Xác định loài sán lá gan lớn (SLGL) phân lập từ bò tại một số tỉnh miền trung, tây nguyên việt nam bằng phương pháp PCR RELP và hình thái học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
tài
XÁC ĐỊNH LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN (SLGL) PHÂN LẬP TỪ BÒ TẠI
MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG, TÂY NGUYÊN – VIỆT NAM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP VÀ HÌNH THÁI HỌC

Giáo viên hướng dẫn: ThS. Đỗ Ngọc Ánh
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Khánh Hòa
p: 11-01

HÀ NỘI – 2015


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Lãnh đạo, chỉ
huy và các cán bộ thuộc Bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng, Ban giám đốc Trung
tâm nghiên cứu Y Sinh Dược Học – Học viện Quân y.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Thạc sĩ Đỗ Ngọc Ánh
– Giảng viên Bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng – Học viện Quân y,
người thầy luôn theo sát, tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
để em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các anh/chị kĩ thuật viên, đặc biệt là chị

Hoàng Thị Ngọc Diệp trong trung tâm nghiên cứu Y Sinh Dược Học Quân sự –
Học viện Quân y đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài cũng như đóng
góp những ý kiến quý báu cho luận văn của em.
Em xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện và các thầy, cô Khoa Công
nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy tận tình trong suốt quá
trình học tập, trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học, phương pháp học tập
và đã tạo cho em một môi trường làm việc tốt nhất để có thể hoàn thành được
khóa luận của mình. Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy/cô trong
Hội đồng chấm luận văn đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của
em được hoàn thiện.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã ủng hộ và
giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Khánh Hòa


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
PHẦN 1:TỔNG QUAN........................................................................................... 3
1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM BỆNH DO SLGL FASCIOLA.................................................... 3
1.1.1. Trên thế giới ..................................................................................................... 3
1.1.2. Ở Việt Nam ...................................................................................................... 4
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA FASCIOLA SPP. ........................................................ 5
1.2.1. Phân loại sinh học ............................................................................................ 5

1.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 6
1.2.3. Vòng đời sinh học ............................................................................................ 7
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DO SLGL........................................................................... 8
1.3.1. Bệnh do SLGL ở động vật ................................................................................ 8
1.3.2. Bệnh do SLGL ở người .................................................................................... 9
1.4. VAI TRÒ CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH LOÀI................................................................... 11
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL ..................................................... 11
1.5.1. Phương pháp hình thái................................................................................... 11
1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử ...................................................................... 12
1.5.3. Nghiên cứu xác định loài ở Việt Nam. ............................................................ 14

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 15
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp đo kích thước các chỉ số hình thái ........................................... 19
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử PCR-RFLP ................................................... 19
2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................ 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 27
3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁICỦA SLGL ......................................................... 27
3.1.1. Kích thước chiều dài ...................................................................................... 27


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp

3.1.2. Kích thước chiều rộng .................................................................................... 28
3.1.3. Chỉ số chiều dài/chiều rộng ............................................................................ 29

3.1.4. Kích thước khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân ....................................... 30
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ......................... 32
3.2.1. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật PCR-RFLP trong xác định loài
SLGL........................................................................................................................ 32
3.2.2. Kết quả nhân đoạn gen đích COX1 của một số mẫu SLGL phân lập ở khu vực
miền Trung-Tây Nguyên ........................................................................................... 33
3.2.3. Kết quả cắt giới hạn sản phẩm PCR để xác định và phân biệt các loài SLGL 35
3.2.4. Kết quả xác định loài dựa vào trình tự gen và so sánh trình tự đoạn gen thu
được với ngân hàng gen. ......................................................................................... 37

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 44


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp
CHỮ VIẾT TẮT

AND

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

BL

Body length (Chiều dài cơ thể)

BW

Body width (Chiều rộng cơ thể)

CS

Cộng sự

COX1

Cytocorome c oxidase subunit 1

ĐL

Đắc Lắc

KTS

Ký sinh trùng

Nad1

Nicotinamide dehydrogenease sunbunit 1

NA

Nghệ An

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

PY

Phú Yên

QN

Quảng Nam

SLGL

Sán lá gan lớn

SR

Sốt rét

TN

Tây Ninh

VS

Giác bụng

VS-P

Khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân

µl

Microlit


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/ bò ................................................................... 4
Bảng 3.1. Kích thước chiều dài của SLGL............................................................. 27
Bảng 3.2. Kích thước chiều rộng của SLGL .......................................................... 28
Bảng 3.3. Tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của SLGL .................................................... 29
Bảng 3.4. So sánh tỷ lệ BL/BW ở nghiên cứu này với nghiên cứu ở 1 số nước ...... 29
Bảng 3.5. Kích thước đoạn từ giác bụng đến cuối thân .......................................... 30
Bảng 3.6. So sánh chỉ số VS-P ở nghiên cứu này với nghiên cứu ở 1 số nước ....... 30
Bảng 3.6. Số lượng và kết quả chạy PCR .............................................................. 34
Bảng 3.7. Số lượng và kết quả cắt giới hạn sản phẩm PCR ................................... 35


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành ........................................................ 6
Hình 1.2. Hình thể trứng sán lá gan lớn ................................................................... 7
Hình 1.3. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn ....................................................... 8
Hình 2.1.Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 16

Hình 3.1. Một số mẫu sán thu từ Phú Yên ............................................................. 31
Hình 3.2. Hình thể mẫu SLGL Quảng Nam ........................................................... 32
Hình 3.3. Kết quả đo ADN tổng số một số mẫu SLGL phân lập ở khu vực miền
Trung-Tây nguyên, Việt Nam ................................................................................ 32
Hình 3.4. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi ................................................. 33
Hình 3.5. Kết quả nhân gen 16 mẫu SLGL thu thập ở các tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc,
Quảng Nam, Tây Ninh........................................................................................... 34
Hình 3.6. Kết quả nhân gen 16 mẫu SLGL thu thập ở các tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc,
Quảng Nam, Tây Ninh, Nghệ An........................................................................... 35
Hình 3.7. Kết quả cắt giới hạn 20 mẫu SLGL thu thập ở các tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc,
Quảng Nam, Tây Ninh. ......................................................................................... 36
Hình 3.8. Kết quả cắt giới hạn 14 mẫu SLGL thu thập ở các tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc,
Quảng Nam, Nghệ An. .......................................................................................... 36
Hình 3.9. Kết quả cắt giới hạn 6 mẫu SLGL thu thập ở các tỉnh Quảng Nam và
Tây Ninh............................................................................................................... 37
Hình 3.10. Trình tự đoạn ADNthu được với mồi JB4.5 của mẫu DL6 ................... 38
Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu DL6 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank. ............................................ 38
Hình 3.12. Trình tự đoạn ADNthu được với mồi JB4.5 của mẫu NA1.1 ................ 39
Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu NA1.1 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank ............................................. 39
Hình 3.14. Trình tự đoạn ADNthu được với mồi JB4.5 của mẫu QN1.1 ................ 40
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu QN1.1 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank. ............................................ 40
Hình 3.16. Trình tự đoạn ADNthu được với mồi JB4.5 của mẫu TN5 ................... 41


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu TN5 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank. ............................................ 41
Hình 3.18. Trình tự đoạn ADNthu được với mồi JB4.5 của mẫu PY9 ................... 42
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu PY9 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank ............................................. 42


MỞ ĐẦU
Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) là bệnh rất phổ biến ở động vật nhai lại như
cừu, dê, trâu, bò… trên khắp thế giới, do Fasciola hepatica(Linnaeus, 1758) và
Fasciola gigantica(Cobbold, 1885) gây ra[1], [45]. Người là vật chủ tình cờ của
SLGL khi người ăn rau sống hoặc uống nước lã có nang ấu trùng của SLGL còn
sống. Ở người, SLGL gây tổn thương chủ yếu ở gan nhưng cũng có thể gây tổn
thương ngoài gan khi SLGL lạc vị kí sinh.Tại một số khu vực trên thế giới, tỷ lệ
nhiễm SLGL ở người rất cao và nhiễm SLGL được xem là vấn đề sức khỏe được
cộng đồng đặc biệt quan tâm [59], [61].
Hai loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica có nhiều điểm giống và
khác nhau.Để phân biệt 2 loài, người ta có thể sử dụng phương pháp hình thái
học[44], [67] hoặc sinh học phân tử [6], [18], [54].Theo Periago và cộng sự
(2006)[67], dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều dài, rộng, khoảng cách từ giác
bụng tới cuối thân và tỷ lệ chiều dài/chiều rộng có thể cho phép xác định loài
SLGL. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện không cần những thiết bị phức tạp
và có thể thực hiện ở hầu hết các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho
rằng SLGL có sự đa hình về hình thái, kích thước và hình dạng của SLGL thay đổi
phụ thuộc vào vật chủ kí sinh, số lượng sán nhiễm và tình trạng dinh dưỡng của vật
chủ [27], [45]. Vì vậy, chỉ dựa vào hình thái rất khó có thể xác định SLGL là F.
hepatica hay F. gigantica[20], [27], [45].Phương pháp sinh học phân tử từ khi ra
đời đã khắc phục được những hạn chế của phương pháp hình thái.Các kỹ thuật sinh
học phân tử cho phép xác định và phân biệt 2 loài Fasciola hepatica và Fasciola

gigantica. Một số kỹ thuật đã được sử dụng để giám định và phân biệt Fasciola
hepatica và Fasciola gigantica là RFLP-PCR [48], RAPD-PCR, và PCR cơ bản kết
hợp với so sánh rình tự đoạn ADNthu được với ngân hàng gen [5], [54]…
Việc xác định loài SLGL là cơ sở để lựa chọn, thực hiện các nghiên cứu tiếp
theo nhằm tìm hiểu cơ chế bệnh sinh, nghiên cứu tạo ra các kít huyết thanh chuẩn
đoán, nghiên cứu thuốc điều trị, tình hình kháng thuốc… qua đó góp phần quan
trọng trong công tác phòng chống bệnh do SLGL gây ra ở động vật và ở người phù
hợp với điều kiện của từng quốc gia, vùng lãnh thổ.
[1]


Ở Việt Nam, việc xác định loài SLGL gây bệnh ở người và động vật đã được
một số tác giả nghiên cứu[2], [18], [20], [24]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ
dừng lại ở phân tích kích thước chiều dài, chiều rộng và việc xác định loài chỉ ở một
vài điểm cụ thể nên các kết luận đưa ra còn rất hạn chế. Vì vậy, để có thêm những
dữ liệu về hình thái và để góp phần xác định loài SLGL nhằm góp phần phòng
chống bệnh do SLGL gây ra cho động vật và người tại Việt Nam hiệu quả hơn,
chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm các mục tiêu:
1. Xác định loài SLGL ở một số tỉnh miền Trung-Tây Nguyên dựa vào
một số chỉ số hình thái.
2. Xác định loài SLGL ở một số tỉnh miền Trung-Tây Nguyên bằng chỉ
thị gen ty thể COX1.

[2]


PHẦN 1:TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM BỆNH DOSLGL FASCIOLA
1.1.1. Trên thế giới
Cho tới nay, một số loài thuộc giống Fasciola đã được mô tả nhưng chỉ 2

loài F. hepatica và F. gigantica được xác định là gây bệnh cho cả người và động vật
[60].Những nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy bệnh sán lá gan lớn ở người
là vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới [45].Bệnh
phân bố chủ yếu ở các quốc gia có tỷ lệ chăn nuôi cừu và gia súc (động vật nhai lại)
cao. Bệnh sán lá gan ở người được thông báo ở một số quốc gia thuộc Châu Âu,
Mỹ, Châu Á, Châu Phi và Châu Đại Dương. Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh ở
người ngày càng tăng tại 51 quốc gia của năm lục địa [59], [61]. Một phân tích
toàn cầu cho thấy bệnh do SLGL chỉ xuất hiện ở những vùng có mối liên hệ giữa
bệnh ở động vật với bệnh ở người và vật chủ trung gian có các điều kiện thuận
lợi để phát triển. Một số nghiên cứu cho rằng, bệnh do SLGL ở người không liên
quan với bệnh do SLGL ở thú.
Ở Châu Á, bệnh sán lá gan ở vật nuôi tập trung ở một số nước như: Thái
Lan, Iran, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ…Trong đó bệnh SLGL ở người được
thông báo nhiều nhất ở Iran, đặc biệt tỉnh Gilan, khu vực gần biển Caspian. Tại các
quốc gia Đông Á, bệnh do SLGL ở người xuất hiện rải rác. Một số trường hợp bệnh
SLGL ở người thông báo tại Nhật Bản, Việt Nam, Thái Lan [59], [61].
Hậu quả SLGL gây ra cho người rất khác nhau.Khi mang ấu trùng
(metacercaria) xuyên qua thành ruột hoặc tá tràng gây xuất huyết và viêm, giai đoạn
này các tổn thương có thể gây triệu trứng không rõ rệt. Quá trình kí sinh ở gan
SLGL gây tiêu hủy tổ chức gan lan rộng, gây chảy máu và phản ứng viêm, phản
ứng miễn dịch. Sán có thể vào đường mật và ở đây chúng có thể sống vài năm gây
viêm nhiễm dẫn tới sơ hóa, dầy lên và giãn rộng, có thể chảy máu đường mật [1],
[14], [45], [61].
Đặc biệt SLGL có quá trình di chuyển lạc vị trí nên có thể gây bệnh ở các cơ
quan ngoài gan.Ở người, vị trí tổn thương ngoài gan thường gặp nhất là đường tiêu
hóa [45]. Các vị trí lạc chỗ khác được thông báo là: mô dưới da, tim, mạch máu,
[3]


phổi và khoang màng phổi, não, hốc mắt,thành bụng, ruột thừa, tuyến tụy, lách, u ở

vùng hang [1], [8], [15], [31], [45]. Ở các vị trí lạc chỗ SLGL không bao giờ phát
triển thành con trưởng thành [10], [45]. Các biểu hiện thông thường của tổn thương
ngoài gan là do dấu vết di cư gây tổn thương mô dẫn tới viêm và xơ hóa. Ở các vị
trí ký sinh ngoài gan, SLGL có thể bị vôi hóa hoặc tạo thành dạng u hạt [45]. Nhìn
chung bệnh ngoài gan do SLGL hiếm gặp và khó chẩn đoán. Bệnh thường được
chẩn đoán tình cờ (trong phẫu thuật) hoặc khi SLGL có lối thoát để bò ra [14], [15], [31], [45].
1.1.2. Ở Việt Nam
* Nhiễm SLGL trên trâu/bò
Tại Quảng Nam, Nguyễn Khắc Lực và cộng sự (2010)[16] tiến hành nghiên
cứu xác định tỷ lệ nhiễm SLGL trên 245 trâu/bò bằng phương pháp tìm trứng trong
phân. Kết quả cho thấy, tỷ lệ nhiễm chung là 40.8% và tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu
(43.2%) cao hơn bò (38.3%). Một nghiên cứu tương tự của Võ Thị Hải Lê (2010)
tại Nghệ An cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu là 61.6% và ở bò là 26.86%. Theo
các tác giả, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu cao hơn bò là do đặc tính ưa cỏ ngập nước của
trâu, trong khi đó ở bò ít hơn. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/bò trong nghiên cứu của
Nguyễn Khắc Lực (2010) [16] và Võ Thị Hải Lê (2010) [39] cao hơn của Lê Thị
Tuyết vàcs (2009)[13] nghiên cứu tại Nam Định (35.3%) và cao hơn của Phạm Văn
Lực và cs (2006)[35] nghiên cứu tại Đắc Lắc (34.22%).
Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/ bò
Loài gia súc

Tuổi (năm)

Tổng số

Số nhiễm

Tỷ lệ %

1-3

43

16

37.2

4-8

42

18

42.9

>8

40

20

50.0

Tổng số

125

54

43.2

1-3

40

12

30.0

4-8

36

14

38.9

>8

44

20

45.5

Tổng số

120

46

38.3

245

100

40.8

Trâu

Bò

Tổng số

(Trích nghiên cứu của Nguyễn Khắc Lực và CS, 2010)

[4]


Về tỷ lệ nhiễm theo tuổi, theo hầu hết các nghiên cứu, ở cả trâu và bò, tuổi
càng cao thì tỷ lệ nhiễm càng cao [16], [39]. Theo Nguyễn Khắc Lực (2010)[16],
nhóm trâu/bò độ tuổi >8 năm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (50% ở trâu và 45.5% ở bò).
Giải thích về vấn đề này, tác giả Nguyễn Khắc Lực (2010) cho rằng tuổi trâu/bò
càng cao thì sự tiếp xúc với ngoại cảnh càng dài và cơ hội ăn phải nang ấu trùng
SLGL (metacercaria) càng cao. Hơn nữa, SLGL trưởng thành sống trong gan của
trâu/bò tương đối dài (3-5 năm, thậm chí 10 năm).Võ Thị Hải Lê (2010)[39] cũng có
cùng quan điểm này.
*Nhiễm SLGL ở người
Theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008)[3], thống kê đến năm 2006 số bệnh nhân

mắc bệnh sán lá gan lớn (SLGL) là 2.428 và đến tháng 3 năm 2008 con số này đã
lên trên 5.000. Năm 2008, bệnh SLGL được xác định phân bố ở 47 tỉnh thành từ
Bắc vào Nam. Nhưng đến năm 2012, theo Nguyễn Văn Đề và cs[30], đã có 52 tỉnh
thành có lưu hành bệnh do SLGL và số người mắc bệnh lên tới trên 20.000 người.
Trong một nghiên cứu gần đây, tỷ lệ nhiễm SLGL trên nhóm người được chuẩn
đoán u gan tại Hà Nội là 32.7% (111/339), trong đó nam giới chiếm 59.5% và nữ
giới chiếm 40.5% [30].
Trước đây, một số tác giả cho rằng ở Việt Nam có lưu hành của cả 2 loại
SLGL là F. hepatica và F. gigantica. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây sử dụng
sinh học phân tử để xác định loài SLGL cho thấy SLGL ở cả người và động vật ở
Việt Nam là loài F. gigantica [2], [5], [6], [12], [19], [30], [24], [26], [28], [29], Một
số cho rằng, nhiều mẫu sán ở Việt Nam có sự lai ngoại loài giữa F. hepatica và F. gigantica.
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA FASCIOLA SPP.

1.2.1. Phân loại sinh học
[5]


Theo Dunn (1978) và Soulsby (1982), sự phân loại của SLGL trong sinh giới
như sau:
Ngành: Giun sán
Lớp: Giun dẹt
Dưới lớp: Lưỡng tính
Họ: Sán lá
Giống (chi): Fasciola
Loài: Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 và
Fasciola gigantica Cobbold, 1885
1.2.2. Đặc điểm hình thái
* Hình thể con trưởng thành

A

B

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành

(A: F. gigantica, B: F. hepatica)
Con trưởng thành của F. hepatica có dạng hình lá dẹt (Hình 1.1), hình dạng
đặc trưng cho các loài sán lá.Kích thước từ 20-30 mm chiều dài và 8-15 mm chiều
rộng [10], [45], [62].Cơ thể của nó kéo dài về phía trước phía đầu có dạng hình nón,
trên đó có giác miệng xấp xỉ như nhau. Hình thể của Fasciola gigantica có một số
điểm khác biệt với Fasciola hepatica là kích thước thường dài hơn, trung bình 2575 mm chiều dài và 15mm chiều rộng [62]. Ngoài ra, tỷ lệ phần đầu hình nón thì
nhỏ hơn của F. hepatica và phần cơ thể của nó hình dạng giống chiếc lá

[6]


hơn[45].Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loài này về mặt hình
thái.
*Hình thể trứng

Hình 1.2. Hình thể trứng sán lá gan lớn

Trứng sán F. hepatica thường có kích thước 150 × 90 µm và hình dạng cũng
rất giống với trứng của F. gigantica (Hình 1.2).Có thể thấy các trứng của F.
gigantica với kích thước lớn hơn (200 × 100µ). Trứng SLGL có vỏ màu vàng nâu
với một nắp không rõ ràng và các tế bào phôi nằm bên trong. Trong khi đó
Paramphistome vỏ có màu trong suốt, nắp rõ ràng và các tế bào phôi sáng màu bên
trong trứng. Bên cạnh đó trứng có một mấu nhỏ nằm phía sau của trứng [10], [45], [62].
1.2.3. Vòng đời sinh học

Vòng đời của SLGL tiêu biểu cho lớp sán lá. Sán lá gan lớn trưởng thành đẻ
trứng ở đường dẫn mật của vật chủ, trứng theo mật vào đường tiêu hóa của vật
chủ.Sau đó trứng theo phân rời khỏi cơ thể vật chủ ra ngoài môi trường. Sau đó
thành ấu trùng lông (miracidium) thoát vỏ di chuyển ngoài môi trường và bơi lội
trong nước.Đặc điểm bơi lội giúp ấu trùng lông có thể tìm và xâm nhập vào vật chủ
phụ (vật chủ trung gian) là ốc thuộc giống Limnae.Những trùng lông không tìm
được vật chủ sẽ chết trong vòng 24h.Sau khi xâm nhập vào ốc, ấu trùng mất lông và
trở thành bào nang (sporocyst).Bào nang phân chia và phát triển thành redia.Redia
tiếp tục phát triển thành ấu trùng đuôi (cercaria). Nhìn chung, 4-7 tuần sau khi
nhiễm, cư trú và phát triển trong cơ thể ốc, ấu trùng đuôi được hình thành sẽ rời
khỏi ốc ra ngoài môi trường, bám vào lá cỏ ngập nước hoặc là các loài rau khác
giống như cải xoong. Sau đó ấu trùng rụng đuôi tạo thành nang ấu trùng
(metacercaria) với 4 lớp bao bọc.
[7]


Hình 1.3. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn

Các nang ấu trùng (metacercaria) nằm trong thực vật thủy sinh được động
vật ăn cỏ và người ăn vào. Khi đến ruột chúng xuyên qua ruột non, đi vào khoang
phúc mạc. Từ đó, nó di chuyển trực tiếp đến gan.Quá trình di chuyển từ đường tiêu
hóa đến gan mất khoảng 7 ngày.Các sán lá gan chưa trưởng thành ngay mà nó chui
vào nhu mô gan và tiếp tục di chuyển sâu vào trong gan. Ở trong gan chúng chủ yếu
ăn máu. Sau giai đoạn này, sán lá gan lớn xâm nhập vào ống dẫn mật và phát triển
thành con trưởng thành tại đây.Thời gian kể từ khi nhiễm vào cơ thể vật chủ đến khi
hoàn toàn trưởng thành mất khoảng 3 tháng. Sán lá gan lớn sau khi trưởng thành bắt
đầu đẻ trứng và trứng lại tiếp tục thực hiện vòng đời tiếp theo. Con trưởng thành có
thể sống sót nhiều năm ở trong gan của vật chủ.
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DO SLGL.
1.3.1. Bệnh do SLGL ở động vật

1.3.1.1. Đặc điểm lâm sàng
-Con vật suy nhược, ăn ít
-Niêm mạc nhợt nhạt, lông xù xì dễ nhổ nhất là 2 vùng bên sườn và dọc
xuống ức.
[8]


-Thủy thủng ở mắt, yếm ngực, nhai lại yếu, khát nước, tiêu chảy xen lẫn
táo bón, thú gầy dần, con vật ho, nặng thì thú có thể chết, vàng da.
- Phù thũng ở những vùng thấp của cơ thể như 4 chân, nách, ngực, vùng hầu.
1.3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng
- Trên mặt gan của gia súc bị bệnh có vết di hành của sán lá ( màu vàng trắng) và
xuất huyết do các mô bị phá hủy. Nặng sẽ gây xơ gan.
- Ống mật trong gan dày lên rõ rệt, giống cành cây, mổ ra có nhiều sán lá ký sinh
trong đó, viêm loét ống dẫn mật.
- Hàng ống dẫn mật giảm có mủ, gan có những điểm hoại tử, niêm mạc tăng sinh
thành những u trong đó có nhiều bạch cầu hạt.
1.3.2. Bệnh do SLGL ở người
1.3.2.1. Đặc điểm lâm sàng
Bệnh sán lá gan lớn được chia ra làm các thời kỳ: thời kỳ ủ bệnh (từ khi nang
ấu trùng xâm nhập vào cơ thể đến khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên); thời
kỳ toàn phát (sán lá gan di chuyển vào đường mật); thời kỳ bệnh tiềm tàng (sán
trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng); và thời kỳ tắc nghẽn hay mạn tính [45], [58], [61].

* Thời kỳ ủ bệnh: Triệu trứng của thời kỳ ủ bệnh rất thay đổi phụ thuộc vào
số lượng ấu trùng xâm nhập và sự đáp ứng của cơ thể vật chủ.
* Thời kỳ toàn phát:
Các triệu chứng cơ năng xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn này là:
-Sốt:sốt bất thường, có thể sốt cao, có hiện tượng rét run hoặc có thể thoáng qua rồi
hết, đôi khi sốt kéo dài.

-Đau bụng: đau bụng từ nhẹ đến đau quằn quại, đau có lúc khu trú, có lúc lan
rộng, nhưng vị trí thường ở bên phải, phía dưới hạ sườn [1], [10], [45], [61].
-Rối loạn tiêu hóa: mệt mỏi, chán ăn, cảm giác đầy bụng khó tiêu, rối loạn
tiêu hóa, buồn nôn, gầy sút cân [1], [45].
-Nổi mày đay: là đặc điểm cần phân biệt trong giai đoạn sớm của bệnh khi
sán mới xâm nhập.
-Triệu chứng ở phổi: ho, khó thở, ho ra máu và đau ngực [45].
Các triệu chứng thực thể:

[9]


-Gan và lách to: Gan thường to ra và mềm, có thể sờ thấy dễ dàng trong
trường hợp gan to ra [1].
-Cổ trướng: dịch cổ trướng màu vàng với tỷ lệ bạch cầu tăng cao [1], [45].
-Thiếu máu: da xanh, niêm mạch nhợt, hoa mắt, chóng mặt và cảm giác mệt mỏi [45].
-Dấu hiệu ở ngực: Nghe phổi có thể thấy các ran ẩm, ran ngáy ở đáy phổi,
tràn dịch màng [15].
-Vàng da: ít gặp trong thời kỳ này và nó biểu hiện rõ ràng hơn trong thời kỳ
bệnh mãn tính [45].
*Thời kỳ bệnh tiềm tàng: Giai đoạn này có thể kéo dài nhiều tháng hoặc
nhiều năm.
*Thời kỳ mạn tính:
Trong giai đoạn này, đau bụng thượng vị, không dung nạp thức ăn béo, buồn
nôn, vàng da, ngứa, đau góc trên bên phải bụng… Gan có thể to ra và làm cho lách
to ra hoặc cổ trướng [1], [2], [10], [45] . Ống mật căng và dày lên, đường kính ống
mật có thể tang 1,5-3,0 lần kích thước bình thường.
1.3.2.2. Đặc điểm cận lâm sàng
* Xét nghiệm máu: Trong giai đoạn cấp tính, số lượng bạch cầu thường tăng
trên 10.000 đến 43.000/ mm³ máu.

*Xét nghiệm chức năng gan:
-Giai đoạn cấp tính: GOT, GPT, hlobulin và bilirubin tăng nhẹ trong hầu hết
các trường hợp [45].
-Giai đoạn mạn tính: Vàng da, nước tiểu màu vàng sẫm [45].
*Chẩn đoán hình ảnh:Siêu âm cho thấy hình ảnh tổn thương gan là những ổ
âm hỗn hợp hình tổ ong hoặc có thể thấy hình ảnh tụ dịch dưới bao gan [1].
*Chẩn đoán miễn dịch: Kỹ thuật miễn dịch hay được sử dụng nhất là ELISA [1].
*Xét nghiệm phân:Kỹ thuật làm lắng để tìm trứng được chứng minh là ưu
điểm hơn các phương pháp khác [45]. Cần xét nghiệm phân trong 3 ngày liên
tiếp.Chúng ta có thể lấy dịch mật để phát hiện sự có mặt của trứng [1].

[10]


1.4. VAI TRÒ CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH LOÀI
Năm 1995, Tổ chức Y tế thế giới(WHO) thông báo phát hiện bệnh sán lá gan
lớn ở 65 quốc gia và vùng lãnh thổ với gần 180 triệu dân nằm trong vùng nguy cơ
và khoảng 2,4 triệu người dân nhiễm bệnh. WHO coi đây là bệnh cần được quan
tâm trong chương trình sức khỏe cộng đồng và đã được nhiều quốc gia xếp vào vị
trí quan trọng trong chiến lược và chính sách y tế [45].
Bệnh sán lá gan lớn có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể
người bệnh cả về thể chất lẫn tinh thần nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm,
đúng cách.Những lý do trên là nguyên nhân gây tổn thất rất lớn về sức khỏe cũng
như kinh tế cho gia đình và xã hội.
Phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể là phương pháp PCR-RFLP từ khi
ra đời đã tỏ ra ưu việt trong chẩn đoán và phân loại bệnh tật liên quan đến ký sinh
trùng.Nhờ phương pháp này người ta có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh
từ rất sớm, ngay cả khi bệnh tiềm tàng chưa có triệu chứng.Điều này giúp cho các
nhà điều trị lựa chọn các biện pháp thích hợp, hiệu quả, ít tốn kém, góp phần ngăn
chặn những hậu quả mà bệnh gây ra.

Bên cạnh hỗ trợ chẩn đoán sớm căn nguyên gây bệnh, phương pháp này còn
có thể xác định được cấu trúc gen của vi sinh vật, qua đó giúp các nhà khoa học xác
định được sản phẩm do gen đó tạo ra. Trên cơ sở đó định hướng sản xuất kháng
nguyên đặc hiệu sử dụng cho phương pháp chẩn đoán miễn dịch học [11], [75].
Sán lá gan lớn Việt Nam được xác định là F. gigantica có mặt ở cả Bắc,
Trung, Nam. Việc xác định loài và phân tích một phần gen của Fasciola sp. gây
bệnh từ các vùng địa lý sẽ góp phần nghiên cứu ký sinh trùng ở Việt Nam dưới góc
độ phân tử. Qua đó có cơ sở tìm hiểu cơ chế bệnh sinh, sản xuất các kít chuẩn đoán
huyết thanh, nghiên cứu các loại thuốc, tình trạng kháng thuốc, vacxin giúp cho quá
trình phát hiện, phòng chống bệnh này một cách hiệu quả.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL
1.5.1. Phương pháp hình thái
Nhiều tác giả cho rằng.hình thể của F. gigantica và F. hepatica có nhiều
điểm khác nhau. Điểm khác biệt dễ thấy nhất là F. gigantica có kích thước dài hơn,
trong khi F. hepatica có kích thước ngắn hơn.Theo một số tác giả, dựa vào một số
[11]


chỉ số hình thái có thể xác định và phân biệt các loài SLGL.Các chỉ số cơ thể
thường được sử dụng là tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng thân sán (BL/BW) và
khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân (VS-P). Theo một nghiên cứu của Periago
và cs (2006), chỉ số BL/BW của F. hepatica 1.29-2.80 mm, của F.gigantica3.406.78 mm; chỉ số VS-P của F. hepatica 8.86-25.08 mm, của F. gigantica 26.28-50.09
mm. Tuy nhiên, chỉ số này thay đổi phụ thuộc SLGL ở vật chủ ký sinh nào, khu vực
nào… Một số nghiên cứu cho thấy, các chỉ số BL/BW và VS-P có sự khác biệt căn
bản giữa F. hepatica và F. gigantica. Một số khác lại cho thấy các chỉ số này có
một phần gối lên nhau. Chính điềunày gây rất nhiều khó khăn trong việc xác định
loài sán bằng hình thái học.
1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử
1.5.2.1. Đặc điểm hệ gen ty thể và vai trò của hệ gen ty thể trong giám định loài
Hệ gen ty thể là một vòng kép ADN có kích thước khoảng 16-20 kb, gồm

36-37 gen mã hóa cho 12-13 loại protein, 2 ARN ribosome (rARN) và 22 ARN vận
chuyển (tARN).Các protein được mã hóa trong hệ gen ty thể là các enzyme tham
gia vào các quá trình hô hấp của tế bào trong hoạt động sống[20].
Vị trí trong tế bào chất, số lượng bản sao nhiều của ADN ty thể đã quy định
những đặc điểm di truyền của ty thể, đó là [45], [75]:
-Di truyền theo dòng mẹ;
- Tỷ lệ đột biến cao hơn hệ gen nhân;
- Sao chép độc lập với quá trình phân bào;
- Các đột biến ADN ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và
phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan đến sự biến đổi
ty thể. Đối với ký sinh trùng, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể, có giá trị định hướng
trong phòng chống, đặc biệt tìm kiếm hóa chất, hóa dược, hoặc thực nghiệm các
loại vacxin thế hệ mới.
Đối với lớp sán lá (trematoda) hệ gen ty thể được xác nhận là chỉ thị phân tử
thiết yếu trong công tác giám định, thẩm định loài [11], [52], [75]. Trên thực tế, các
gen nad1, cox1, cob thường được sử dụng để giám định và định loại các loài có họ
hang gần gũi; các gen nad3, 16S, 12S, vùng không mã hóa thường được sử dụng
trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài có họ hàng xa.
[12]


Các gen ty thể là cấu trúc di truyền đại diện cho dòng mẹ, do vậy, khi giám
định các loài có khả năng lai hay trong vùng tạp lai ngoại loài nhất thiết cần xem xét
thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2), vì gen nhân đại diện di truyền cho dòng bố.
Từ đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay mẹ [11].
1.5.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong xác định và phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica
Trong hai thập kỉ qua, công nghệ ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
trong xác định và phân biệt loài sán lá gan đã có những định hướng phát triển vượt
bậc. Nhiều công cụ khác nhau đã được thiết kế để xác định và phân biệt giữa F.
hepatica và F. gigantica như: PCR cơ bản kết hợp giải trình tự, SSCP-PCR… Một

trong những thành tựu lớn của nhân loại là sự phát triển phương pháp nhân bản
ADN bằng kỹ thuật đa mồi, đó là kỹ thuật multiplex-PCR (multiplex polymerase
chain reaction) tạo sản phẩm ADN mạch thẳng và kỹ thuật LAMP (loop-mediated
isothermal amplification) đa mồi nhân bản ADN phát hiện đơn khuôn, tạo sản phẩm
ADN cấu trúc vòm. Nếu sử dụng ARN làm khuôn, sau khi chuyển đổi sang ADN
bằng phản ứng sao chép ngược (reverse transcription), cả PCR và LAMP cũng đều
có thể thực hiện quá trình tổng hợp chuỗi nucleotide cho sản phẩm ADN [39].
Multiplex-PCR đã được xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài
sán lá/sán dây, bao gồm sán lá gan nhỏClonorchis sinensis và Opisthorchis
viverrini; sán lá gan lớn F. hepatica và F. giganticatừvật chủ trung gian; sán lá phổi
Paragonimus.spp; sán dây Taenia saginata, Taenia solium, Taenia saginata
asiatica và ấu trùng sán lợn. Còn đối tượng của LAMP là các loài sán dây
Taenia.spp, sán lá gan lớn F. hepatica và F.gigantica;sán dẹt, trong đó có loài sán
máng Schistosoma japonicum [39].
Bên cạnh PCR sử dụng khuôn ADN, còn có RT-PCR sử dụng khuôn ARNvà
bên cạnh LAMP sử dụng khuôn ADN, còn có RT-LAMP sử dụng khuôn ARN.Cả
hai phương pháp PCR/RT-PCR và LAMP/RT-LAMP đều sử dụng cùng lúc nhiều
mồi (từ 2 mồi trở lên); sử dụng ADN hay ARN làm khuôn cung cấp vùng gen đích;
sử dụng các dẫn chất deoxy-nucleotide triphosphate (dNTP) làm nguyên liệu kiến
tạo; sử dụng một loại ADN polymerase làm enzyme để xúc tác tổng hợp chuỗi
nucleotide; sử dụng các thành phần làm phụ trợ cho phản ứng hoạt động trong đó có

[13]


i-on Mg++ có vai trò quan trọng; và xác nhận kết quả bằng cách đánh giá sự hiển thị
của sản phẩm ADN trong điều kiện thích hợp [39].
Đặc biệt ở nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tìm hiểu sâu về kỹ thuật PCRRFLP để xác định và phân biệt 2 loài sán lá gan F. hepatica và F. gigantica.
1.5.3. Nghiên cứu xác định loài ở Việt Nam.
Trong nước, nghiên cứu sán lá gan lớn dưới góc độ phân tử được một số tác

giả thực hiện từ năm 2002.Bước đầu, các nghiên cứu này đã giúp xác định loài sán
lá gan lớn gây bệnh ở nhiều điểm khác nhau trong nước. Các công trình nghiên cứu
sau này bằng sinh học phân tử đã khẳng định loài F. gigantica gây bệnh chủ yếu
cho gia súc ở Việt Nam[2], [5], [6], [18], [19], [20], [24], [25], [26], [27], [29]. Một
số nghiên cứu khác sử dụng hệ gen nhân và hệ gen ty thể đã cho kết luận sán lá gan
lớn gây bệnh trên người và trên động vật ở Việt Nam là F. gigantica có lai với F.
hepatica [12], [20].Các nghiên cứu trong nước chủ yếu sử dụng các gen nad1, cox1,
thuộc hệ gen ty thể và ITS-2 thuộc hệ gen nhân [20] trong giám định thành phần loài.

[14]


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các mẫu SLGL trưởng thành thu thập từ bò ở các
địa điểm Nghệ An (2 mẫu), Tây Ninh (4 mẫu), Quảng Nam (10 mẫu), Đắc Lắc (10
mẫu), Phú Yên (11 mẫu).
Phương pháp thu thập mẫu:
Con sán trưởng thành được thu thập tại các lò mổ ở các tỉnh trên, sau đó
được rửa sạch bằng nước muối sinh lý và bảo quản trong cồn 70˚ cho đến khi thực
hiện các phân tích hình thái và phân tử.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên máy, thiết bị

Hãng sản xuất

1

Máy ly tâm lạnh Mikro 22R

Hettech (Đức)

2

Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700 AB)

Applied BioSciences (Mỹ)

3

Máy soi và chụp gel ChemiDocTM MP

Bio-Rad(Pháp)

4

Máy lắc ấm Thermomixer Comfort

Eppendorf (Đức)

5

Máy votex

Gyromax 737R (Đức)

6

Bộ pipet 1 kênh

Nychiro (Nhật Bản)

7

Cân điện tử

Labnet (Mỹ)

8

Tủ lạnh -20˚C, -80˚C

Sanyo (Nhật Bản)

9

Lò vi sóng

Sanyo (Nhật bản)

10

Bộ điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Bio-Rad (Pháp)

11

Hệ thống xác định trình tự ABI 3130

Applied Biosystems (Mỹ)

12

Eppendorf 1,5ml

Eppendorf (Đức)

13

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Nuaire (Mỹ)

14

Falcon các loại 15ml, 50ml

Operson (Trung Quốc)

15

Đầu côn các loại: 10, 200, 1000µl

Operson (Trung Quốc)

[15]


Hình 2.1.Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

[16]


2.1.2.2. Hóa chất

STT

Tên sinh – hóa chất

Hãng sản xuất

1

Agarose

Sigma (Mỹ)

2

Ethanol tuyệt đối

Fermentas (Mỹ)

3

Ethydium Bromide

Merck (Đức)

4

10X TBE buffer

Fermentas (Mỹ)

5

Water, nuclease-free

Thermo Scientific (Mỹ)

6

Bộ kít tách chiết ADN tổng số

Qiagen (Mỹ)

7

Loading Dye 6X

Biolab (Anh)

8

Thang chuẩn ADN 100bp

Fermentas (Mỹ)

9

Tango Buffer

Thermo Scientific (Mỹ)

10

Master mix

Thermo Scientific (Mỹ)

11

Enzym Rsa1

Thermo Scientific (Mỹ)

12

Bộ kít tinh sạch ADN

Promega (Mỹ)

Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR
Gene

đích

Nguồn
Mồi

Trình tự mồi

tham

KT

khảo
5’-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT T
JB3

AT-3’
Simsek et

COX1

5’-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA
JB4.5

ATG-3’

[17]

al (2011)

446bp