Nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm (fusarium) gây bệnh cây trồng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.13 MB, 45 trang )
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----
-----
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng
kháng nấm (Fusarium) gây bệnh cây trồng
Giáo viên hướng dẫn : PGS. TS. Tăng Thị Chính
Sinh viên thực tập
: Trương Thu Hương
Lớp
: 11-01
Hà Nội – 2015
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Tăng Thị Chính - Trưởng phòng Vi
sinh vật môi trường - Viện công nghệ môi trường đã tận tình hướng dẫn, định
hướng và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Đặng Thị Mai Anh đã trực tiếp hướng dẫn và
đóng góp nhiều ý kiến quý báu, chỉ bảo tôi suốt quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các anh, chị phòng Vi sinh vật môi trường đã tạo
điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học, trường Viện
Đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ tôi, cho tôi kiến thức và kinh nghiệm bổ ích trong
suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình thân yêu, người thân, bạn
bè luôn ở bên tôi, cho tôi nguồn động lực, chia sẻ và giúp tôi hoàn thành tốt trong
quá trình học tập và nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Trương Thu Hương
Trương Thu Hương
i
Lớp:11_01
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Khái quát về nấm Fusarium..................................................................... 3
1.2. Ảnh hưởng của nấm Fusarium đối với cây trồng ..................................... 4
1.3. Một số biện pháp phòng trừ nấm Fusarium ............................................. 5
1.3.1. Biện pháp canh tác ............................................................................. 5
1.3.2. Biện pháp hóa học ............................................................................. 6
1.3.3. Biện pháp sinh học............................................................................. 7
PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU ................................................... 10
2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................. 10
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 10
2.1.2. Chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu .................................... 10
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................... 10
2.1.4. Môi trường....................................................................................... 10
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 11
2.2.1. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm Fusarium gây bệnh
của các chủng vi sinh vật bằng thỏi thạch .................................................. 11
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm bằng giếng thạch ........ 12
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng kháng
Fusarium của các chủng VSV tuyển chọn ................................................. 12
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng nấm của
các chủng vi sinh vật ................................................................................. 13
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH ............................................................. 13
Trương Thu Hương
ii
Lớp:11_01
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 14
3.1. Kết quả bước đầu tuyển chọn chủng VSV có khả năng ức chế nấm
Fusarium ....................................................................................................... 14
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính kháng nấm
Fusarium của các chủng VSV đã tuyển chọn ................................................ 17
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .......................................................... 17
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................... 24
3.2.3. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ............................................................ 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 36
1.
Kết luận ................................................................................................ 36
2. Kiến nghị ................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 37
Trương Thu Hương
iii
Lớp:11_01
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Từ viết tắt
Nội dung
1
VK
Vi khuẩn
2
XK
Xạ khuẩn
3
VSV
Vi sinh vật
4
MPA
Meet Peptone Agar
5
TN
Thí nghiệm
6
C
Cacbon
7
ĐC
Đối chứng
8
FAO
Food and Agriculture
Organization
Trương Thu Hương
iv
Lớp: 11_01
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu ............................. 11
Bảng 3.1. Một số đặc điểm của các chủng nấm Fusarium sử dụng trong nghiên cứu.. 14
Bảng 3.2. Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm gây
bệnh ở cây .......................................................................................................... 15
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng đối kháng nấm Fusarium của
các vi sinh vật ..................................................................................................... 18
Bảng 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả năng ức chế nấm Fusarium của các vi sinh
vật tuyển chọn ..................................................................................................... 25
Bảng 3.5. Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả năng ức chế nấm gây bệnh cây trồng ...... 30
Bảng 3.6. Một số thông số về chủng VSV đã tuyển chọn ........................................ 35
Trương Thu Hương
v
Lớp: 11_01
DANH MỤC HÌNH
Hình1.1. Nấm Fusarium ........................................................................................ 4
Hình 3.1. Khả năng kháng nấm Fusarium của các chủng vi sinh vật tuyển chọn........ 17
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của chủng vi
khuẩn B1 ............................................................................................................ 19
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng kháng nấm Fusarium của chủng
vi khuẩn B2 ........................................................................................................ 20
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của vi khuẩn
B8 ...................................................................................................................... 21
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của vi khuẩn
B12 .................................................................................................................... 22
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của xạ khuẩn
XK VHL4.1 ........................................................................................................ 23
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng kháng nấm Fusarium của các
chủng VSV tuyển chọn ........................................................................................ 24
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên khả năng kháng nấm Fusarium
của chủng VK B1 ................................................................................................ 26
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên khả năng kháng nấm Fusarium
của chủng VK B2 ................................................................................................ 26
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên khả năng kháng nấm Fusarium
của chủng VK B8 ................................................................................................ 27
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên khả năng kháng nấm Fusarium
của chủng VK B12 .............................................................................................. 27
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên khả năng kháng nấm Fusarium
của chủng XK VHL4.1 ........................................................................................ 28
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng kháng nấm Fusarium
của VSV ............................................................................................................. 29
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng lên kháng nấm Fusarium
của chủng VK B1 ................................................................................................ 31
Trương Thu Hương
vi
Lớp: 11_01
Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng lên kháng nấm Fusarium
của chủng VK B2 ................................................................................................ 32
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng lên kháng nấm Fusarium
của chủng VK B8 ................................................................................................ 33
Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng lên kháng nấm Fusarium
của chủng VK B12 .............................................................................................. 33
Hình 3.18. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng lên kháng nấm Fusarium
của chủng XK VHL4.1 ........................................................................................ 34
Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH đến khả năng kháng nấm Fusarium của các chủng
VSV tuyển chọn .................................................................................................. 35
Trương Thu Hương
vii
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Đây là
điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh
thực vật. Các vi sinh vật này đã gây thiệt hại lớn đối với năng suất cây trồng.
Trong xu thế phát triển của nền nông nghiệp thế giới, những năm gần đây
nền nông nghiệp của nước ta đã đạt được những thành tựu to lớn. Sản xuất gạo
không những đáp ứng đủ nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu đến các nước lớn
trên thế giới như Mỹ. Ngoài cây lương thực, cây công nghiệp, các cây rau màu cũng
phát triển mạnh mẽ trong sản xuất. Song sản xuất nông nghiệp cũng gặp không ít
khó khăn như thời tiết bất lợi, dịch hại do sâu bệnh, nấm bệnh, cỏ dại, chuột, ốc
bươu vàng,…, đã làm giảm năng suất và phẩm chất nông sản. Theo thống kê của
FAO (1984) hàng năm bệnh hại cây trồng không những làm giảm năng suất, phẩm
chất cây trồng mà còn làm tăng chi phí sản xuất. Vì vậy để bảo vệ sản xuất, chúng
ta phải áp dụng hàng loạt các biện pháp canh tác, cơ giới vật lý,…, đặc biệt biện
pháp hóa học để bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Hóa chất bảo vệ
thực vật không những hủy hoại hệ sinh thái mà còn tồn dư trong đất, trong nông sản
ảnh hưởng tới chất lượng nguồn nước và sức khỏe con người. Hơn nữa, những năm
gần đây dịch hại thực vật như nấm bệnh xuất hiện rất nhiều trên các cây công
nghiệp ở Việt Nam. Do đó, để hạn chế tác hại của dịch bệnh và đảm bảo chất lượng
nông sản thì việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm an toàn với con người và thân
thiện với môi trường là cần thiết. Hiện cũng đã có một số công trình nghiên cứu sử
dụng vi sinh vật có ích để diệt côn trùng hại cây trồng như: sử dụng vi khuẩn
B.thuringiensis và nấm Beauveria để diệt sâu, nấm Metarhizium để diệt côn trùng
(dầy nâu, một số loại bọ cánh cứng)… Tuy nhiên, các nghiên cứu về các vi sinh vật
ức chế nấm gây bệnh cây trồng còn chưa nhiều. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng vi
sinh vật ức chế nấm gây bệnh là một trong các hướng nghiên cứu mới góp phần bảo
vệ năng suất cây trồng và thân thiện với môi trường.
Hơn nữa, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái Bình Dương của FAO năm
1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý
dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát
Trương Thu Hương
1
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng
này là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Các tác
nhân sinh học đó thường là vi khuẩn hay xạ khuẩn, nhóm này có nhiều tiềm năng vì
tỉ lệ loài có nhiều trong tự nhiên và có khả năng sinh các chất ức chế kháng nấm
mạnh. Do đó, trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi lựa chọn đề tài ngiên cứu là:
“Nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm (Fusarium) gây
bệnh cây trồng”.
Mục tiêu của đề tài:
-
Tuyển chọn 2-3 chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Fusarium gây
bệnh cây trồng.
-
Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của các vi sinh vật đã tuyển
chọn tới khả năng kháng nấm Fusarium gây bệnh cây trồng.
Trương Thu Hương
2
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về nấm Fusarium
Nấm có hơn 20 vạn loài đã được ghi nhận, sống ở khắp mọi nơi trên trái đất;
trong đó có trên 10 vạn loài nấm hoại sinh, hàng năm loài nấm sống ký sinh trên
động vật và cơ thể con người. Hơn 1 vạn loại nấm gây bệnh hại thực vật và trên
80% số bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra với thành phần loài rất phong phú, đa
dạng.[3]
Nhiều loài nấm thuộc chi Fusarium khác là nấm hoại sinh phổ biến trong đất.
Các loài hoại sinh thường có mặt trên rễ và thân cây bệnh, chúng phát triển trên môi
trường và được phân lập dễ dàng từ rễ và thân bị bệnh, khiến cho việc phân lập các
tác nhân gây bệnh chính trở nên khó khăn. Vì vậy, việc lây bệnh nhân tạo các mẫu
Fusarium phân lập từ rễ bệnh là rất cần thiết. Đây là phần quan trọng trong quá
trình chẩn đoán, và là một trong những lí do tại sao chẩn đoán một bệnh rễ lại khó
khăn. Ví dụ, Fusarium oxysporum bao gồm nhiều dạng loài gây các bệnh héo do tắc
bó mạch và một số bệnh thối rễ. Tuy nhiên, F. oxysprorum cũng bao gồm nhiều
dạng hoại sinh có mặt phổ biến trên rễ cây bệnh sau khi tác nhân gây bệnh đã làm
thối mô rễ. Một số loài hoại sinh này cũng có thể sống nội sinh trong các tế bào lớp
ngoài của rễ mà không làm tổn thương rễ.[1]
Theo các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học, các bệnh héo vàng do
Fuasarium gây ra là vấn đề quan trọng ở Việt Nam. Những bệnh héo này do các
dạng loài của F.oxysporum gây ra. Một vài dạng F.oxysporum cũng có thể gây thối
dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc dụng cụ gặt hái làm tổn thương.
Thối bắp ngô, chủ yếu do F.graminearum và F. verticilliodes gây ra, ngày
càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại
trong hạt.
Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu như đậu Hà Lan,
đậu cô ve và thối rễ ở các cây trưởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực
gỗ than cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường làm stress và do các
bệnh khác.
Trương Thu Hương
3
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Fusarium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc
Việt Nam (L. Burgess, thông tin chưa xuất bản) và từ cà phê ở tỉnh Đắc Lắc (TS.
Trần Kim Loan).
Nghiên cứu sinh địa lý học chỉ ra rằng, các loài Fusarium khác nhau sẽ phân
bố ở các vùng địa lý khác nhau. Sự thay đổi trong cấu trúc và đa dạng của nấm có
thể do kết hợp với các vùng khí hậu đặc biệt trên thế giới [6].
Hình1.1. Nấm Fusarium
Việt Nam là một đất nước có 2 vùng khí hậu khác biệt. Vùng khí hậu Á nhiệt
đới từ phía Bắc của đèo Hải Vân với 4 mùa rõ rệt và vùng khí hậu nhiệt đới ở phía
Nam đèo hải Vân với 2 mùa là: mùa khô và mùa mưa. Sự có mặt của những dãy núi
ở miền Trung và miền Bắc Việt Nam làm gia tăng sự khác nhau giữa các vùng khí
hậu, điều đó cho phép trồng nhiều loại cây khác nhau. Những vùng khác nhau của
Việt Nam cũng đem lại khí hậu lý tưởng cho những loài Fusarium phát triển mạnh
và những dòng Fusarium gây thiệt hại kinh tế lớn cho hàng loạt các cây trồng khác
nhau trên cả nước, bao gồm cây ăn quả, cây rau, cây công nghiệp và cây nông
nghiệp khác.[4]
1.2. Ảnh hưởng của nấm Fusarium đối với cây trồng
Nấm gây nhiều bệnh và thiệt hại đối với cây trồng như:
Trương Thu Hương
4
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Bệnh héo vàng do nấm Fusarium oxysporum, Fusarium sp. (bào tử hậu tồn
tại trong đất, xâm nhiễm vào rễ cây không phải là ký chủ) gây ra là một trong những
bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn ở nhiều nước châu Âu, châu Á, châu Mỹ và châu
Đại Dương. Theo Martuy (1984) cho biết, bệnh héo vàng cây dưa tây do nấm
Fusarium oxysporum gây ra được mô tả đầu tiên ở Mỹ. Nấm Fusarium vasinectum
gây bệnh héo vàng cây bông, bệnh héo vàng đầu tiên được công bố có phạm vi rất
rộng. Vùng đông nam nước Mỹ, đồng bằng châu thổ sông Nile, phía đông và nam
hồ Victoria của Tanzania và một số vùng khác thuộc Ấn Độ [2].
Theo N.S.Smith, O.L.Ebbels, R.H.Garber và A.J.Kappelmen (1981), Kelman
và Cock (1981) đều công bố rằng bệnh này gây hại lớn đối với các vùng trồng bông
ở Trung Quốc. Như vậy, nấm Fusarium oxysporum có phạm vi ký chủ rất rộng lớn
và tồn tại nhiều dạng khác nhau trong đất. Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối
nõn ngô (Nelson et al, 1988) và gây thối nõn dứa (Bolkan et al, 1974). Cũng theo
Burgess và cộng sự (1998) nấm Fusarium oxysporum là tác nhân gây bệnh héo và
thối rễ, thân và mầm cây. Ngoài ra, theo R.H.Stover ở vùng nhiệt đới loài nấm
Fusarium oxysporum còn gây hại trên nhiều ký chủ khác nhau như: thuốc lá, cà
chua, khoai lang, khoai tây, cây hoa huệ,… Đây là những bệnh có tác hại kinh tế
lớn trong sản xuất [2].
1.3. Một số biện pháp phòng trừ nấm Fusarium
1.3.1. Biện pháp canh tác.
Vệ sinh đồng ruộng: Sau khi thu hoạch hoặc trước khi canh tác cần thu dọn,
tiêu hủy tàng dư thực vật và làm sạch cỏ dại vì đây là nguồn lưu tồn và lây lan quan
trọng nhất. Thu nhổ và tiêu hủy các cây rau đã biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh.
Làm đất: Đất trồng rau phải tiêu thoát nước tốt, đất tơi và xốp. Khi đất quá
ẩm hãy đào rãnh quanh luống rau để thoát nước xuống mương. Biện pháp này sẽ
giúp làm chậm quá trình lây bệnh sang các cây khác trong vườn rau. Trong mùa
mưa nếu lứa rau trước đó đã nhiễm bệnh trước khi gieo trồng từ 15-20 ngày nên đặt
những tấm nhựa lên đất sau đó bón vôi vào đất và cuốc lật phơi đất thêm vài ngày
Trương Thu Hương
5
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
để ánh sáng làm nóng đất và nhiệt độ cao sẽ giết chết nhiều vi sinh vật trong đó có
những tác nhân gây bệnh ở tầng đất bề mặt.
Về giống: Luân canh cây trồng khác họ. Sử dụng giống kháng. Không dùng
hạt giống có mầm bệnh (lấy ở ruộng có cây bị bệnh). Xử lý hạt giống bằng nước
nóng 50oC trong 25 phút.
Mật độ trồng: vừa phải, không quá dày để tránh bớt độ ẩm khi lá giao tán.
Phân bón: nên bón lót phân hữu cơ vi sinh hoặc phân chuồng đã ủ hoai cho
rau. Sử dụng cân đối N-P-K, không bón nhiều phân đạm cho rau. Ngưng bón phân
đạm khi bệnh đang phát triển. Bón vôi trước khi trồng và xử lý đất trước khi xuống
giống bằng các loại thuốc gốc đồng. Dùng phân hữu cơ hoai mục, có nhiều vi sinh
vật đối kháng làm hạn chế nguồn bệnh. Bón phân cân đối hợp lý, tránh bón đạm quá
nhiều.
1.3.2. Biện pháp hóa học.
Thuốc phòng bệnh được phun phủ lên toàn bộ bề mặt cây trồng (thân, lá,
hoa, quả,… trong một vài trường hợp phun thuốc cả hạt giống và đất gieo trồng), để
vô hiệu hóa mầm bệnh khi chúng xuất hiện trên bề mặt cây trồng. Phần lớn thuốc
phòng bệnh có cơ chế tác động dạng tiếp xúc (contact action). Các loại thuốc phòng
bệnh về cơ bản không có tác dụng khi nấm bệnh đã xâm nhiễm vào trong cây trồng,
vì thế không cho hiệu quả như ý muốn nếu sử dụng muộn, khi bệnh đã phát. Thuốc
phòng bệnh thường không mang tính chọn lọc cao đối với từng loại nấm bệnh mà
có hiệu quả phòng ngừa phổ rộng trên nhiều loại mầm bệnh (tác động không hạn
chế trên hàng loạt chức năng trao đổi chất của chúng), do vậy cũng hiếm khi có nòi
nấm kháng có thể xuất hiện. Thuộc nhóm thuộc phòng bệnh có thể kể ra một số loại
theo tên chung (hoạt chất) như: các hợp chất của đồng, Chlorothalonil, Mancozeb,
Propineb,…
Thuốc trừ bệnh tác dụng lên mầm bệnh ngay cả khi chúng đã xâm nhiễm và
gây bệnh trên các mô của cây trồng và có hiệu quả chữa bệnh. Vì thế, các thuốc
thuộc loại này ức chế không cho bệnh tiếp tục phát triển. Các thuốc trừ bệnh đều có
Trương Thu Hương
6
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
cơ chế tác động dạng nội hấp (systemic action). Do hiệu lực của thuốc trừ bệnh có
thể xác định bởi tác động chọn lọc trên từng mặt trao đổi chất của mỗi loại mầm
bệnh nhất định nên có thể giảm liều lượng thuốc đáng kể. Tuy nhiên, chúng có
những hạn chế trong sử dụng do đặc tính chọn lọc và đặc trưng. Phổ tác động hay
phạm vi các loại bệnh mà thuốc trừ bệnh có hiệu lực cũng hẹp hơn so với thuốc
phòng bệnh. Các thuốc trừ bệnh chỉ có hiệu lực cao đối với một số loại bệnh cụ thể.
Khi có thêm những bệnh khác loại cùng xuất hiện, phải kết hợp phòng trừ các
phương pháp khác (như phun kèm thêm các loại thuốc đặc trị bệnh mới đó). Chẳng
hạn như các thuốc nhóm phenylamides có hiệu lực trừ bệnh cao với nhóm bệnh
phytophthora hay mốc sương, nhưng tỏ ra kém hiệu lực với nhóm bệnh thối xám và
thán thư… ngoài ra do tính chọn lọc của thuốc, nên cũng dễ làm nảy sinh các nòi
nấm kháng nếu sử dụng một loại thuốc liên tục trong thời gian dài.
1.3.3. Biện pháp sinh học.
Hiện tượng cây con chết do nguyên nhân nhiễm nấm bệnh trong điều kiện
ẩm ướt gọi là bệnh thối rạp “Damping off” do những loài nấm Phytophthora và
Pythium gây ra. Cây con của nhiều loài rau, đậu như rau diếp bị bệnh đột ngột đổ
rạp xuống đất và thối rữa. Đó là do điều kiện ẩm ướt, chật chội (mật độ cây dày)
hoặc qua nhiều than bùn có thể gây ra bệnh này. Vì vậy, kiểm soát bệnh này bằng
cách giữ mặt đất khô sau khi tưới, thậm chí có thể dải một lớp cát trên mặt đất.
Cách giữ đất khô cũng sẽ giúp phòng trừ một loại ruồi nhuế (Sciarid Fly) hay còn
gọi là muỗi nấm (Fungus gnats). Loài này có màu đen và rất nhỏ bé, bò và bay
chung quanh trên mặt đất. Chúng đẻ trứng và ấu trùng của chúng sẽ gây hại cây con
do ăn phần rễ của cây.
Cũng có thể dùng trà hoa cúc La Mã để làm thuốc trừ nấm bằng cách pha
một tách trà hoa cúc La Mã và ngâm trong vòng 10 phút. Khi đã nguội có thể phun
trên những lá nhiễm bệnh nấm nói trên kể cả trên ngọn và dưới gốc để diệt trừ.
Có thể dùng bột cây quế rắc chung quanh cây và đất cũng giúp phòng trừ
nấm bệnh.
Trương Thu Hương
7
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Nếu có điều kiện làm phân ủ lá chè sẽ rất hiệu quả. Phân ủ với lá chè giúp
cân bằng vi sinh vật và vi khuẩn trong đất, chống lại vi sinh vật gây bệnh và giúp
các vi sinh vật có ích hoạt động khỏe mạnh cũng như cung cấp dinh dưỡng cho cây
giúp phát triển tốt và kháng bệnh.
Một cách nữa là có thể dùng nước phân chuồng để phun phòng trừ bệnh trên.
Phân chuồng hoai mục có chứa rất nhiều vi sinh vật có ích. Các vi sinh vật này có
thể phòng trừ các nấm bệnh cây. Phân chuồng này gồm phân động vật ủ với xác
thực vật. Cách làm: đổ 4 lít nước phân chuồng vào thùng có 20 lít nước và khuấy
đều, để chỗ ấm cho lên men trong 3 ngày, sau đó lọc để phun.
1.4. Một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh cây.
• Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nấm ở ngoài nước:
Takayuki và cộng sự (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện
chiếu sáng khác nhau lên sự hình thành bào tử của F. globosum phân lập từ lúa mì ở
vùng cận nhiệt đới Nhật Bản, đồng thời cũng đưa ra điều kiện chiếu sáng tối ưu để
phân lập Fusarium [7].
Ellner (2002) đã nghiên cứu độc tố trong củ khoai tây gây độc bởi F.
sambucinum. Kết quả chỉ ra rằng không thể chỉ cắt bỏ phần mô thối khoai tây (chứa
rất nhiều độc tố) mà có thể loại hết độc tố của nó được [8].
Hussein và cộng sự (2002) đã nghiên cứu sự xuất hiện và phân bố các loài
Fusarium trên ngô ở New Zealand. Bằng cách sử dụng 2 phương pháp pha loãng và
cấy trực tiếp, tác giả đã phân lập được 15 loài Fusarium spp. từ hạt và vỏ của 3 loài
ngô ở vùng Manawatu [9].
Ghiasian và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sự sản xuất Fumonisin từ các loài
Fusarium phân lập từ ngũ cốc tươi ở Iran. Kết quả đã phân lập được 3619 chủng F.
verticillioides và F. proliferatum từ 92 mẫu ngũ cốc mới thu hoạch tại 4 vùng địa lý
khác nhau của Iran, đồng thời cũng xác định được hàm lượng Fumonisin mà chúng
tạo ra trên môi trường ngũ cốc [10].
Trương Thu Hương
8
Lớp: 11_01
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Ở Ấn Độ, các báo cáo đầu tiên về bệnh hại rễ tiêu là do Barber công bố năm
1902, 1903, 1905. Butler (1906) đã tiến hành điều tra bệnh hại ở vùng Wynad (Tây
Nam Ấn Độ). Ông đã phát hiện ra tuyến trùng hại rễ là do nấm Fusarium
oxysporium. Later (1918) đã bác bỏ kết quả của Buler và cho rằng nguyên nhân gây
bệnh là chưa rõ ràng. Venkara Rau (1929) đã phân lập được Phytophthora sp. từ các
mẫu tiêu bị chết héo chủ yếu ở vùng mới khai hoang. Nhưng tiến sĩ Ramaskishen
(1957) đã cho rằng không có loài Phytophthora nào được phân lập từ cây tiêu bị
bệnh trong nước.
• Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nấm trong nước:
Xuất phát từ thực tế về bệnh cây trồng ở Việt Nam, các biện pháp phòng trừ
sinh học bệnh này đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như
nhiều phòng thí nghiệm ở nước ta trong nhiều thập kỉ qua.
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho
thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm 13 Trichoderma
có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh
vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium
rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani.
Trương Thu Hương
9
Lớp: 11_01
PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.
- Các chủng vi sinh vật Phòng vi sinh vật môi trường có khả năng đối kháng
nấm Fusarium.
2.1.2. Chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
- 05 chủng mốc Fusarium (M2.2, M3.1, M3.3, M4.1 và M5.1) của phòng
VSV môi trường phân lập từ cây hồ tiêu.
- Một số chủng VSV khác từ bộ sưu tập của Phòng Vi sinh vật môi trường.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị.
• Dụng cụ:
Que cấy
Que trang
Đèn cồn
Pipet
• Thiết bị:
Tủ cấy (ClasII Biohazard safety Cabinet – Esco)
Máy lắc (Shel lad)
Tủ ấm (Binder)
Nồi khử trùng (SA – 300VF)
2.1.4. Môi trường
Trương Thu Hương
10
Lớp: 11_01
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
MT Gause (g/ml)
MT Czapek (g/ml)
MT MPA (g/ml)
Tinh bột tan
20g
Saccarose
30g
Cao thịt
3g
K2HPO4
0,5g
NaNO3
3,5g
Pepton
5g
MgSO4.7H2O
0,5g
K2HPO4
NaCl
5g
KNO3
1,0g
MgSO4.7H2O
0,5g
Agar
20g
NaCl
0,5g
KCl
0,5g
H2O
FeSO4.7H2O
0,1g
FeSO4.7H2O
0,1g
Agar
20g
Agar
20g
H2O
1000ml
H2O
1,5g
1000ml
1000ml
• Nước muối sinh lý 0,8%
NaCl 8,5g
H2O 1000ml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm Fusarium gây bệnh của các
chủng vi sinh vật bằng thỏi thạch
Các chủng VSV sử dụng kiểm tra hoạt tính được hoạt hóa trên các ống thạch
chứa môi trường đặc trưng. Sau đó, được nuôi cấy ở 30oC trong vòng 48h. Chủng
đã hoạt hóa được tiếp tục cấy trang trên các đĩa petri chứa môi trường đặc trưng và
nuôi cấy ở 30oC trong vòng 48h. Sau 48h lấy ra để thử hoạt tính đối kháng mốc:
- Các chủng mốc M2.2, M3.1, M3.3, M4.1 và M5.1 được trang trên đĩa petri
chứa môi trường Czapeak.
Trương Thu Hương
11
Lớp: 11_01
- Dùng dao sạch hoặc que sắt đã thanh trùng cắt miếng thạch chứa các vi
sinh vật muốn kiểm tra các hoạt tính đối kháng mốc Fusarium (sao cho diện tích
khoảng 3x3 mm2). Sau đó đặt các miếng thạch lên đĩa petri có chứa nấm Fusarium,
rồi nuôi cấy ở 30oC. Sau 72h lấy mẫu ra để kiểm tra kết quả vòng kháng.
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm bằng giếng thạch
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể và được nuôi
cấy ở 30oC trong vòng 24h đối với vi khuẩn và 48h đối với xạ khuẩn. Dịch nuôi cấy
VSV sau đó được tiến ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút để loại sinh khối và
thu dịch nổi để thử hoạt tính.
Các chủng mốc M2.2, M3.1, M3.3, M4.1 và M5.1 được trang trên đĩa petri
chứa môi trường Czapeak. Sau đó dùng dụng cụ chuyên dụng khoang các lỗ thạch
trên đĩa, rồi dùng pipet nhỏ khoảng 200µl dịch nổi của các chủng VSV thu ở trên
vào các giếng thạch. Các đĩa sau khi đã nhỏ dịch được để ở 40C trong vòng 4h, rồi
chuyển qua tủ ấm 30oC. Sau 72h lấy mẫu ra để kiểm tra vòng kháng.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng kháng Fusarium
của các chủng VSV tuyển chọn
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Đối với vi khuẩn.
Môi trường cơ sở là MPB có bổ sung các nguồn cacbon sau: glucose,
saccarose, tinh bột tan (TBT), rỉ đường với nồng độ 3%. Sau đó khử trùng ở 121oC,
trong 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.
Chủng vi khuẩn hoạt hóa trên môi trường MPB được cấy vào các môi trường
trên với tỷ lệ giống 1%. Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút. Sau 24h lấy mẫu để
xác định khả năng kháng Fusarium.
Trương Thu Hương
12
Lớp: 11_01
Đối với xạ khuẩn.
Môi trường cơ sở là môi trường GAUSE nguồn được thay bằng các nguồn
cacbon sau: saccarose, tinh bột tan (TBT), rỉ đường với nồng độ 3%. Sau đó khử
trùng ở 121oC, trong 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.
Chủng xạ khuẩn hoạt hóa trên môi trường GAUSE lỏng được cấy vào các
môi trường trên với tỷ lệ giống 1%. Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút. Sau 72h
lấy mẫu để xác định khả năng kháng Fusarium.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng nấm của các
chủng vi sinh vật
Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường lỏng thích hợp ở các nhiệt độ
30oC, 35oC, 40oC trong điều kiện lắc 150 vòng/phút. Sau 24h đối với vi khuẩn và
sau 72h đối với xạ khuẩn được lấy ra để kiểm tra hoạt tính kháng Fusarium.
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường lỏng thích hợp với pH: 5,5;
6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5. Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút. Tiến hành lấy
mẫu 24h đối với vi khuẩn và 72h đối với xạ khuẩn được lấy ra để kiểm tra hoạt tính
kháng Fusarium.
Trương Thu Hương
13
Lớp: 11_01
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả bước đầu tuyển chọn chủng VSV có khả năng ức chế nấm
Fusarium
Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng ức chế nấm Fusarium gây bệnh
cây trồng, chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm Fusarium từ cây hồ tiêu và đánh
giá khả năng kháng nấm các chủng VSV có trong bộ sưu tập giống của Phòng Vi
sinh vật môi trường. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Một số đặc điểm của các chủng nấm Fusarium sử dụng trong nghiên cứu
TT Ký hiệu
Nguồn phân lập
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và bào tử
Từ đất trồng tiêu
- Khuẩn lạc tròn, màu kem, bề mặt hơi bột.
chủng
1
M2.2
- Bào tử có hình lưỡi liềm, có vách ngăn.
2
M3.1
Từ rễ cây tiêu
-Khuẩn lạc tròn, màu vàng hơi carot, bề
mặt bông.
- Bào tử có hình lưỡi liềm, có vách ngăn.
3
M3.3
Từ rễ cây tiêu
- Khuẩn lạc tròn, màu trắng, sợi bông.
- Bào tử có hình lưỡi liềm, có vách ngăn.
4
M4.1
Từ vỏ cây tiêu
- Khuẩn lạc tròn, màu trắng, sợi bông sinh
sắc tố màu đen.
-Bào tử lưỡi liềm, có nhiều vách ngăn.
5
M5.1
Từ lá cây tiêu
- Khuẩn lạc tròn, sợi bông, có sắc xanh.
-Bào tử có hình lưỡi liềm, có vách ngăn.
Sau đó tiến hành nghiên cứu đánh giá chọn chủng VSV có khả năng kháng
các chủng nấm phân lập được. Kết quả thể hiện ở bảng 3.2:
Trương Thu Hương
14
Lớp: 11_01
Bảng 3.2. Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm gây
bệnh ở cây
STT
Chủng
1
B1
2
Loại VSV
Mốc
M2.2
M3.1
M3.3
M4.1
M5.1
VK
12
11
14
-
-
B2
VK
-
16
13
-
17
3
B3
VK
-
8
9
-
-
4
B7
VK
-
-
-
-
-
5
B8
VK
-
-
-
13
12
6
B9
VK
-
-
-
-
-
7
B10
VK
-
-
-
-
-
8
B11
VK
-
-
-
-
-
9
B12
VK
19
-
17
-
-
10
V1
VK
-
-
-
-
-
11
V2
VK
-
-
-
-
-
12
V5
VK
-
-
-
-
-
13
V6
VK
-
-
-
-
-
14
V10
VK
-
-
-
-
-
15
V11
VK
-
9
-
8
-
16
V14
VK
-
-
-
-
-
17
V15
VK
-
-
-
-
-
18
H1
VK
-
-
-
-
-
19
H2
VK
-
-
-
-
-
20
H7
VK
6
-
4
-
6
21
H8
VK
-
-
-
-
-
22
H9
VK
-
-
-
-
-
Trương Thu Hương
15
Lớp: 11_01
23
H10
VK
-
-
-
-
-
24
H11
VK
-
-
-
7
5
25
H12
VK
-
7
-
7
5
26
VHL1.1
XK
-
-
-
-
-
27
VHL2.1
XK
-
-
-
-
-
28
VHL3
XK
-
-
-
-
-
29
VHL4.1
XK
-
-
17
18
12
30
VHL4.2
XK
-
-
-
-
-
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trong 30 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn thử hoạt
tính đối kháng mốc Fusarium thì có 10 chủng (chiếm khoảng 33%) có khả năng
kháng với mức độ khác nhau.
-
Số chủng có đường kính vòng kháng khuẩn > 10mm chiếm khoảng 16,6%
trong tổng số chủng.
-
Số chủng có đường kính vòng kháng 5 – 10mm chiếm khoảng 13,3%.
-
Số chủng có đường kính vòng kháng <5mm chiếm 3%.
Bên cạnh chỉ số đường kính vòng kháng nấm thì phổ kháng nấm của các
chủng vi khuẩn và xạ khuẩn cũng rất quan trọng. Trong số 30 chủng thì có 4 chủng
có khả năng kháng đồng thời cả 3 chủng Fusarium, 4 chủng có khả năng kháng
đồng thời 2 chủng nấm. Điều này cho thấy rằng phổ kháng nấm của các chủng VSV
tuyển chọn tương đối rộng.
Từ kết quả xác định đường kính vòng kháng và phổ kháng của các chủng
VSV đã lựa chọn được 5 chủng VSV là (B1, B2, B8, B12 và VHL4.1) có hoạt tính
kháng nấm Fusarium mạnh (d>10mm) và phổ kháng rộng (từ 2 chủng nấm trở lên)
Trương Thu Hương
16
Lớp: 11_01
Hình 3.1. Khả năng kháng nấm Fusarium
của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính kháng nấm
Fusarium của các chủng VSV đã tuyển chọn
Sau khi tuyển chọn được các chủng VSV có tính đối kháng nấm Fusarium
cao nhất chúng tôi đã tiến hành một số nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện
lên hoạt tính của chúng.
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là nguồn vật chất cung cấp cho quá trình sinh trưởng của VSV.
Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hóa hóa học phức tạp biến vật
chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Trong các phản ứng sinh
hóa nguồn C còn tạo ra năng lượng cho tế bào. Một số VSV dùng CO2 làm nguồn C
duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn C không phải là nguồn sinh
năng lượng. Đường nói chung là nguồn C và là nguồn năng lượng tốt cho VSV.
Nhưng tùy từng loại đường mà VSV có những khả năng sử dụng khác nhau. Sau
đây là kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng kháng nấm
của các chủng VSV đã tuyển chọn:
Trương Thu Hương
17
Lớp: 11_01
