Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại
học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong
những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học
Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công
nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu
để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo
trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
- Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................................i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier
Science Publishing CO, INC, p. 1-70.......................................................................................37
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018............................................................................................................39
DANH MỤC BẢNG
LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................................i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier

Science Publishing CO, INC, p. 1-70.......................................................................................37
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018............................................................................................................39
ii
DANH MỤC HÌNH
LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................................i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier
Science Publishing CO, INC, p. 1-70.......................................................................................37
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018............................................................................................................39
iii
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các
lĩnh vực như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Các
enzyme đang được sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, …
Cellulase là một trong số các enzyme được ứng dụng phổ biến trong công nghệ
thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử
lý môi trường, ... Đặc biệt hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên
cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây
là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu
nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt.
Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành công
nghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Nước
ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất
enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme
từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp
thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase
từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên
mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái

hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu
tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một
số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-
Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh
cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất
enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được
toàn thế giới quan tâm.
Nội dung của đề tài:
1
1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh
cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang;
2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được;
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của chủng vi sinh tuyển chọn được.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế.
Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để
cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE
1.1.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng
có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi
sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi.
Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4
glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180
o

và có dạng
như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được
cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2.
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose
Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả
năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm
hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ.
Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân
3
hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá
và cộng sự, 2007).
Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường β-
glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác
dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse
hay enzyme C
1
, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase
hay C
x
và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:
• Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng
cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC
nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một
phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì
có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
• Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4-
glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình
thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy
tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm
các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh

ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
• ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các
cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,
còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức
năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase.
Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai
đoạn chủ yếu sau:
4
Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C
1
, cellulose bị thủy phân
thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân
dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C
x
tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay
cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose.
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên
thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài
phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong
tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu
khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối
cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều
kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một

số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân
giải này. Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa học nghiên cứu
kỹ nhất.
5