nghiên cứu
cho thấy các chủng V. parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển được trên môi
trường NB (Nutrient Broth) với pH biến thiên từ 6,0 - 9,0. Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi
khuẩn không tiết ra hemolysin trong khi ở các pH khác đều có hiện tượng này. Hơn
nữa, khả năng vận động bằng tiên mao của vi khuẩn bị ức chế trong môi trường kiềm
nhưng không bị ảnh hưởng ở môi trường trung tính và axit. Kết quả nghiên cứu này
cho thấy pH của môi trường có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng vận
động của V. parahaemolyticus 16. Khi ở độ mặn thích hợp và pH 8,0, vi khuẩn V.
parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận tốc 60 µm/s7.
1.4.1.3. Đặc tính sinh hóa
Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu rất quan trọng để phân lập một loài vi khuẩn cụ
thể. Đặc điểm sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp chất, khả năng tiết


enzyme để thủy phân các chất có trong môi trường của vi khuẩn. V. paraheamolyticus
khi được nuôi trong môi trường tổng hợp hoặc bán tổng hợp sẽ sử dụng các hợp chất

có sẵn để phục vụ cho nhu cầu sinh trưởng và phát triển. Người ta đã xác định được
một số đặc tính sinh hóa của V. parahaemolyticus gồm: phản ứng dương tính với
oxidase và catalase, khả năng sử dụng lysin, ornithin, arginine, khả năng lên men
đường glucose, có khả năng di động, dung huyết dạng β, sống được trong phạm vi
muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường không có muối (0%) hoặc muối quá cao
(10%), kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn [29].
Bảng 1.1: Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Các phản ứng sinh hóa

Vibrio parahaemolyticus

Di động

+

Sinh catalaza

+

Sinh oxidaza

+

Phản ứng lên men yếm khí

+

Phản ứng lên men hiếu khí

+

Sinh beta – galactosidaza

-

Agrinine

-

Lysine

+

Ornithin

-

Sử dụng Citrate

-

Sinh H2S

-

Sinh ureaza

-

Sinh tryptophane

-

Sinh indole

+

Phản ứng Voges - Proskauer

+

Sinh Gelatinaza

+

Sử dụng đường Glucose

+

Manitol

+

Inositol

-

Sorbotol

-

Rhamnose

-

Sucrose

-

Melibiose

-

Amygdalin

+

Arabinose

-

Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính

1.4.2. Gen độc tố và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.4.2.1. Gen độc tố
Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho vật chủ thông qua các loại độc tố (toxin), đây là các
hoạt chất sinh học có bản chất protein hoặc không phải protein do vi khuẩn tiết ra nhằm
gây độc cho tế bào vật chủ. Quá trình gây bệnh của chúng diễn ra theo trình tự bám dính,
xâm nhập vào tế bào vật chủ và tiết ra các độc tố phá vỡ màng tế bào và gây độc cho tế

bào vật chủ. V. parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông qua phân tử gắn kết đa trị


(Multivalent Adhesion Molecule - MAM) chứa 6 hoặc 7 vùng gắn kết 7. Hoạt tính dung
huyết, phân giải protein, lipid, phospholipid, cytotoxin, yếu tố gây bám dính, ngưng kết
đều liên quan tới khả năng gây bệnh của nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và được
quy định bởi các gen độc tố đặc trưng 25.
Cũng như các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio, vi khuẩn V.
parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chủng mang các yếu tố gây độc khác nhau.
Hemolysin là ngoại độc tố, chuyển các dạng ion liên kết với protein như hemolysin,
transferrin, lactoferrin thành dạng tự do.Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của
hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô,
tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa hình làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các
mô. Kết quả của sự phân giải này là giải phóng beta-hemolysin (phân hủy hoàn toàn
hemoglobin) và alpha-hemolysin (phân hủy không hoàn toàn hemoglobin). Chủng vi
khuẩn V. parahemolyticus trên môi trường thạch máu Wagatsumar đã sản xuất ra betahemoglobin.
Ngày nay, người ta đã phát hiện có 4 nhóm protein độc tố gây ra hiện tượng dung
huyết ở vi khuẩn Vibrio bao gồm TDH (Thermostable direct haemolysin), Hly A (E1
Tor haemolysin), TLH (Thermolabile haemolysin) và TRH (Thermostable direct
related

haemolysin)[18].Trong

đó,

TDH,

TLH

và

TRH

thường

gặp

ở

V.parahaemolyticus trong khi Hly A thường gặp ở V. cholera25.
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có ba gen độc tố hemolysin bao gồm tdh và trhmã
hóa các hemolysin bền nhiệt TDH, TRH và tlh mã hóa hemolysin không bền nhiệt
TLH. Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vp-toxRS, được điều hòa bởi
gen toxR có trình tự bảo tồn cao trong loài19.
Protein TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và trh tương ứng được coi là yếu
tố độc tính quan trọng trong quá trình gây bệnh của V. parahaemolyticus20, 14. Gen
tdh, trh lần lượt có kích thước 250bp và 251 bp. Giữa các chủng V.parahaemolyticus
có các đoạn gen độc tố khác nhau. Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng có tdh hoặc trh,


hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có hoặc có tỉ lệ thấp
1-5% [20].
Các chủng V. parahaemolyticus có chứa các đoạn gen tdh và trh mã hóa các
protein độc tố TDH và TRHcùng nằm trong operon độc tố V. parahaemolyticustoxRS
(Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR. Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu
hiện của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên
quan đến các độc tố khác. Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hòa cho operon
Vp-toxRS26, tồn tại ở tất cả các chủng V. parahaemolyticus. Gen toxR là gen điều hòa
kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa của nhiều loài trong chi Vibrio, có trình tự
bảo tồn đặc trưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương

pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus trong mẫu thủy sản bằng kỹ thuật PCR. Gen
tlh có kích thước 451 bp mã hóa một hemolysin không bền nhiệt TLD có trình tự amino
acid bảo thủ trong họ Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vắc-xin điều trị bệnh thủy sản
và marker chẩn đoán bệnh do Vibrio.
Hầu hết các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất là V.
parahaemolyticus đã được nghiên cứu tương đối sâu, chủ yếu là nghiên cứu các chủng
phân lập từ người. Kết quả đạt được mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong y học,
giúp chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra. Tuy nhiên, số lượng công trình
nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tượng thủy sản vẫn còn hạn
chế. Việc tìm hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên đối tượng nuôi là
rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi khuẩn gây ra cho đối
tượng thủy sản.
1.4.2.2. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn này có khả năng hình thành màng bao sinh học là hợp chất
exopolysaccharides. Sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám
trên bề mặt vật chủ. Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp "keo" giúp
cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật chủ. Các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao sẽ
hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử


trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các
hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
Khi vi khuẩn V. parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, vi khuẩn lấy ion
Fe++ từ tế bào hồng cầu hình thành enzyme protease phục vụ cho quá trình tổng hợp
protein của chúng.
1.5. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus như dựa
vào quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử, các đặc tính sinh hóa và các kỹ thuật
sinh học phân tử như PCR, RAPD…
Các loài V. parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Thiosulfate

Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh đậm trên thạch.
Ngoài ra, V. parahaemolyticus còn phát triển trên môi trường chọn lọc khác là
CHROMagarTMVibrio cho thấy các khuẩn lạc có màu tía hoặc màu tím.
Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus trong các mẫu
nước hoặc trên các loài cá biển. Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin
cậy.
1.6. Triệu chứng của cá khi mắc bệnh do vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus
Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và
trên các vết thương tổn; da, vây có thể sưng lên và bị lở loét. Cơ nổi hạch, mang nhợt
nhạt, mắt cá lồi đục.
Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có
hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan
nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của
nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng
xuất hiện mạch máu nổi rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen.
1.7. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương


Miễn dịch học ở cá được được chia thành hai loại:
1.7.1. Miễn dịch tự nhiên
Miễn dịch tự nhiên (hay còn gọi là miễn dịch không đặc hiệu) là khả năng tự bảo
vệ sẵn có của cá thể ngay từ khi mới sinh, không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước với
tác nhân gây bệnh và mang tính di truyền giống nhau giữa các cá thể cùng loài. Vai trò
của hệ miễn dịch tự nhiên được coi như là tuyến phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ thể
chống lại các vật lạ xâm nhập và nó có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho giai đoạn đầu
đời, khi mà hệ miễn dịch thích nghi chưa được hoàn thiện. Nhiều nghiên cứu về các
khía cạnh khác nhau của hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá xương đã được tổng quan
bởi các tác giả Chistiakov (2007) 6,Van (2008) 24. Hầu hết các nghiên cứu đều mô tả
về thành phần cấu thành và chức năng của chúng trong cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch
tự nhiên ở cá. Ba thành phần chính tạo nên hệ miễn dịch tự nhiên ở cá bao gồm hàng

rào vật lý, hàng rào dịch thể và hàng rào tế bào không đặc hiệu.
1.7.2. Miễn dịch đặc hiệu
Miễn dịch đặc hiệu hay còn gọi là miễn dịch mắc phải (miễn dịch thích nghi) là
đáp ứng miễn dịch chỉ có thể thấy ở động vật có xương sống và có vai trò quan trọng
trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự tái nhiễm bệnh. Đặc điểm quan trọng của cơ chế
đáp ứng miễn dịch này là tính đặc hiệu, tính đa dạng và tính nhớ, nhờ đó mà khi gặp
lại cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên đáp ứng miễn dịch thứ cấp đặc
trưng với thời gian phản ứng nhanh và cường độ mãnh liệt hơn. Cho đến nay, các
nghiên cứu tương đối đầy đủ các khía cạnh liên quan đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá
chỉ mới tập trung trên các đối tượng quen thuộc như cá hồi, cá da trơn và cá chép.
Những yếu tố cơ bản của hệ miễn dịch mắc phải là các thụ quan tế bào lympho T,
lympho B, các phân tử kháng thể (Immuno globulin- Ig) 23. Tuyến ức, thận và lách là
ba cơ quan lympho lớn nhất ở cá xương. Thận của cá, ngoài chức năng tạo máu còn là
nơi chứa các tế bào lympho B sinh kháng thể.



PHẦN II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: mẫu cá mắc bệnh hoại tử gan thận được thu thập từ vùng
biển Hải Phòng.
2.2. Vât liệu
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm
2.2.1.1. Thiết bị
Bảng 2.1. Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Tủ cấy vô trùng

Sanyo (Nhật)

Tủ lạnh

Nuaire (Mỹ)

Nồi hấp vô trùng

Nhật

Cân điện tử

Adam

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instrument (Đức)

Máy vortex

Mimishaker, IKA (Đức)

Máy khuấy từ

Rotolab, OSI

Lò vi sóng

Moulinex

Máy li tâm

Mictocentriguge- Sorvall (Mỹ)


2.2.1.2. Dụng cụ
- Dụng cụ thu mẫu: bông thấm cồn, túi PE đã tiệt trùng, bộ giải phẫu đã tiệt
trùng.
- Dụng cụ để làm phân tích và nghiên cứu vi khuẩn: ống nghiệm, đĩa petri, đầu
côn, ống eppendorf, que cấy, đèn cồn, dụng cụ dùng để nhuộm gram, xylen, kính
hiển vi.
2.2.2. Môi trường và hóa chất
2.2.2.1. Môi trường
• Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts):
Peptone

10 g

Cao nấm men

5g

Natri citrat

10 g

Natri thiosulfat

10 g

Mật bò khô

5g

Natri clorid

10 g

Natri cholat

3g

Feric citrat

1g

Saccharose

20 g

Dung dịch xanh thymol 1%

4 ml

Dung dịch xanh bromothymol 0,2%

20 ml

Agar

15 g

Nước cất vừa đủ

1000ml