Nghiên cứu biểu hiện gen XBX mã hóa XYLANASE trong e COLI sử dụng VECTOR biểu hiện PET 22b(+)

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN XBX MÃ HÓA
XYLANASE TRONG E. COLI SỬ DỤNG VECTOR
BIỂU HIỆN PET-22B(+)

Người hướng dẫn

: TS. Đỗ Thị Huyền

Sinh viên thực hiện : Chu Thị Khánh Ly
Lớp

: 11-02

Hà Nội- 2015


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới GS. TS.
Trương Nam Hải, Viện trưởng Viện công nghệ sinh học và TS. Đỗ Thị Huyền,

Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt cho
em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Trong quá trình
làm việc, các thầy, cô vẫn thường xuyên trao đổi, góp ý, đem đến cho em những lời
khuyên, những nhận xét, khích lệ quý báu để giúp em hoàn thành công việc.
Với những tình cảm chân thành, em cũng xin được cảm ơn sự hướng dẫn và
giúp đỡ của toàn thể cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học,
đặc biệt là NCS. Nguyễn Thị Thảo, NCS. Phan Thị Thanh Huyền những người đã
hướng dẫn, hỗ trợ và chỉ bảo nhiệt tình về chuyên môn và kỹ năng trong suốt quá
trình em hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin được bày tỏ sự biết ơn đối với các thầy cô giáo trong Khoa Công
nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý
báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt bốn năm học tập tại trường.
Lời cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, người thân trong
gia đình, bạn bè thân thiết đã giúp đỡ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và
làm việc vừa qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Chu Thị Khánh Ly

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

i

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

MỤC LỤC 
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 
PHẦN I: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2 
1.1 Xylan ............................................................................................................... 2 
1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan ...................................................................... 3 
1.3 Tổng quan về enzyme xylanase ...................................................................... 4 
1.3.1 Khái niệm và phân loại xylansae ................................................................ 4 
1.3.1.1 Khái niệm ................................................................................................4 
1.1.1.1 Phân loại xylanase..................................................................................5 
1.3.2 Cấu trúc của xylanase .................................................................................. 6 
1.3.3 Cơ chế xúc tác của xylanase ....................................................................... 7 
1.3.4 Nguồn xylanase ........................................................................................... 8 
1.3.4.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn .......................................................8 
1.3.4.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc ......................................................9 
1.3.5 Ứng dụng của xylanase ............................................................................... 9 
1.3.5.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi .................................10 
1.3.5.2 Trong sản xuất bánh .............................................................................10 
1.3.5.3 Trong sản xuất rượu vang ....................................................................11 
1.3.5.4 Trong sản xuất cồn nhiên liệu ..............................................................11 
1.3.5.5 Trong chất hoạt động bề mặt ...............................................................11 
1.3.5.6 Trong tẩy trắng giấy và bột giấy..........................................................12 
1.4 Tách dòng và biểu hiện gen ......................................................................... 12 
1.4.1 Vector biểu hiện pET-22b(+) .................................................................... 12 
1.4.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21................................................................... 13 
1.4.3 Các nghiên cứu đã được công bố về biểu hiện xylanase ......................... 14 
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 15 
2.1 Vật liệu .......................................................................................................... 15 
2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid ............................................................. 15 
2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy .................................................................... 15 
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

ii

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

2.1.3. Hóa chất và dung dịch sử dụng ................................................................ 15 
2.1.2.1 Hóa chất ................................................................................................15 
2.1.2.2 Enzyme...................................................................................................16 
2.1.2.3 Dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli .16 
2.1.2.4 Các dung dịch dùng trong điện di DNA trên gel agarose .................16 
2.1.2.5 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide- SDS.....17 
2.1.3 Máy móc và thiết bị ................................................................................... 17 
2.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 
2.2.1 Phương pháp PCR ..................................................................................... 17 
2.2.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế báo E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt 18 
2.2.3 Tách chiết DNA lasmid từ tế bào E. coli .................................................. 19 
2.2.4 Điện di DNA trên gel agarose ................................................................... 21 
2.2.5 Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ............................................................ 22 
2.2.6 Biểu hiện gen ............................................................................................. 23 
2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamid – SDS ......................................... 23 
2.2.8 Phá tế bào bằng siêu âm tách pha protein tan và không tan..................... 24 
PHẦN III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................... 25 
3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET22xbx............................................................. 26 
3.1.1 Nhân dòng gen xbx mã hóa enzyme xylanase bằng kỹ thuật PCR ......... 26 
3.1.2 Cắt sản phẩm PCR và vector pET22b(+) bằng NcoI+XhoI ..................... 27 

3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET-22b(+) ................................ 27 
3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-xbx từ tế bào E. coli DH10B .............. 29 
3.1.5 Kiểm tra gen xbx trong vector pET-22xbx bằng enzyme hạn chế........... 30 
3.2 Biểu hiện gen xbx trong chủng E. coli BL21 ................................................ 31 
3.3 Lựa chọn điều kiện biểu hiện ........................................................................ 33 
3.3.1 Nhiệt độ nuôi cấy chủng trong môi trường có chất cảm ứng................... 33 
3.3.2 Lựa chọn nồng độ IPTG............................................................................ 34 
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 37 
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 38 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 39 

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

iii

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair

EDTA

Ethylene diamine tetra acid acetic

EtBt

Ethidium bromide

Kb

Kilobase

OD

Optical density

PBS

Phosphate buffered saline

RNAse

Ribonuclease

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

dH2O

Nước đề ion

SDS-PAGE

SDS-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis

Amp

Ampicillin

E. coli

Escherichia coli

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

iv

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................... 18
Bảng 2. Thành phần phản ứng cắt ............................................................................. 22 
Bảng 3. Thành phần các chất trong phản ứng nối ghép gen ..................................... 22 
Bảng 4. Bảng giá trị OD600 thu mẫu .......................................................................... 34 

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

v

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae ............................................... 2
Hình 2. Vị trí tấn công của các enzym vào xylan của cỏ [2].................................... 4
Hình 3. Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus halodurans .... 6
Hình 4. Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 ......................................... 7

Hình 5. Sơ đồ vector pET-22b(+)............................................................................ 13
Hình 6. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện mang gen xbx ......................... 25
Hình 7. Phân tích sản phẩm nhân gen xbx bằng kỹ thuật PCR trên gel agarose 0,8%. ..26
Hình 8. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET-22b(+) .......................... 27
Hình 9. Đĩa biến nạp pET22-xbx vào tế bào E. coli DH10B .................................. 28
Hình 10. Phân tích sản phẩm tách DNA plasmid pET22-xbx ................................ 29
Hình 11. Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra gen xbx trong plasmid pET-22b(+)
bằng enzyme hạn chế ................................................................................................ 30
Hình 12. Kết quả biểu hiện protein XBX từ dòng E. coli BL21 tái tổ hợp ............. 31
Hình 13. Kết quả kiểm tra khả năng tan của protein XBX ..................................... 32
Hình 14. Phân tích sản phẩm biểu hiện protein trong E. coli BL21 mang gen xbx ở
các nhiệt độ khác nhau. ............................................................................................. 33
Hình 15. Phân tích protein tổng số biểu hiện trong E. coli BL21 mang gen xbx ở
các nồng độ IPTG khác nhau .................................................................................... 35
Hình 16. Phân tích protein ở pha tan biểu hiện trong E. coli BL21 mang gen xbx ở
các nồng độ IPTG khác nhau .................................................................................... 35 

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

vi

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khối

khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ tấn. Tất cả mọi hoạt động của con người cũng
như các loài động vật đều cần đến thực vật. Chúng là nguồn lương thực để nuôi sống
con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho các
ngành công nghiệp. Ngày nay, phế phụ phẩm của các ngành nông, lâm nghiệp còn
được tận dụng để chuyển hóa ra nhiều chất có giá trị, điển hình là nhiên liệu sinh học
để thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Thành tế bào thực vật có
cấu tạo khá vững chắc bởi cellulose, hemicellulose và lignin cho nên để phá hủy một
phần hoặc toàn bộ chúng thì người ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit
mạnh hay kiềm mạnh để loại bỏ lignin, giải phóng cellulose, hemicellulose. Bước
tiếp theo, nguồn cellulose, hemicelluloses này cần được chuyển hóa thành đường
bằng phức hệ enzyme cellulase. Đường được tạo thành có thể được dùng để lên men
tạo ra các sản phẩm như cồn sinh học và các chất khác. Do enzyme cellulase,
hemicellulase hiện nay chưa đáp ứng được yêu cầu công nghiệp về hoạt tính và tốc
độ thủy phân, do đó nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đi tìm các enzyme mới có hoạt
tính sinh học tốt để làm giảm giá thành sản phẩm cuối cùng
Một loại enzym hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm là
xylanase. Enzym này có khả năng thủy phân hiệu quả các xylan – là thành phần chủ
yếu của hemicellulose trong thành tế bào thực vật. Xylanase có rất nhiều ứng dụng
trong công nghệ chế biến giấy và bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sản
xuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanol
sinh học) từ phế thải nông nghiệp.
Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
biểu hiện gen xbxs mã hóa xylanase trong E. coli sử dụng vector biểu hiện
pET-22b(+)”
Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

1

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 Xylan
Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấy
trong thành tế bào thực vật, là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose [1].
Trong thực tế, thành tế bào thực vật là một vật liệu phức tạp trong đó cellulose (3550%), hemicellulose (20-30%) - một nhóm cacbonhydrat trong đó dạng xylan là
loại chủ yếu - và lignin (20-30%) liên kết chặt chẽ với nhau.
Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc
acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung
được tạo bởi các gốc xylopyranose. Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu
β-1,4-glycozit. Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng
các gốc của axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2], [3].

Hình 1. Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae
Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu của thành tế bào của thực vật sống lâu
năm, từ 15-30% đối với gỗ cứng và 7-10% đối với gỗ mềm.
Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methyl
glucuronic và arabinose. Chúng liên kết với bộ khung xylan bằng liên kết α-1,3glycozit. Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm. Tỷ lệ arabinose
so với xylose thường là 0,6 [4].
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

2

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic,
axit acetic và axit uronic. Bộ khung của xylan gỗ cứng này gồm các gốc β-1,4-Dxylopyranose, trung bình cứ 10 – 20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methyl
glucuronic liên kết với nó theo kiểu α-1,2-glycozit. Xấp xỉ 60-70% các đơn vị
xylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3
và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với gốc
xylose theo kiểu α-1,2-glycozit [2], [4], [5].
1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan
Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzym trong
đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện
nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan
tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β-1,4-D-xylan
xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các
nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-Dglucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase.
Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylooligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Có nhiều công bố về
Bacillus sp [6] và một số nấm [7] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào.
Enzym α-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùng
không khử α-L-arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan.
Một lượng lớn các vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài vi khuẩn được
công bố là có khả năng sinh tổng hợp α-arabinosidase. Rhodothermus marinus là
loài chịu nhiệt có sinh enzym lớn nhất với hoạt độ 6,6 U/ml [8].
Enzym α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic
giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl. Sự thủy phân
liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự

như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase
với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp α-glucuronidase [9].
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

3

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Hình 2. Vị trí tấn công của các enzym vào xylan của cỏ [2]
Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase loại bỏ liên kết
của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose
với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6)), các gốc chuỗi bên arabinose với
axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (pcoumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì
thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự
phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với
xylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase
có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [2]
1.3 Tổng quan về enzyme xylanase
1.3.1 Khái niệm và phân loại xylansae
1.3.1.1 Khái niệm
Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có:
-

Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

4

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp
-

Khoa Công nghệ sinh học

Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong
xylan.

-

Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; βxylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-Dxylanase

-

Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase

1.1.1.1 Phân loại xylanase
Wong và các cộng sự [10] phân loại xylanase thành hai nhóm dựa vào đặc
tính lý hóa của chúng như là khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và trên các đặc
tính xúc tác khác nhau của chúng. Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá
trị pI thấp thuộc về glycanase họ 10 (trước đây gọi là họ ‘F’), trong khi đó các

endoxylanse khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được phân loại thành
glycanase họ 11 (trước đây là họ G) [11], [12].
Biely và các cộng sự [13] nghiên cứu trên sự khác biệt trong các đặc tính xúc
tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của họ 10 khác với các thành
viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kết glycozit cạnh các điểm
nhánh và hướng về đầu không khử [14]. Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai
gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo-xylanase của họ 11 cần có
ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Theo đó các endo-xylanase của họ
10 có nhiều các hoạt động xúc tác tương tự như β-xylosidase. Các endo-xylanase
của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tận cùng gắn với một gốc
xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độ aryl-β-D-xylosidase.
Sapag và các cộng sự [11] đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên
quan tới phân tích trình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ 11, để chia
xylanase thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzym của nấm.
Các enzym nhóm I và II thường là các enzym có khối lượng khoảng 20 kDa được
sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzym nhóm I có giá trị
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

5

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía axit. Các enzym của nhóm III chủ
yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được
chia thành ba nhóm là A, B và C. Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi

họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram
dương. Nhóm B và C thì chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram
dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [11].
1.3.2 Cấu trúc của xylanase
Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt
các enzym, từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans
có nét đặc trưng của họ 11 [15]. Vùng xúc tác là do phiến β tạo thành (A và B) chủ
yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như một phần
bàn tay phải được đóng lại [11]. Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các
endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba
của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β
[16], [17]. Cấu trúc toàn thể của vùng xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái
thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β [18]. Vị trí liên kết cơ chất của endoxylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ 11. Điều này
cùng với tính linh động hình thể lớn hơn của các enzym lớn hơn so với của những
enzym nhỏ hơn có thể giải thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chất thấp hơn
của endo-xylanse họ 10 [15].

Hình 3. Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus halodurans

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

6

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Các thành viên của họ 11 có vùng xúc tác được tạo thành từ các phiến β hình
thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này được so sánh
với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay
phải. Vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin
[15].

Hình 4. Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11
Xylanase có thể liên kết với ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí xúc
tác. Meagher và các cộng sự [19] nhận thấy rằng Xyn 2 của T. reesei có thể liên kết
với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng
xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được
xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [17], [20].
1.3.3 Cơ chế xúc tác của xylanase
Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của
xylanase. Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan là kết quả của sự duy
trì hay dịch chuyển của trung tâm anomer của các monomer đường khử của
cacbonhydrate. Chúng gồm một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học. Sự dịch
chuyển glycosyl thường dẫn đến sự thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa trong
trung tâm anomer và diễn ra với sự duy trì hoặc thay đổi của cấu hình anomer. Hầu
hết các enzym thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết
đến với sự thủy phân các cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomer của
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

7

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

C1. Có sự liên quan của cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomer của sản
phẩm [2]. Cơ chế dịch chuyển kép bao gồm các đặc điểm:
-

Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất

-

Một nhóm carboxyl của enzym ở trạng thái hoạt động

-

Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với
cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên
kết này đối lập với đường của cơ chất.

-

Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [2].

Leggio và các cộng sự [18] đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:
-

Xylanase nhận biết và liên kết với xylan.

-

Gốc xylosyl ở vị trí -1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía

gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên
kết cộng hóa trị enzym-cơ chất trung gian.

-

Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó
cơ chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải
phóng [18].

1.3.4 Nguồn xylanase
Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật; nhiều loại vi khuẩn
và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [10],[21]. Tuy nhiên, có
nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp
endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả. Cleemput
và các cộng sự [22] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử
là 55 kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu. Một số loài động vật thân mềm dưới
nước cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase [23].
1.3.4.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá
trình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó. Một số loài
sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp.
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

8

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Bacillus SSP-34 có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506 U/ml trong
môi trường tối ưu. Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans
tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml. Enzyme này hoạt động tối ưu ở pH 7 và
40% hoạt độ được duy trì ở pH 9,2. Streptomyces cuspidosporus sinh tổng hợp
được xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan. Bacillus sp NCL 87-610 tổng hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong môi trường có cảm ứng zeolit
và có hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80. Một chủng khác là B. circulans AB16
tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường rơm gạo.
Streptomyces sp QG-11-3 có khả năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 U/ml.
1.3.4.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc
Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu
thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn. Giá trị pH tối ưu của
xylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 đến 8 và ổn định
ở pH 5. Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối
ưu của xylanase từ nấm. Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng
xylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít
được dùng hơn so với vi khuẩn. Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác,
như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại
là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc vì môi trường cho enzym hoạt động là
môi trường axit. Nấm sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản
xuất enzym trên môi trường lỏng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được
thường thấp hơn thực tế. Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường
lỏng các sợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả trình tiếp xúc với chất dinh
dưỡng và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của
nấm dễ bị phá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzym thu được [23].
1.3.5 Ứng dụng của xylanase
Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ
sinh học, các chế phẩm enzyme nói chung và xylanase nói riêng được sản xuất ngày
càng nhiều trên quy mô công nghiệp. Trong đó, xylanase đã từng bước mang lại lợi

ích cực kỳ to lớn cho nền công nghiệp nói riêng và kinh tế nói chung. Do vậy,
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

9

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

chúng ta không ngừng tìm kiếm và ứng dụng xylanase vào những lĩnh vực khác
nhau hỗ trợ quá trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng
các hóa chất độc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp.
trong công nghiệp sản xuất bánh xylanase được dùng làm tăng độ phồng và giảm độ
dính của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất
nhiên liệu. Xylanase còn được ứng dụng làm nhiên liệu sinh học; ứng dụng trong
ngành dược phẩm và được dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.
1.3.5.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Việc sử dụng enzym xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự quan
tâm của các nhà khoa học. Sự kết hợp của xylanase với thức ăn của gà con làm
giảm độ nhớt trong ruột, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn. Kết quả là cải thiện đáng kể
trọng lượng của chúng. Theo Feoli và các cộng sự thì việc bổ xung xylanase vào bột
mì gia súc và bột đậu tương với một tỷ lệ nhất định cũng cải thiện được năng suất
và hiệu suất tiêu thụ thức ăn của lợn [24]. Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng
việc bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ ling
lăng, ngũ cốc...) đã làm tăng hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong
chăn nuôi [25].
1.3.5.2 Trong sản xuất bánh

Các xylanase cũng được cho rằng có thể cải thiện chất lượng của bánh mì với
việc làm tăng thể tích đặc trưng của bánh. Điều này càng được nâng cao khi sử
dụng chung với amylase. Xylanase có tính axit từ Aspergillus oryzae được sử dụng
để sản xuất thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loại
rượu từ gạo) và shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì). Người ta chỉ ra rằng hiệu
quả phân giải thành tế bào đậu tương và lúa mì cải thiện giá trị sử dụng các vật liệu
thô và làm giảm lượng bã ép lọc đậu tương. Multifect và Enzeko là tên thương mại
của một số các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh.
Novozyme đưa ra một số các enzym xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym
khác, để cải thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ. Một số các
enzym xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX… [25].
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

10

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

1.3.5.3 Trong sản xuất rượu vang
α-L-arabinofuranosidase và β-D-glucopyranosidase được sử dụng trong quá
trình sản xuất thực phẩm cho các chất thơm, rượu vang và nước hoa quả. Vi sinh vật
bám trên quả nho với mật độ vừa phải sẽ làm tăng các chất hóa học phức tạp và tăng
chất lượng cảm quan của rượu vang. Điều này do các vi sinh vật này sinh xylanase,
enzym này được cho rằng có khả năng giúp đỡ sự phá hủy thành tế bào của nho và
vì thế làm tăng lượng monoterpenyldiglycoside, chất mà tạo mùi thơm. Hiện nay,
chưa có một enzym thương mại nào có tiềm năng để sử dụng trong sản xuất rượu

vang và nó vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển. [25].
1.3.5.4 Trong sản xuất cồn nhiên liệu
Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế
từng bước một với các nguồn thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường và
phải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi sự khủng hoảng. Để thu được bioethanol
cần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng hóa chất, sau
đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzym hoặc
hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng là chưng cất và tinh
chế bioethanol [26]. Tuy nhiên, tiền xử lý và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giá
thành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường. Do đó mà các nhà
nghiên cứu đang cố gắng sử dụng công nghệ enzym để thực hiện quá trình này, việc
nghiên cứu tạo ra các loại enzym có hoạt lực cao, và phối hợp sử dụng các enzym
như xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh nghiên cứu.
1.3.5.5 Trong chất hoạt động bề mặt
Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạt động
bề mặt. Về phương diện thương mại, chúng được sản xuất từ các đường đơn như là
glucose và một rượu béo. Nhưng sự glycosyl hóa sử dụng polysaccharide thì dễ dàng
thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vì sự thủy phân của polysaccharide và
các bước tiếp theo có thể được bỏ qua. Xylanase từ Aureobasidium pullulans được sử
dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol and 2-ethyl hexanol thành octyl-β-Dxylobioside, xyloside and 2-ethylhexyl-β-D-xylobioside tương ứng [25].
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

11

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

1.3.5.6 Trong tẩy trắng giấy và bột giấy
Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuất
giấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây. Một
trong những ứng dụng thành công nhất là việc sử dụng endo-1,4-β-D-xylanase cho
bước tiền xử lý quá trình tẩy trắng bằng Clo và Clo dioxit. Dựa trên nghiên cứu của
một lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập để tiền xử
lý cho bột giấy kraft với xylanase đã nâng cao một cách có ý nghĩa khả năng tẩy
trắng của bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tẩy trắng bằng Clo tiếp theo. Lợi
ích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bằng xylanase là làm
nó sáng hơn, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao, và
giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tẩy trắng. Hiệu quả của tiền xử lý
bằng xylanase dựa trên các tác nhân tẩy trắng có chứa oxy được nghiên cứu với một
bột giấy kraft gỗ mềm. Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứa xylanase
12%. Xử lý enzym cũng làm loại bỏ một lượng nhỏ của lignin làm giảm giá trị kappa
của bột giấy đi 3%. Sự tăng tính nhớt có thể là do các phân tử polysaccharide khối
lượng phân tử cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại bỏ [27].
1.4 Tách dòng và biểu hiện gen
Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ thông prokaryote được sử
dụng một cách rộng rãi nhất bởi khả năng biểu hiện ở mức cao, cả trong những nghiên
cứu cơ bản và trong sản xuất thương mại. Thêm vào đó, tốc độ sinh trưởng nhanh và sự
dễ dàng trong việc nuôi cấy của E. coli khiến nó rất được quan tâm và trở thành loài
được sử dụng để biến nạp gen chủ yếu dùng để sản xuất các sản phẩm chuyển gen hiện
nay. Ngoài E. coli nấm men cũng được sử dụng khá nhiều để biểu hiện gen.
1.4.1 Vector biểu hiện pET-22b(+)
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET-22b(+) làm vector biểu hiện.
Vector pET-22b(+) có chiều dài 5493 bp (hình 5) là vector được sử dụng chủ yếu cho
tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E. coli. Về cấu tạo, vector này bao gồm:
-

Trình tự khởi đầu sao chép (ori) là vị trí gắn của DNA polymeraza, quyết
định số lượng bản sao trong vật chủ.

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

12

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp
-

Khoa Công nghệ sinh học

Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (AmpR) để đảm bảo duy trì sự
tồn tại của vector trong tế bào vi khuẩn đồng thời giúp chọn lọc các dòng
tế bào mang plasmid.

-

Vùng đa nối (multiple cloning site) có chứa điểm cắt của một số enzyme
hạn chế để thuận tiện cho việc đưa gen ngoại lai vào vector.

-

Promoter T7 kiểm soát phiên mã để nhận biết tín hiệu khởi đầu phiên mã,
từ đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen được nhân
dòng sau khi được cảm ứng.

Hình 5. Sơ đồ vector pET-22b(+)
1.4.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21
Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, thường xảy ra các hiện tượng các
protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải. Để bảo vệ các
protein ngoại lai, người ta đã tạo ra các chủng biểu hiện mang gen đột biến làm mất
khả năng tổng hợp các protease. Chủng biểu hiện E. coli BL21 là một chủng như vậy.
Tế bào E. coli BL21 chứa đột biến lon protease ( một protease nội bào) và ompT
protease ( một protease ngoại bào) nên khả năng protein bị phân hủy giảm đáng kể.

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

13

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

1.4.3 Các nghiên cứu đã được công bố về biểu hiện xylanase
Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trong
các vật chủ vi khuẩn và nấm men khác nhau. Một số ví dụ, xylanase được tách dòng
vào trong E. coli bao gồm A. oryzae (Kimura cs., 2002), A. pullulans var.
melanigenum (Ohta cs., 2001), Bacillus lyticus (Srivastava and Mukherjee,
2001),

Clostridium

thermocellum (Fernandes cs., 1999) and Caldocellum

saccharolyticum (Lüthi cs., 1990). Một số xylanase từ A. pullulans var.
melanigenum (Tanaka cs., 2004), T. lanuginosus IOC-4145 (Damaso cs., 2003) và
A. niger (Berrin cs., 2000) được biểu hiện trong Pichia pastoris [2]

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

14

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid
Chủng E. coli DH10B được sử dụng cho mục đích tách dòng gen. Chủng E.
coli

BL21

(DE3)

được

sử

dụng

làm

chủng

biểu

hiện

gen.

Plasmid pBlue-script SK (+) mang gen xbx (được đặt tên là pBlue-xbxs) do phòng
Kỹ thuật di truyền – viện Công nghệ sinh học thiết kế được sử dụng làm nguồn gen.
Plasmid pET-22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện gen.
Cặp mồi sử dụng trong phản úng PCR:
Mồi xuôi (forward primer):
TCCATGGATAACCCTTACTTACCTGCTTATG
Mồi ngược (reverse primer):
TCTCGAGTCCTTTTGTTGCAATTCAAAGGAT
2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy
-

Môi trường Luria Bertani (LB) lỏng: Cao nấm men (0, 5%), Bacto
trypton (1%), NaCl (1%).

-

Môi trường LB-Amp lỏng: Môi trường LB lỏng bổ sung ampicillin đến
nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.

-

Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung thêm 1,5% agar.

-

Môi trường chọn lọc LB-Amp đặc: Môi trường LB đặc bổ sung
ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.

2.1.3. Hóa chất và dung dịch sử dụng
2.1.2.1 Hóa chất
Các hóa chất thông dụng như EDTA, ethanol, ethidium bromide, acetic acid,
isoamyl-alcohol, ammonium persulfate (APS), methanol, SDS, acryamide, bisacrylamide, Tris-HCl, glycine, glucose, glycerol, cloroform, phenol, agarose, agar,
ampicillin, IPTG, cao nấm men đạt tiêu chuẩn phân tích có xuất xứ từ các hãng
Merck và Sigma.
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

15

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

2.1.2.2 Enzyme
Các enzyme hạn chế NcoI và XhoI; T4-DNA ligase; Taq-DNA polymerase
được mua của Fermentas; các loại đệm phù hợp và nước deion.

2.1.2.3 Dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
Môi trường: môi trường chọn lọc LBA lỏng
Dung dịch:
Dung dịch I (Sol I):
Tris-HCL, pH 8 25 mM
ADTA, pH 8

10 mM

Glucoza

50 mM.

Dung dịch II (Sol II):
NaOH

0,2%

SDS

1%.

Dung dịch III (Sol III):
Kali axetat

3M

Axit axetic

5 M.

Dung dịch đệm TE:
Tris HCl pH 8
EDTA

10 M

pH 8

1 M.

Dung dịch chloroform/isoamylalcohol (24:1): 24 lần thể tích chloroform
cộng với 1 lần thể tích isoamylalcohol.
Dung dịch phenol/choloroform/isoamylalcohol (25:24:1): 25 lần thể tích
phenol cộng với 24 lần thể tích choloroform và 1 lần thể tích isoamylalcohol.
2.1.2.4 Các dung dịch dùng trong điện di DNA trên gel agarose
Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml):
Tris

24,2%

Axit axetic

5,71%

EDTA 0,5M pH 8

10 ml.

Đệm tra mẫu (loading dye 6X):

Bromophenol blue

0,25%

Xylen cyanol FF

0,25%

Glycerol

30%.

Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml.
SVTH: Chu Thị Khánh Ly

16

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

2.1.2.5 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide- SDS
Acrylamide 30%: Cân 30 g acrylamide và 0,8 g bis-acrylamide hòa tan trong
100 ml nước cất khử trùng, bảo quản ở 4oC.
Đệm Tris-HCl, pH8,8
Tris

0,75 M

SDS

0,2% Dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8.

Đệm Tris-HCl, pH 6,8
Tris

0,25 M

SDS

0,2% Dùng HCl để chỉnh pH đến 6,8.

Đệm chạy điện di
Tris

0,05 M

Glycine

0,192 M

SDS

0,1%

SDS 10%: 10 g SDS bổ sung nước cất đến 100 ml
APS 10%: 10 g amonium persulfate bổ sung nước cất đến 100 ml.

TEMED: sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ công ty hóa chất.
2.1.3 Máy móc và thiết bị
Máy ly tâm Eppendorf; máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy điện di
DNA trên gel agarose ( Mupid, Nhật); máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy điện di
protein trên gel polyacrylamide (Bio-Rab, Mỹ); máy soi DNA trên gel agarose (BioRab, Mỹ); máy speed-Vac; tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ);
máy biến tính protein.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp PCR
 Cơ sở lý thuyết:
PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA
invitro trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp DNA kéo dài mồi dựa trên
nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo
dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

17

K18.CNSH.11-02


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba
bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi.
Thành phần phản ứng:
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR
Tổng

100 µl

H2O

53 µl

Đệm PCR 10x

10 µl

dNTP 2 mM

5 µl

MgCl2 25 mM

5 µl

Mồi xuôi 10 pmol

10 µl

Mồi ngược 10 pmol

10 µl

Plasmid pha loãng 100x

5 µl

Taq (10 u/ul)

2 µl

 Quy trình PCR
Chương trình PCR gồm 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Bước 1: Khởi đầu, đun hỗn hợp ở 94oC trong 4 phút để đảm bảo sợi DNA
cũng như mồi được làm nóng.
Bước 2: Biến tính 94oC trong 30 giây.
Bước 3: Gắn mồi ở 54oC trong vòng 1 phút.
Bước 4: Kéo dài ở 72oC trong 1 phút 30 giây.
Bước 5: Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 30 lần.
Bước 6: Tiếp tục nâng nhiệt độ lên 72oC trong 7 phút.
Bước 7: Giữ hỗn hợp ở 4oC trong 10 giờ.
2.2.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế báo E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
a. Tạo tế bào khả biến
-

Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α trong 5 ml môi trường LB lỏng
lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 37oC qua đêm.

-

Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB (pha loãng 100 làn
dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục cấy lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 37oC,
OD600 đạt 0,4-0,6. Tế bào lấy ra đặt trên đá.

SVTH: Chu Thị Khánh Ly

18

K18.CNSH.11-02