Nghiên cứu khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học của vi khuẩn nhằm ứng dụng loại CADIMI từ đất ô nhiễm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---

---

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT
SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NHẰM ỨNG DỤNG LOẠI CADIMI
TỪ ĐẤT Ô NHIỄM

Người hướng dẫn: TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa
Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Hiền
Lớp: 11.04

Hà Nội- 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ
Sinh học,Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em
những kiến thức cơ bản trong 4 năm học tại trường.
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa, Trưởng
phòng Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệp
quý báu giúpem thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin cảm ơn tập thể cán bộ
Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em thực tập tại phòng.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè những người đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày….tháng
Sinh viên

Ngô Thị Hiền

….năm 2015


Khóa luận tốt nghiệp

Ngô Thị Hiền
MỤC LỤC

KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1

Ô nhiễm cadimi ................................................................................................. 3

1.1.1

Tính độc hại của cadimi .................................................................................................. 3

1.1.2

Nguồn thải của cadimi..................................................................................................... 4

1.1.3

Tác động của cadimi đến môi trường và con người ................................................ 5

1.2

Một số phương pháp xử lý cadimi ..................................................................... 6

1.2.1

Phương pháp hóa học ...................................................................................................... 6

1.2.2

Xử lý bằng phương pháp hóa lý .................................................................................... 6

1.2.3

Phương pháp sinh học ..................................................................................................... 7

1.3

Chất hoạt hóa bề mặt sinh học ........................................................................... 8

1.3.1

Khái niệm chất hoạt hóa bề mặt sinh học .................................................................. 8

1.3.2

Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học ................................................................... 8

1.3.3

Tính chất của chất hoạt hóa bề mặt sinh học .......................................................... 12

1.3.4

Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học trong đời sống ............................ 12

1.3.5

Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học đến xử lý ô nhiễm Cd ............... 13

1.4

Phương pháp xử lý kim loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học ............. 14

1.4.1

Vi khuẩn có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học ................................... 14

1.4.2

Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp chất hoạt hóa bề mặt sinh học ................ 14

1.4.2.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon .............................................................. 14
1.4.2.2 Ảnh hưởng của nitơ ............................................................................. 14
1.4.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố pH ............................................................... 15

1.4.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ ....................................................... 15
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 16
2.1

Vật liệu ............................................................................................................ 16

2.1.1

Chủng vi khuẩn................................................................................... 16

2.1.2

Hóa chất và môi trường nuôi cấy ......................................................... 16


Khóa luận tốt nghiệp

Ngô Thị Hiền

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................................ 17
2.2.1. Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn ................... 17
2.2.2. Phân loại vi khuẩn nghiên cứu bằng kit chuẩn sinh hoá API 50 CHB ......... 19
2.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng tạo CHHBMSH của các chủng vi khuẩn
phân lập dựa trên chỉ số E24 ............................................................................. 19
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi
cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH ................................................ 19
2.2.5. Phương pháp loại Cd từ đất ô nhiễm bằng CHHBMSH ............................. 20
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 20
3.1.Đặc điểm hình thái của chủng ĐM 26 ........................................................... 20
3.2. Kết quả sốc nhiệt ........................................................................................ 21

3.3.Phân loại chủng ĐM 26 bằng kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB ....................... 22
3.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến quá trình sinh trưởng và tạo CHHBMSH ........ 24
3.7. Đánh giá hiệu quả xử lý đất nhiễm cadimi bằng CHHBMSH tạo ra từ chủng
ĐM 26

........................................................................................................... 33

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 36


KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Cd

Cadimi

CHHBMSH

Chất hoạt hóa bề mặt sinh học

EPS

Extracellular polymeric substance (polyme ngoại bào)

HKTS

Hiếu khí tổng số

KLN

Kim loại nặng

OD

Optimal Density (mật độ quang)

CMC

Critical micellar concentration (hàm lượng mixen tới hạn)


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Máy móc và thiết bị
Bảng 2: Kết quả thử Kít
Bảng 3 Kết quả phân tích đất


DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ
Hình 1: Kim loại Cadimi
Hình 2: Chứng teo thận của bệnh itai itai gây ra do sống trong vùng ô nhiễm Cadimi
Hình 3: Công thức cấu tạo của trelaloselipid
Hình 4: Công thức cấu tạo của Sophorolipid
Hình 5: Công thức của rhamnolupid
Hình 6: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn 26 trên môi trường
HKTS 0% NaCl
Hình 7: Hình ảnh sốc nhiệt của chủng ĐM26
Hình 8: Kết quả thử Kít
Hình 9:Ảnh hưởng của nguồn carbon lên quá trình sinh trưởng
và tạo CHHBMSH của chủng ĐM 26

Hình 10: Khả năng nhũ hóa xylen của chủng ĐM 26 ở các nguồn Carbon khác nhau
Hình 11: Ảnh hưởng của các nồng độ glucose khác nhau tới khả năng sinh trưởng
và tạo CHHBMSH của chủng ĐM 26.
Hình 12: Khả năng nhũ hóa với xylen của chủng ĐM 26 ở các nồng độ glucose
khác nhau
Hình 13. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng và tạo
CHHBMSH của chủng ĐM 26
Hình 14. Khả năng nhũ hóa xylen của chủng ĐM 26 trên các nguồn nitơ khác nhau
Hình 15. Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 tới khả năng sinh trưởng và tạo
CHHBMSH của chủng ĐM 26.
Hình 16. Khả năng nhũ hóa xylen của chủng ĐM 26 với nồng độ NH4NO3 khác
nhau
Hình 17. Ảnh hưởng của yếu tố pH tới khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH của
chủng ĐM 26.
Hình 18. Khả năng nhũ hóa xylen của chủng ĐM 26 ở các pH khác nhau


Hinh 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH
của chủng ĐM 26
Hình 20. Khả năng nhũ hóa xylen của chủng ĐM 26 ở các nhiệt độ khác nhau


MỞ ĐẦU
Kim loại nặng (Cd, Pb, Cr, Zn, Cu, Hg,…) từ quá trình sản xuất công
nghiệp, nông nghiệp, khai khoáng, luyện kim, sản xuất tái chế đồ dùng bằng kim
loại gây tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và môi trường sống. Những kim
loại này tích tụ trong môi trường và xâm nhiễm vào cơ thể con người thông qua hô
hấp, tiêu hóa, da gây nên một số bệnh về đường hô hấp, ung thư da, ung thư phổi,
nhuyễn xương, rối loạn đường tiết niệu, viêm cầu thận.… Một số kim loại (Ca, Mg,
Fe, Zn) là yếu tố vi lượng cần thiết cho sự sống, tuy nhiên cũng có những kim loại

(Cd, Hg, Pb…) không cần thiết cho sự sống mà gây hại đến sức khỏe con người
cũng như các sinh vật khác.
Hiện nay, có nhiều phương pháp xử lý Cd như phương pháp kết tủa hóa
học, phương pháp hấp phụ, phương pháp trao đổi ion,…Tuy nhiên, các phương
pháp này thường gây ra ô nhiễm thứ cấp và chi phí hoạt động lớn. Gần đây, phương
pháp xử lý ô nhiễm kim loại nặngnói chung và Cd nói riêng bằng chất hoạt hóa bề
mặt sinh học (CHHBMSH) do vi sinh vật tạo rathu hút được sự quan tâm nghiên
cứu của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới. CHHBMSH là hợp chất
sinh học chứa hai nhóm chức ưa nước và kị nước trong cùng một phân tử. Do đó,
CHHBMSH có thể làm giảm sức căng bề mặt và lực hút tĩnh điện ở bề mặt tiếp xúc
giữa hai pha (lỏng-lỏng; lỏng-rắn); giúp chúng dễ dàng tiếp xúc và tạo phức với kim
loại nặng.
Phương pháp này được đánh giá cao bởi ưu điểm: giá thành phù hợp, xử lý
triệt để, an toàn với môi trường dokhả năng phân hủy sinh học nên không gây ô
nhiễm thứ cấp, tạo bọt cao, chịu nhiệt, pH và chịu lực ion tốt.
Cùng với chì và thủy ngân, cadimi (Cd) là kim loại nặng độc hại đối với
con người và môi trường sống. Vì vậy,chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“ Nghiên cứu khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học của vi khuẩn
nhằm ứng dụng loại cadimi từ đất ô nhiễm”

1


Mục tiêu nghiên cứu:
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tạo
CHHBMSH của chủng vi khuẩn.
- Đánh giá khả năng loại cadimi (Cd) trong đất ô nhiễm bằng
CHHBMSH tạo ra bởi chủng vi khuẩn nghiên cứu.

2

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Ô nhiễm cadimi
1.1.1

Tính độc hại của cadimi
Cadimi (tên Latin là Cadimium, viết tắt là Cd) là nguyên tố hóa học thuộc

nhóm IIB trong bảng hệ thống tuần hoàn Mendeleev; số thứ tự nguyên tử là 48;
khối lượng nguyên tử là 112,41; khối lượng riêng là 8,65 g/cm3; có màu trắng xanh,
mềm dẻo, dễ uốn, không hòa tan trong nước và không dễcháy. Tuy nhiên, ở dạng
bột nó có thể đốt cháy và tạo ra khói độc[33].
Cadimi đã được phát hiện ra năm 1817 bởi Friedrich Stromeyer và Karl
Samuel Leberecht Hermann[19].Cadimi phân bố rộng rãi trên bề mặt trái Đất, nồng
độ trung bình của Cd trong lớp vỏ Trái Đất là khoảng 0,1-0,5 ppm.

Hình 1. Cadimi
Cadimi là một tạp chất phổ biến trong quặng kẽm, một số quặng sunfuakẽm
chứa tới 1,4% Cd.Vì vậy, Cd được xem như một sản phẩm phụ từ việc khai thác,
tinh luyệnquặng sunfua kẽm[39].
Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, Cd là một trong những kim loại nặng
nguy hiểm nhất đối với cơ thể con người. Nguyên tố này cùng với các hợp chất của
3


nó là những chất cực độc,với nộng độ rất thấp chúng sẽ tích lũy trong cơ thể và gây
độc cho tế bào. Cadimi tích lũy sinh học trong cơ thể ảnh hưởng đến quá trình cố
định Ca, gây nên chứng bệnh loãng xương, mục xương và phá hủy tủy xương.
Cadimicó khả năng thay thế Zn ở một số enzyme, làm thay đổi cấu trúc và chức

năng của enzyme gây rối loạn tiêu hóa.
1.1.2

Nguồn thải của cadimi
Trong tự nhiên: Cd có sẵn trong đất,đất bắt nguồn từ đá núi lửa có chứa

lượng Cd 0,1-0,3 mg/kg, đá ngầm chứa 0,3-11 mg/kg. Nhìnchung, Cd trong đất có
nồng độ dưới 1mg/kg, ngoại trừ đất ở những nơi bị ô nhiễm hoặc đất hình thành
trên những đá mẹ với lượng Cd cao bất thường; qua quá trình rửa trôi, xói mòn và
tích tụ nên hàm lượng Cdtrong đất cao.
Trong công nghiêp: Ngành công nghiệp khai thác khoáng sản-quặng, luyện
kim, hàn hoặc từ các ngành công nghiệp khác như pin NiCd, xi mạ, bột màu và chất
dẻo,…là nguồn thải chính gây ô nhiễm cadimi. Một số nguồn khác hình thành Cd
trong không khí như việc đốt nhiên liệu hóa thạch (than đá, dầu mỏ), đốt rác thải
của thành phố (nhựa ,pin nickel-cadmium,…) cũng thải ra ngoài không khí một
lượng lớn cadimi.
Trong nông nghiệp: Sử dụng phân phosphate hóa học chứa hàm lượng Cd
caođã và đang trở thành nguồn gây ô nhiễm Cd cho đất và nước nông nghiệp. Hàm
lượng Cd trong đất sử dụng phân phosphate tăng từ 0,07 đến 10mg Cd /kg đất
trồng.
Một số nguồn khác:Từ bùn thải sinh hoạt, Cd tích lũy trong nước cống, bùn
được thải ra trong quá trình sinh hoạt hàng ngày.
Khi đã có mặt trong môi trường đất, Cd dễ dàng xâm nhập vào chuỗi thức
ăn và các loại cây ngũ cốc và rau. Tại Nhật Bản, nhiều báo cáo cho thấy các bệnh
nhân hấp thu khoảng 600µg Cd mỗi ngày do ăn gạo bị nhiễm Cd bởi nông dân sử
dụng nước sông Jintsuđể tưới tiêu, con sông này bị ô nhiễm bởi quặng và xỉ từ một
nhà máy chế biến Cd[22].

4

1.1.3

Tác động của cadimi đến môi trường và con người
Tác động đến môi trường
Nồng độ Cd trong đất vượt ngưỡng cho phépsẽ gây ảnh hưởng đến quá

trình sống của các vi sinh vật sống trong đất và đe dọa hệ sinh thái. Trong các hệ
sinh thái thủy sinh Cd có thể tích tụ trong trai, sò, tôm, tôm hùm, cá,... Sinh vật
nước mặncó khả năng chống chịu với hàm lượng Cd trong môi trường cao hơn các
sinh vật nước ngọt.
Tác động đến con người
Cadimi ảnh hưởng tiêu cực tới cơ thể con người, nó gây ra ung thư và tác
động tới hầu hết các hệ cơ quan trong cơ thể: tim mạch, thận, mắt, cơ quan sinh
sản,hệ miễn dịch, hệ thần kinh,…Khi đi vào cơ thể, Cd sẽ tác động tới thận đầu
tiên; nguyên tố này tích tụ chủ yếu ở thận; sự tích tụ này có thể dẫn đến rối loạn
chức năng ống thận.Với hàm lượng cao dẫn đến rối loạn trong chuyển hóa Ca hình
thành sỏi thận, thiếu máu và phá hủy tủy xương[3] [38] [39].
Ngoài ra, Cd cũng liên quan đến ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, những
người tiếp xúc thường xuyênvới nơi bị phơi nhiễm Cd có thể bị mềm xương và
loãng xương.Tại Nhật Bản, nhiễm độc Cddẫn đến bệnh về xương; biểu hiện của
bênh này là xương trở nên giòn, dễ gẫy, hội chứng này đã khiến hàng trăm người tử
vong. Khi hít phải khói hoặc bụi chứa Cd có thể dẫn đến một loạt các triệutrứng như
đau đầu, khó thở, đau ngực, ho có đờm lẫn máu hoặc có bọt và yếu cơ, nếu nghiêm
trọng sẽ bị phù phổi và có thể dẫn tới tử vong (thường là do hỏng thận)[3].
Trong một điếu thuốc lá có chứa khoảng 1,5- 2,0 mg Cd và người hút thuốc
hít vào 10% lượng Cd này, hút một gói thuốc lá một ngày làm tăng gấp đôi lượng
Cd đi vào cơ thể. Nuốt phải một lượng nhỏ Cd có thể gây ngộ độc và tổn
thương gan và thận. Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về ung thư (IARC) cũng cho biết
Cdlà một trong những chất gây ung thư ở người; Cd và hợp chất của nó được được

xếp vào nhóm 2A (nhóm tác nhân hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người).

5


Hình 2. Thận của bệnh nhânnhiễm cadimi.
1.2 Một số phương pháp xử lý cadimi
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xử lý ô nhiễm kim loại nặng nói chung
vàCd nói riêngnhư hóa học, hóa lý và sinh học
1.2.1

Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phương pháp dùng các tác nhân hóa học để loại bỏ

hoặc chuyển hóa (làm thay đổi bản chất) kim loại nặng trong nước thải.
1.2.2

Xử lý bằng phương pháp hóa lý
Các phương pháp hóa lý được sử dụng phổ biến hiện nay như phương pháp

kết tủa hóa học, trao đổi ion, oxy hóa-khử, hấp phụ.
Phương pháp kết tủa hóa học
Phương pháp này dựa trên phản ứng hóa học giữa chất đưa vào đất với kim
loại cần tách, ở pH thích hợp tạo thành hợp chất kết tủa, đây là phương pháp nhằm
hạn chế sự linh động của kim loại nặng trong đất.Đối với mỗi loại kim loại khác
nhau thìpH thích hợp để kết tủa là không giống nhau. Khi pH của đất lớn hơn 6.5,
đất trung tính hoặc kiềm do bón vôi, Cd bị kết tủa dưới dạng CdCO3, khi bón vôi
vào đất sẽ có tác dụng làm giảm tính linh động của Cd, từ đây chúng có thể bị cố
định nên cây trồng khó hấp thu hơn và khả năng gây độc của Cd sẽ giảm đi.

6


Phương pháp trao đổi ion.
Phương pháp trao đổi iondựa trên sự tương tác hóa học giữa ion trong pha
lỏng và ion trong pha rắn. Sử dụng ion là nhựa hữu cơ tổng hợp, các chất cao phân
tử có gốc là hydrocarbon và các nhóm chức trao đổi ion. Các vật liệu nhựa này có
thể thay thế được mà không làm thay đổi tính chất vật lý của các chất trong dung
dịch.
Phương pháp oxy hóa-khử.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự chuyển từ dạng này sang
dạng khác bằng cách thêm electron khử hoặc bớt đi electron một cặp bởi sự cho
nhận electron. Dựa trên các tính chất vật lý và hóa học của đất để tiến hành phản
ứng oxy hóa- khử tạo kết tủa làm giảm tính linh động và cố định Cd.
Phương pháp hấp phụ.
Phương pháp hấp phụ là quá trình hấp phụ chất ô nhiễmhòa tan ở bề mặt
ranh giới giữa pha lỏng và pha rắn. Thông thường quá trình hấp phụ là quá trình tỏa
nhiệt, tùy theo lực tương tác giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ mà người ta phân
biệt hấp phụ vật lý và hấp phụ hóa học.
1.2.3

Phương pháp sinh học
Hiện nay, người ta đã tìm ra nhiều loại vi sinh vật, thực vật và các chất có

hoạt tính sinh học nhằm loại bỏ Cd trong đất.
Sử dụng vi sinh vật:Một số nhóm vi sinh vật có khả năng hấp thu
kim loại nặng.Trong môi trường tự nhiên vi khuẩn Citrobacter sp có khả năng hấp
thu Cd lên tới170 % so với trọng lượng khô.
Sử dụng thực vật: Trong những năm gần đây, người ta đã quan tâm
đến công nghệ sử dụng thực vật xử lý môi trường ô nhiễm do diện tích ô nhiễm

ngày càng tăng. Một số loại thực vật đặc biệt có thể hấp thu hay tồn tại được với
nồng độ kim loại cao. Dựa vào đặc tính đó, người ta phát triển phương pháp mới để
giải quyết ô nhiễm đất gọi là “Phetoremediation”, dùng thực vật để giảm thiểu ô
nhiễm kim loại nặng[43]. Cỏ Vetiver được biết đến là loại thực vật có sức chống
chịu với Cd trong môi trường đất là rất lớn, cỏ vetiver không chỉ có khả năng sinh
trưởng, phát triển tốt trong đất có hàm lượng Cd từ 10-40ppm, mà còn có khả năng
hấp thụ và tích lũy Cd trong cây cao[4].
7


Sử dụngvật liệu sinh học: phụ phẩm nông nghiệp, nhựa sinh học,
sản phẩm do vi sinh vật tạo ra
1.3 Chất hoạt hóa bề mặt sinh học
1.3.1

Khái niệm chất hoạt hóa bề mặt sinh học
Chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) là những hợp chất có cấu trúc

đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHHBMSH là
hợp chất lưỡng cực, có cấutạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường
hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo) có khả năng làm giảm
sức căng bề mặt giữa các phân tử[1].Phần ưa nước thường là các nhóm acid amin,
peptide, sacarit đơn, đôi, polysaccarit hay một nhóm phosphat. Phần kị nước thường
là acid béo có mạch carbon dài, no hoặc không no[25].
Các CHHBMSH có cấu trúc hóa học và kích thước phân tử khác nhau từ
đơn giản như các acid béo đến phức tạp như hợp chất polymer [33]. Các
CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào phổ biến nhất là glycolipid trong đó
carbohydrates được gắn liền với một chuỗi dài axit béo, trong khi những chất khác
như lipopeptides, lipoprotein, và heteropolysaccharides phức tạp hơn[25].
CHHBMSH được tạo ra cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn cả tan trong

nước, nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc
hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không hòa tan trong nước[12].
1.3.2

Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học
CHHBMSH là một nhóm rất đa dạng và có cấu trúc hóa học khác nhau, chủ

yếu được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra.
Phân loại dựa vào thành phần hóa học:
Glucolipid: là loại phổ biến nhất của CHHBMSH, nó được nghiên cứu,
ứng dụng nhiều nhất và có hoạt tính mạnh. Glucolipid gồm các loại sau:
•

Trehaloselipid: là một phân tử đường đôi trehalose liên kết ở vị trí C6

và C6’ của mỗi glucose với các phân tử acid mycolic[7],ở các sinh vật khác nhau thì

8


kích thước và cấu trúc củủa acid mycolic, số carbon nguyên tử, và mứ
ức độ không bão
hòa cũng khác nhau.

Hình3.
3. Công thức cấu tạo của trelaloselipid
Nhiều vi sinh vậật thuộc thành viên của chi Mycobacterium tạo ra các este
trehalose trên bề mặt tế bào[12].Một số loại khác củaa trehalose ch
chứa glycolipids
được sản xuất bởi mộtt số

s vi sinh vật thuộc nhóm mycolates như Mycobacterium,
Rhodococcus, Arthrobacter, Nocardia và Gordonia[7].
• Sophorolipid:
Sophorolipid do một phân tử đường sophorose được liên
ên kkết đến một
chuỗi dài
ài axit béo hydroxy,
hydroxy có ít nhất sáu đến chín sophorosides liên kkết kỵ nước
khác nhau được tìm thấy
ấy trong hỗn
h hợp CHHBMSH[20].Phân tử đư
đường do 2 phân
tử glucose liên kết vớii nhau
nhau, nhóm OH ở vị trí C6 và C6’ bị acetyl hóa
hóa.

Hình 4. Công thức cấu tạo củaSophorolipid
Sophorolipid doo nhiều
nhi chủng nấm men thuộc chi Torulopsis sản xuất như
T.bombicola, T. petrophilum, T. apicola và các loài nấm
m men nh
như Candida

9


apicola,

Thodotorula bogoriensis, Wickerhamiella domercqiae, và Starmerella

bombicola[11].
• Rhamnolipid: do phân tử rhamnoza liên kết với một hoặc hai phân tử β
acid-hydroxydecacnoic, gồm có 4 loại: 2 phân tử đường liên kết với 2 phân tử
acid, 2 phân tử rhamnose liên kết với 1 phân tử acid, 1 phân tử đướng liên kết
với 2 phân tử acid, và một phân tử đường liên kết với một phân tử acid[15].

Hình 5. Công thức của rhamnolupid
Acid béo: là sản phẩm của quá trình oxy hóa ankan bởi vi khuẩn, nấm
men bao gồm các acid béo mạch thẳng, acid béo phức hợp chứa nhóm OH và
nhóm ankyl (corynomucolic)[26][29].
Phospholipid:là thành phần chính của màng tế bào vi khuẩn, khi vi sinh
vật sinh trưởngtrên các cơ chất là ankan thì hàm lượng phospholipid tăng
mạnh[30].Một số chủng có khả năng tạo phospholipid nhưAcnetobacter sp,
Thiobacillus Thioxydans, Athrobacter AK-19, Pseudomonas, Aeruginose 44T1 và
Aspergillus spp.
Lipopeptid và lipoprotein.
Chủng Bacillus subtilis ATCC 21332 có khả năng tạo lipolipid có hoạt tính
cao, là một trong những CHHBMSH mạnh nhất. Nó làm giảm sức căng bề mặt của
nước từ 72mN/m xuống còn 27,9 mN/m ở nồng độ thấp 0,005%[32]. Hơn nữa, nó
cókhả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, antimycoplasma và các hoạt
động tán huyết.

10


Mỗi phân tử có chứa 7 acid amin và một phần lipd trong đó gồm có 8-9
nhóm methylene và một hỗn hợp tuyến tính và đuôi phân nhánh [21].

CHHBMSH trùng hợp:
Hầu hết các CHHBMSH thuộc nhóm polyme là hỗn hợp của polysacarid

với protein cao phân tử, chúng là những chất có hoạt tính bề mặt có khối lượng rất
lớn và cấu trức phức tạp. Các chất nghiên cứu nhiều nhất được tổng hợp từ một số
thành phần nổi trội như: emulsan, lyposan, manoprotein và một số phức hợp của
polysacarid và proten khác.
Emulsan do Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (ATCC 31012) tạo ra, đơn
phân của nó chứa một trisacarid liên kết với hai acid béo. Emulsan là một tác nhân
nhũ hóa rất hiệu quả đối với hydrocarbon trong nước thậm chí ở nồng độ thấp 0,001
đến 0.01%[10].
Lyposan tạo ra từ Candida Lypolytica, là một chất nhũ hóa ngoại bào, hòa
tan trong nước, trong cấu trúc của nó chứa 17% protein và 83% hydrocarbon, các
hydrocarbon trong lyposan gồm glucose, glactose, galactosamin, acid galactorunic
[23].
Candida tropicals đã sản xuất ra một loại phức hợp manan-acid béo trên
môi trường ankan[10].
Manoprotein sp Sacharomyces cerevisiae taọ ra chứa 44% manose và 17%
protein.
Pseudomonas aeruginosa P-20 tạo ra một peptidoglycolipid chứa 52 acid
amin, 11 acid béo, 1 đường[12].
Cyanobacteria phormidium J-1 tạo ra các CHHBM là bioflocculant và
emulcyan[12].
CHHBMSH dạng đặc biệt: là CHHBMSH có cấu trúc dạng hạt, các
khoang ngoài màng tế bào phân chia các gốc HC thành các hạt nhũ tương và các hạt
nhũ này sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thu ankan bởi tế bào vi sinh vật.
Một số loài tạo ra các túi ngoại bào có tác dụng cắt hydrocarbon thành từng
phần nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các hydrocarbon vào trong
tế bào. Túi của Acinetobacter sp HO1-N có đường kính 20-50 nm và mật độ sôi
11


1,158 g/ cm3 chứa protein, phospholipid và lipopolysaccharide, chứa 5 phần

phospholipid và khoảng 350 phần polusacarid [24].
1.3.3

Tính chất của chất hoạt hóa bề mặt sinh học
CHHBMSH có một số tính chât hóa học như độc tính thấp, khả năng phân

hủy sinh học cao, tạo bọt cao, chịu nhiệt, pH và chịu lực ion tốt[12] [28].
Hoạt tính bề mặt.
CHHBM có hoạt tính tốt có thể làm giảm sức căng bề mặt của nước từ 72
mN/m xuống 1 mN/m[1].Rhamnolipd làm giảm sức căng bề mặt của nước xuống
25-30 mN/m và sức căng bề mặt giữa pha nước với hexandecan xuống dưới
1mN/m. Sophorolipid do Torulopsis bomlicola tạo ra làm giảm sức căng bề mặt của
nước xuống 33mN/m và làm giảm sức căng bề mặt giữa hai pha nước và
hexandecan xuống 5mN/m[27].
Khả năng phân hủy sinh học và tính độc thấp
So với các chất hoạt hóa bề mặt hóa học(CHHBMHH)thì các CHHBMSH
phân hủy dễ dàng hơn và có tính độc thấp hơn. Do không độc và dễ dàng phân hủy,
giá thành sản xuất lại rẻ nên chúng được ứng dụng trong các ngành công nghiệp
thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và xử lý môi trường.
Sự hình thành nhũ hóa của CHHBMSH
Các CHHBMSH khối lượng phân tử cao có khả năng nhũ hóa tốt hơn các
CHHBMSH có khối lượng phân tử thấp. Các Sophorolipid có khả năng làm giảm
sức căng bề mặt nhưng khả năng nhũ hóa không cao[11].Ngược lại, các
CHHBMSH tạo ra từ các chủng vi khuẩn thuộc chi Acinetobactercó nhũ hóa cao
nhưng khả năng làm giảm sức căng bề mặt thấp.
Đa dạng về cấu trúc hóa học
CHHBMSH là nhóm đa cấu trúc, mỗi loài vi sinh vật khác nhau có thể tạo
ra các loại CHHBMSH khác nhau có bản chất và trọng lượng phân tử khác nhau.
Với sự đa dạng này mà chúng có những đặc tính như tạo bọt, giữ ẩm, hòa tan, khả
năng hoạt động bề mặt và khả năng nhũ hóanên CHHBMSH được sử dụng rộng rãi

trong các ngành công nghiệp.
1.3.4

Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học trong đời sống
12


CHHBMSH được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghiệp, nông
nghiệp, khai thác dầu mỏ, thuộc da, thu hồi dầu, công nghệ hóa học, mỹ phẩm, dược
phẩm, thực phẩm và y học với đặc tính là nhân tố làm ướt, tạo bọt, hoạt động bề
mặt, nhũ tương hoá.
-

Trong công nghiệp thực phẩm:Sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm

như lecithin và các dẫn xuất của nó, este acid béo chứa glycerol, sorbitan, ethylene
glycol và các dẫn xuất của ethyoxylated monoglycerides đượcsử dụng như là chất
tạo nhũ trong các ngành công nghiệp thực phẩm trên toàn thế giới[9].CHHBMSH
được dùng trong sản xuất bánh mì và các sản phẩm thịt, nó ảnh hưởng đến đặc tính
của bột hoặc nhũ tương của mô mỡ.
-

Trong công nghiệp mỹ phẩm:CHHBMSH cũng đã được sử dụng làm

kem dưỡng da, chất khử mùi,sản phẩm chăm sóc móng tay và kem đánh
răng,…Sophorolipid được Công ty TNHH Kao được xem là một chất giữ độ ẩm
cho nhãn hiệu mỹ phẩm trang điểm Sofina. Qua quá trình phát triển và lên men để
sản xuất sophorolipid, công ty này đã tìm ra được ứng dụng trong các sản phẩm như
son môi và kem dưỡng ẩm cho da và tóc.
-

Trong y học: CHHBMSH cũng được ứng dụng rất nhiều. Các

Succinoyl-trehaloselipid được tạo ra bởiRhodococcus erythropolishas có khả năng
ức chế virus herpes simplex và virus cúm với liều gây chết là 10 đến 30
µg/ml[34][35]. Sunfactin là một trong những CHHBMSH có thể ức chế hình thành
cục máu đông sợi huyết và hình thành các kênh ion trong màng lipid.Một số
CHHBMSH có tính kháng khuẩn mạnh, kháng nấm và kháng virus, do các cấu trúc
đa dạng của CHHBMSH[42].
-

CHHBMSH còn có ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác như

trong lĩnh vực chế biến bột giấy và giấy, than đá, dệt may và chế biến quặng
uranium.

1.3.5

Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học đến xử lý ô nhiễm Cd
Ngoài những ứng dụng trên CHHBMSH còn được sử dụng trong xử lý đất

bị ô nhiễm kim loại nặng. Đây là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc
phục hồi đất bị ô nhiễm. Wang và Mulligan (2004) đã đánh giá tính khả thi của việc
13


sử dụng bọt Rhamnolipid để loại bỏ Cd từ đất cát, hiệu quảloại Cd lên tới 73.2%
[37].
Một nghiên cứu khác cho thấy, chủng Serratia sp có khả năng tạo polymer
ngoại bào (EPS), có khả năng liên kết với kim loại, 1g EPS hấp thụ được 170 mg

Cd[36].
1.4 Phương pháp xử lý kim loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học
1.4.1

Vi khuẩn có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học
Trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có khả năng tạo CHHBMSH như vi

khuẩn, nấm men, xạ khuẩn,… trong đó vi khuẩn chiếm đa số.Một số vi khuẩn tạo ra
CHHBMSH nhằm thích nghi với các điều kiện môi trường sống đặc biệt như trong
các bể chứa dầu, đất, trong đại dương [33].
Yakimov và cộng sự(1995) đã phân lập được chủng Bacillus licheniformis
BSA50, có khả năng sinh trưởng kị khí trong môi trường có bổ sung glucose và
0.1% NaCl tạo ra CHHBMSH có tên là lichenysin[40].
1.4.2

Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp chất hoạt hóa bề mặt sinh học

1.4.2.1

Ảnh hưởng của nguồn carbon
Nguồn carbon là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến

quá

trình

sinh

trưởng

và

tạo

CHHBMSH

của

vi

sinh

vật.Chủng

Pseudomonasaeruginosa tạo ra một chất giống protein trên nguồn hydrocarbon
nhưng không tạo ra trên glucose, glycerol hoặc axit palmitic[18]. Đối với chủng
Pseudomonas aeruginosa khi nuôi cấy trên môi trường chứa glycerol bổ sung thêm
glucose, acetate, succinate hoặc citrate vào môi trường thì rhamnolipid giảm
mạnh[17][18]. Loài Torulopsis petrophilum không sản xuất bất kỳ một loại
glycolipids nào khi nuôi trên một môi trường có chứa bất cứ nguồn carbon hòa tan
trong nước[11].

1.4.2.2

Ảnh hưởng của nitơ
Nguồn nitơlà một trong những thành phần không thể thiếu cho vi khuẩn

sinh tổng hợp CHHBMSH. Đối với chủngA. paraffineusis thì CHHBMSH tạo ra
14

nhiều khi thêm các acid amin như acid aspartic, acid glutamic, asparagine, và
glycine vào môi trường nuôi cấy [13].Tương tự, với chủng B. licheniformis BAS50
hàm lượng lichenysin-A tăng lên gấp hai hoặc bốn lần khi thêm L- gutalic và Lasparagine vào môi trường.
Robert và các cộng sự (1989) đã chứng minh rằng NO3 là nguồn nitơ tốt
nhất cho việc sản xuất CHHBMSH ở chủng

Pseudomonastrain44T1 và

Rhodococcus ST-5 sinh trưởng trên dầu oliu và dầu hỏa[31].
1.4.2.3Ảnh hưởng của các yếu tố pH
Ngoài nguồn cacbon và nguồn nitơ thì các yếu tố pHcũng ảnh hưởng tới
quá trình sản xuất CHHBMSH của vi sinh vật.Độ pH của môi trường đóng một vai
trò quan trọng trong sản xuất sophorolipid bởi chủng T.bombicola[14].Khoảng pH
7-9 thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo CHHBMSH củac chủngBacillus
licheniformis F2.
Powalla và cộng sự chứng minh rằng sản xuất lipid penta và disaccharide
bởiN. corynbacteroidesis giới hạn trong phạm vi pH 6,5 đến 8[16].
1.4.2.3

Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố không thể thiếu trong quá trình tạo CHHBMSH của vi
sinh vật. Với chủng A. paraffineus ATTCC19558, Rhodotorua erythropolis và
Pseudomonas spDSM-2874 nhiệt độ lại đóng vai trò quan trọng, nó dẫn đến sự thay
đổi thành phần trong sản xuất CHHBMSH. Loài Thermophilic Bacillussp sinh
trưởng

và

tạo

CHHBMSH

ở

nhiệt

độ

trên

40oC[8].

Bên

cạnh

đó,chủngRhodococcus sp tạo CHHBMSH tốt nhất ở 37oC(Abu-Ruwaida và cộng
sự, 1991)[5][6].

15


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1

Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn ĐM 26 được lấy từ ngân hàng chủng giống của phòng Vi

sinh dầu mỏ, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam. Đây là chủng được phân lập từ làng nghề ô nhiễm kim loại nặng
2.1.2

Hóa chất và môi trường nuôi cấy
Hóa chất : Các hóa chất được dùng cho nghiên cứu là các hóa chất tinh

khiết, hầu hết các hóa chất này được cung cấp bởi hãng Merck.
Môi trường nuôi cấy.
* Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí tổng số (g/l)
Glucose

1

KCl

0.25

Cao men

0.2

NaCl

10

Cao thịt

3

MgCl2

1.2

Pepton

5

KH2PO4

1

NH4NO3

2

Thạch

20

pH = 7÷7,2

* Môi trường khoáng cải tiến dùng cho vi khuẩn sử dụng hydrocacbon
(g/l)
NH4NO3

2

MnSO4

0.002

KH2PO4

2

CaCl2

0.002

Na2HPO4

2

CuSO4

0.002

MgSO4

0.2

FeSO4

0.002

pH=7÷ 7.2

16

2.1.3. Máy móc và thiết bị
Bảng 1: Máy móc và thiết bị
Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Bể ổn nhiệt

Memmert (Đức)

Cân phân tích

Sartorius (Đức)

Kính hiển vi quang học

Labovall (Đức)

Máy đo quang phổ

Sacoman (Pháp)

Máy li tâm

Microcentrifuge (Mỹ)

Máy vortex

Beckman (Đức)

Nồi khử trùng áp suất cao

Sturdy ( Đức)

Tủ cấy vô trùng

Việt Nam

Máy đo pH

Mettler Toledo (Pháp)

Máy lắc

Backman (Đức)

Pipetmen

Gilson (Pháp)

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hình tháikhuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
* Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc vi khuẩn tạo CHHBM trên môi
trường thạch
Môi trường thạch HKTS 0% sau khi khử trùng trong các bình tam giác
được đổ ra đĩa petri vô trùng (mỗi đĩa đổ khoảng 25ml). Sau đó bọc lại cất trong tủ
ấm trong vòng 24 giờ kiểm tra mức độ vô trùng. Những đĩa không xuất hiện vi
khuẩn sau 24 giờ được coi là sạch và sử dụng đểphân lập.

17