Nghiên cứu thiết kế VECTOR biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa PROTEASE SENP2 trong ESCHERICHIA COLI

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

̴***̴

KHÓA LUẬN
LU
TỐT NGHIỆ
ỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU THIẾT
TK
KẾ VECTOR BIỂU HIỆN VÀ BIỂU HIỆN
N GEN MÃ HÓA
PROTEASE SENP2 TRONG ESCHERICHIA COLI

Ngườ
ời hướng dẫn:

TS. Đỗ Thị Huyền

Sinh viên thực
th hiện: Trần Thị Thanh Tuy
Tuyền
Lớp:
p:

1102 K18

Hà Nội 2015

Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protease SENP2
trong Escherichia Coli.

LỜI CẢM ƠN
Không có sự thành công của một cá nhân nào mà không có sự hỗ trợ, giúp đỡ
và đóng góp của những người khác. Trong suốt thời gian thực tập tại:Phòng Kỹ
thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, em đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của các thầy cô trong phòng.
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.Đỗ Thị
Huyền – Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, NCS. Lê Ngọc Giang đã tận tình hướng
dẫn và dìu dắt em trong suốt thời gian em thực tập và hoàn thành khóa luận.
Tiếp theo, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của khoa
Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều
kiện về thời gian để em có thể hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn GS. Trương Nam Hải cùng toàn thể các cán
bộ nghiên cứu, của phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo điều kiện, luôn tận tình sát sao chỉ
bảo, chia sẻ những kinh nghiệm và cho em những lời khuyên quý báu trong công
việc những như cuộc sống.
Và cuối cùng, bằng tình cảm chân thành và yêu mến em xin được gửi lời biết
ơn sâu sắc tới gia đình và người thân, những người luôn ủng hộ, động viên và tạo
cho em những điều kiện tốt nhất về tinh thần cũng như vật chất trong suốt thời gian
học tập và thực tập.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thanh Tuyền

Trần Thị Thanh Tuyền

Lớp 1102 K18


Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protease SENP2
trong Escherichia Coli.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
MỤC TIÊU ............................................................................................................ 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 4
1.1. Tổng quan về SUMO protease SENP2 .......................................................... 4
1.1.1. Giới thiệu chung về SUMO-3 protein và ứng dụng làm protein dung hợp4
1.1.2. Giới thiệu chung về SUMO protease và ứng dụng loại bỏ protein dung
hợp khỏi protein đích ........................................................................................ 7
1.1.3. Cấu trúc, chức năng và ứng dụng của SENP2 trong công nghệ sinh học . 9
1.2. Hệ biểu hiện E. coli ..................................................................................... 10
1.2.1. Đặc điểm của vector biểu hiện............................................................... 10
1.2.2. Vector biểu hiện pET22b(+). ................................................................. 11
1.2.3. Chủng biểu hiện E. coli BL21 ............................................................... 13
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 15
2.1. Vật liệu........................................................................................................ 15
2.1.1. Các chủng vi sinh vật, plasmid .............................................................. 15
2.1.2. Hóa chất, enzyme .................................................................................. 15
2.1.3. Máy móc ............................................................................................... 15
2.1.4. Các môi trường và dung dịch sử dụng ................................................... 15
2.1.4.1. Môi trường dùng trong biến nạp và nuôi cấy ...................................... 15
2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid .............................. 16
2.2. Phương pháp ............................................................................................... 17

2.2.1. Phương pháp biến nạp DNA vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ... 17
2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli ........................................................ 18
2.2.3. Điên di DNA trên gel agarose ............................................................... 19
2.2.4. Phản ứng cắt plasmid DNA bằng các enzym hạn chế ............................ 21
2.2.5. Tinh sạch DNA từ gel agarose bằng cột Qiagen được tiến hành theo
hướng dẫn của nhà sản xuất ............................................................................ 21
2.2.6. Phản ứng nối ghép gen .......................................................................... 21
Trần Thị Thanh Tuyền

Lớp 1102 K18


Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protease SENP2
trong Escherichia Coli.

2.2.7. Biểu hiện gen ........................................................................................ 22
2.2.8. Điện di protein trên gel polyacrymide-SDS ........................................... 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 24
3.1. Kiểm tra gen senp2 trong pUC57-senp2 bằng enzyme hạn chế .................... 26
3.2. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)-senp2 ................................................. 28
3.2.1. Tinh sạch sản phẩm cắt senp2, pET22 bằng kit QIAGEN ...................... 29
3.2.2. Nối ghép gen senp2 vào vector biểu hiện pET22b(+) ............................ 30
3.2.3. Cắt kiểm tra pET22b(+)-senp2 bằng enzyme hạn chế ........................... 31
3.2.3.1.Kiểm tra pET22b(+)-senp2 bằng EcoRV ............................................. 31
3.2.3.2. Kiểm tra vector pET22b(+)-senp2 bằng enzyme PstI ......................... 32
3.2.3.3. Kiểm tra pET22b(+)-senp2 bằng enzyme hạn chế NcoI và XhoI ......... 33
3.3. Biểu hiện pET22b(+)-senp2 trong BL21...................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 38

Trần Thị Thanh Tuyền

Lớp 1102 K18


Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protease SENP2
trong Escherichia Coli.

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

Base pair (cặp bazơ)

Amp

Ampicillin

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropyl-β-D-l-thiogalactopyranoside

LB

Luria-betani medium

MCS

Mutiple cloning site

TAE

Tris acetate EDTA

SDS

Sodium dodecyl sulphate

dH2O

Distilled water (nước khử trùng)

v/p

Vòng / phút

M

Mol/l

v/v

Thể tích/thể tích

SUMO

small ubiquitin-like modifier

Ub

Ubiquitin

Ubl

Ubiquitin-like

Smt3

suppressor of mif two 3

SENP2

SUMO-specific protease 2

MBP

maltose binding protein

His6

maltose binding protein

IL-11

Interleukin 11

Trần Thị Thanh Tuyền

Lớp 1102 K18


Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa protease SENP2
trong Escherichia Coli.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1

So sánh trình tự của ubiquitin và SUMO của nấm men và người

Hình 2

Cấu trúc không gian của SUMO1 và SUMO2/3

Hình 3

Cấu trúc bậc 4 của Ubiquitin và SUMO-1

Hình 4

Phức hợp enzyme-cơ chất giữa SENP và SUMO-1

Hình 5

Cấu trúc bậc 4 của SENP2

Hình 6

Trình tự amino acid của SENP2

Hình 7

Bản đồ vector pUC57

Hình 8

Bản đồ vector pET22b(+).

Hình 9

Sơ đồ cơ chế kiểm soát biểu hiện gen bằng chất cảm ứng IPTG

Hình 10

Sơ đồ thí nghiệm

Hình11

Kết quả điện di 5 dòng pUC57-senp2 trên gel agarose 0,8%.

Hình12

Sơ đồ vị trí enzyme giới hạn và kết quả cắt kiểm tra pUC57-senp2
bằng enzyme NcoI và XhoI

Hình 13

Điện di kiểm tra các đoạn gen được tinh chế bằng cột Qiagen

Hình 14

Kết quả điện di tách chiết các dòng mang vector pET22b(+)-Senp2.

Hình 15

Sơ đồ và kết quả cắt kiểm tra pET22b(+)-Senp2 bằng enzyme EcoR
V

Hình 16

Sơ đồ vị trí enzyme giới hạn và kết quả cắt pET22-Senp2 bằng
enzyme Pst I

Hình 17

Sơ đồ và kết quả điện di sản phẩm cắt pET22-Senp2 bằng enzyme
NcoI và XhoI

Hình 18

Kết quả biến nạp pET22b(+)-Senp2 vào tế bào BL21

Hình 19

Phân tích chọn dòng BL21 pET22b(+)-Senp2

Hình 20

Phân tích kết quả biểu hiện protein của dòng 4 trong E. coli BL21
trên gel polyacrymide

Trần Thị Thanh Tuyền

Lớp 1102 K18


MỞ ĐẦU
Với sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp từ những năm 1970, protein bắt
đầu được biểu hiện nhiều ở dạng tái tổ hợp trong các tế bào vi sinh vật một cách
nhanh hơn và thuận tiện hơn so với nguồn tự nhiên. Trong những năm gần đây, kỹ
thuật sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống sinh học ngày càng được ứng
dụng rộng rãi. Trong đó, các “nhà máy” vi khuẩn được lựa chọn sử dụng nhiều do

các ưu điểm như chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh. Chủng biểu
hiện Escherichia coli là chủng được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu cũng
như trong sản xuất protein tái tổ hợp.
Ưu điểm của hệ biểu hiện trong E. coliđó làsinh trưởng nhanh trong môi
trường rẻ tiền, dễ thao tác và các protein tái tổ hợp không bị biến đổi sau dịch
mã.Tuy nhiên, điểm hạn chế của hệ thống vật chủ này là các protein ngoại lai có
nguồn gốc quá xa với chủng biểu hiện (ví dụ protein của sinh vật bậc cao) thường
biểu hiện dưới dạng thể vùi, hoặc dễ bị protease của chủng chủ phân cắt. Có tới
75% protein của người được biểu hiện thành công trong E. coli nhưng trong đó chỉ
có 25% protein tái tổ hợp ở dạng tan. Để khắc phục những nhược điểm này các nhà
khoa học thường biểu hiện các protein này dưới dạng dung hợp với một protein
khác có chức năng như chaperon để bảo vệ protein tái tổ hợp hoặc làm tăng khả
năng cuộn xoắn đúng của protein và protein được tổng hợp ra có chức năng sinh
học. Có nhiều loại protein dung hợp: maltose binding protein (His6), maltose
binding protein (MBP), Small ubiquitin-like modifer (SUMO), Ubiquitin (Ub) hoặc
Green fluorescent protein (GFP),... Các protein dung hợp này đã được thiết kế sẵn
trong các vector biểu hiện. SUMO (là protein thuộc họ ubiquitin được tìm thấy
trong sinh vật nhân thật như nấm men hay trong động vật có xương sống) được sử
dụng khá phổ biến để biểu hiện protein đích dưới dạng dung hợp, đặc biệt là những
protein khó biểu hiện. Trong đó có SUMO-3 nguồn gốc từ người là một trong
những protein thường được dung hợp với protein đích để làm tăng khả năng biểu
hiện của protein đích trongE. coli. Trên thực tế trong các nghiên cứu ứng dụng
protein trên người hoặc để đánh giá tính chất protein đích, các protein dung hợp bắt
buộc phải được cắt bỏ để giải phóng protein đích.

Trần Thị Thanh Tuyền

1

Lớp 1102 K18

Để cắt bỏ protein SUMO-3 ra khỏi protein dung hợp, các nhà nghiên cứu có
thể đưa các trình tự nhận biết điểm cắt đặc hiệu của protease nào đó hoặc dùng
enzyme SENP2 có nguồn gốc từ người có khả năng nhận biết SUMO-3 qua cấu trúc
bậc bốn của phân tử và cắt tại vị trí đặc hiệu nên có ưu điểm là không cắt vào trong
protein đích. Enzyme SENP2 có hoạt tính trong khoảng pH và nhiệt độ rộng nên
thuận lợi cho việc ứng dụng.
Hiện nay, giá thành nhập SUMO protease SENP2 (gọi tắt là SENP2) rất
đắt.Vì vậy, để có được SENP2 sản xuất trong nước, phòng kỹ thuật di truyền – Viện
Công nghệ sinh học đã tiến hành sản xuất SENP2 tái tổ hợp trong E. coli. Trong
khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: Thiết kế vector biểu
hiện và biểu hiện gen mã hóa SENP2 trong Escherichia Coli.

Trần Thị Thanh Tuyền

2

Lớp 1102 K18


MỤC TIÊU
Mục tiêu chính khi thực hiện đề tài:
-

Thiết kế thành công vector pET22b(+) mang gene senp2.

-

Biểu hiện thành công SENP2 trong E. coli BL21.

Trần Thị Thanh Tuyền

3

Lớp 1102 K18


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về SUMO protease SENP2

1.1.1. Giới thiệu chung về SUMO-3 protein và ứng dụng làm protein dung hợp
SUMO (small ubiquitin-like modifier) nằm trong nhóm Ubiquitin-like
modifier, thuộc họ Ubiquitin (Ub) và Ubiquitin-like (Ubl).Chúng được tìm thấy
trong tế bào nhân thật từ nấm men cho tới con người và có khối lượng phân tử
khoảng 8-11 kDa. SUMO là một trong những protein dung hợp thường được dùng
để biểu hiện những protein khó biểu hiện. Có khả năng gắn với protein đích bằng
liên kết isopeptide giữa ubiquitin và một lysine của protein đích [1]. SUMO tham
gia vào nhiều quá trình trong tế bào như: chết theo chu trình (apoptosis), vận
chuyển trong nhân bào, điều hòa quá trình phiên mã, truyền tín hiệu, phản ứng dưới
điều kiện stress và kích thích chu trình tế bào, ổn định protein [1].
Ở nấm men Saccharomyces cerevisiae chứa một gen SUMO có tên là Smt3
(suppressor of mif two 3)[2]đóng vai trò trong quá trình hình thành vòng septin, sự
phân chia nhiễm sắc thể và sự thúc đẩy chu trình tế bào qua G2-M[1].

Hình 1: So sánh trình tự của ubiquitin và SUMO của nấm men và người: Các gốc
amino acid tương đồng (tô đậm) và các gốc có đặc điểm tương tự (tô nhạt). Hình
kéo là nơi SUMO bị cắt để trở thành dạng có hoạt tính sinh học [1].

Ở động vật có vú mang ít nhất 3 gen SUMO đó là: SUMO-1, SUMO-2.
SUMO-3. Trong đó, SUMO-2 và SUMO-3 chỉ có 43% và 42% gốc amino acid
tương đồng với SUMO-1, nhưng lại có độ tương đồng cao với nhau lên tới 96%,
chúng chỉ khác nhau 3 acid aminN-terminal và có chức năng không thể phân biệt.

Trần Thị Thanh Tuyền

4

Lớp 1102 K18


Vì thế SUMO-2 và SUMO-3 thường được gọi chung là SUMO-2/3. Ở người đã tìm
thấy gen SUMO-4, gene này có độ tương đồng cao với SUMO-2/3, chỉ khác nhau
duy nhất ở một amino acid là Proline thay thế Glutamine ở vị trí thứ 90. SUMO-4
không hoạt động và dung hợp trong điều kiện thông thường nhưng có khả năng thay
đổi cấu trúc protein trước các tác nhân gây stress.

Hình 2: Cấu trúc không gian của SUMO1 và SUMO2/3.

Trần Thị Thanh Tuyền

5

Lớp 1102 K18


Hình 3: Cấu trúc bậc 4 của Ubiquitin và SUMO-1: Ubiquitin màu xanh, SUMO-1
màu vàng, so sánh 2 protein với nhau.
SUMO là một loại protein dung hợp được dùng nhiều trong sinh học phân tử

để biểu hiện những protein khó biểu hiện. Gen mã hóa peptide dung hợp được gắn
vào đầu 5’ của gen mã hóa protein đích và đưa vào vật chủ như E. coli, nấm men
và các tế bào khác như côn trùng và động vật.
SUMO-3 có nguồn gốc từ người có thể làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện
của protein đích. Dung hợp này còn giúp cho protein đích cuộn xoắn chính xác, tăng
tính tan từ đó làm tăng hoạt tính sinh học của protein [3]. Trong tế bào E. coli và nấm
men, SUMO-3 hoạt động giống như chaperon. Khi được dung hợp ở đầu N của
protein đích, SUMO-3 giúp làm tăng mức độ biểu hiện của protein ngoại lai và giúp
protein đích tránh bị phân cắt bởi protease của tế bào chủ [4]. SUMO đã được nhiều
nghiên cứu đặc biệt nhấn mạnh ở khả năng làm tăng mức độ biểu hiện của các protein
khó như matrix metalloproteinase 13 [3] [4]. Một số protein người khó biểu biểu hiện
như IL-11 đã được biểu hiện thành công dưới dạng dung hợp với SUMO-3.
Trong một số trường hợp như sản xuất protein tái tổ hợp ứng dụng trong
công nghệ thực phẩm hay trong y dược thì protein tái tổ hợp cần được loại bỏ
protein dung hợp để thu được protein hoàn chỉnh đảm bảo hoạt tính sinh học và các
tính chất sinh lý, hóa lý, miễn dịch,…của protein đích [5].

Trần Thị Thanh Tuyền

6

Lớp 1102 K18


1.1.2. Giới thiệu chung về SUMO protease và ứng dụng loại bỏ protein dung
hợp khỏi protein đích
Protease hay còn được gọi là peptidase, proteinase là nhóm enzyme xúc tác
thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide thành các amino acid
tự do hoặc peptide phân tử thấp [6]. Trong hệ thống danh pháp chúng thuộc lớp
hydrolase (EC3) và dưới lớp peptide hydrolase hay peptidase (EC 3.4). Protease

được tìm thấy trong động vật, thực vật, vi khuẩn, virus.
Dựa vào vị trí xúc tác của enzyme mà nhóm protease được chia
thànhexopeptidase, endopeptidase. Các exopeptidase phân cắt chuỗi polypeptide tại
vị trí gần đầu N hoặc đầu C để giải phóng ra amino acid còn các endopeptidase lại
cắt liên kết bên trong chuỗi polypeptide để tạo ra các polypeptide ngắn hơn.Ngoài
ra, protease còn được phân loại theo cơ chế xúc tác và sự có mặt của các gốc amino
acid đặc thù ở trung tâm hoạt động [6]. Protease được ứng dụng rộng rãi trong một
số lĩnh vực của ngành công nghiệp và công nghệ sinh học, hơn nữa, có nhiều nghiên
cứu yêu cầu ứng dụng của protease, bao gồm cả sản xuất các mảnh Klenow, tổng
hợp peptide, nuôi cấy tế bào mô và phân ly, chuẩn bị kháng thể tái tổ hợp, chuẩn
đoán và điều trị, loại bỏ các protein dung hợp trong sản xuất protein tái tổ hợp và
nhiều ứng dụng khác [6].
Hầu hết protease ứng dụng trong việc cắt bỏ các protein dung hợp đều có
tính đặc hiệu cao. Trong một số trường hợp, protein dung hợp có thể loại bỏ bằng
các chất hóa học. Nhưng các chất này không cắt đặc hiệu như enzyme nên dẫn tới
protein đích bị phân cắt, các amino acid đầu N và đầu C có thể bị thay đổi ảnh
hưởng đến chất lượng của protein đích [5].
Trong hai nhóm exopeptidase và endopeptidase thì nhóm endoprotease được
sử dụng rộng rãi hơn trong việc phân cắt và loại bỏ protein dung hợp. Một số
endoprotease điển hình là enterokinase (còn gọi là enteropeptidase), thrombin được
sử dụng rất rộng rãi trong nhiều năm nay để loại bỏ các protein dung hợp ở phía đầu
N. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy nhiều enzyme nhận biết các trình tự ngắn
hay không đặc hiệu có thể cắt protein đích ở nhiều vị trí khác nhau. Do vậy,

Trần Thị Thanh Tuyền

7

Lớp 1102 K18

protease của virus như HRV (human rhinovirus), 3C protease, TEV protease của
tobacco etch virus đã được dùng để thay thế [7] [8] [9] [10].
Các proein đích được biểu hiện cùng với SUMO, ngoài việc có thể cắt bỏ
SUMO bởi các thiết kế đặc hiệu cho enzyme, chúng còn có thể được cắt bỏ bởi
enzyme nhận biết đặc hiệu cấu trúc bậc bốn của SUMO gọi là SUMO protease (hay
Ubiqitin-like protease, ULP). Tuy nhiên, do tính đặc hiệu trình tự của protease cao
nên nó đòi hỏi các gốc amino acid đầu N của protein đích phải phù hợp. Ví dụ như
với TEV protease, đầu N của protein đích phải có trình tự Gly-Ser. Ngược lại,
SUMO protease nhận biết SUMO không theo trình tự bậc 1 mà theo cấu trúc bậc 4.
Vì vậy, chúng có tính đặc hiệu rất cao và không cắt protein đích.
Tính đặc hiệu của SUMO protease có được là do bề mặt tiếp xúc rộng, được
tạo bởi tương tác ưa nước của các liên kết của phân tử muối với cơ chất SUMO,
vùng trung tâm hoạt động định hướng các gốc xúc tác bao gồm His-Asp-Cys ở các
vị trí không gian đặc thù để phân cắt đặc hiệu cơ chất. Đồng thời diglycine ở đầu C
của SUMO được giữ chặt bởi hai gốc Trp ở đáy của trung tâm hoạt động để chắc
chắn phân cắt SUMO ra khỏi protein đích [1]. Cấu trúc trung tâm hoạt động của các
SENP từ các tế bào động vật cũng tương tự như vậy. Ngoài ra SENP1 và SENP2
còn định hướng phân cắt theo cấu hình cis nhờ tạo thành một nút thắt ở đầu C của
SUMO. Cấu hình cis trong phân tử peptide là cấu hình thường gặp. Vì vậy, các
SENP này được cho là có khả năng phân cắt tốt SUMO khỏi protein dung hợp [11].
Các nghiên cứu hóa sinh và tin sinh đã tìm thấy ít nhất 7 proteaseUlp ở người ký
hiệu SENP1-3, SENP5-8[9]. Tất cả các gen này đều mang trình tự giống Ulp ở đầu
C. Riêng đầu N có sự khác biệt do định khu của các enzyme khác nhau [1]. SENP1
có khả năng cắt SUMO-1 và 3 in vivo. SENP2 có khả năng tiền xử lý cả ba SUMO1/-2/3. Riêng SENP6 và SENP7 có loop nằm ở vùng bảo thủ và hoạt động phân cắt
SUMO-2/3 nhiều hơn là SUMO-1 [12].

Trần Thị Thanh Tuyền

8

Lớp 1102 K18


Hình 4: Phức hợp enzyme-cơ chất giữa SENP và SUMO-1 (màu đen) (A) và các
gốc xúc tác trên phân tử SENP tham gia tạo phức hợp và phân cắt SUMO (B). Mũi
tên chỉ rãnh kị nước.
1.1.3. Cấu trúc, chức năng và ứng dụng của SENP2 trong công nghệ sinh học
SUMO protease đặc hiệu cắt SUMO-3 của người là enzyme SUMO protease
2 (SENP2) ( SUMO-specific protease 2). Ưu điểm của SUMO protease là chúng
nhận diện chính xác cấu trúc bậc bốn của protein dung hợp và cắt tại vị trí đặc hiệu
để giải phóng protein hoàn thiện. Vì vậy, hầu như không có hiện tượng protease cắt
không đặc hiệu vào trong protein đích. Khác hẳn với nhiều protease sinh học khác,
SENP2 có hoạt tính đối với hầu hết các gốc amino acid đầu N của protein đích dung
hợp trừ gốc proline [4]. SENP2 nhận biết SUMO-3 theo cấu trúc bậc 4 và tiếp xúc
với nhau qua các cầu muối và tương tác ưa nước.
Gen senp2 ở người có kích thước 1770 bp, mã hóa cho enzyme có kích thước
589 amino acid, chứa một đoạn domain Ulp-like C.

Hình 5: Cấu trúc bậc 4 của SENP2.

Trần Thị Thanh Tuyền

9

Lớp 1102 K18


Các hãng xản xuất SENP2 thương mại thường biểu hiện vùng trung tâm hoạt
động của SENP2 trong E. coli. Sản phẩm SENP2 của Lifesensor cũng chỉ có kích

thước 27739 Da và có chứa hexahistidine, có thể phân cắt tốt protein tái tổ hợp biểu
hiện dưới dạng gắn với SUMO-3 ở nhiệt độ tối ưu 30oC và trong khoảng pH từ 5,59,5. Ngoài ra còn hoạt động tốt trong môi trường có chất tẩy như Triton, guanidine
chloride, urea[4].
10
MYRWLVRILG
60
RLDCFIHQVK
110
NSSSCELTGS
160
FTLNSEGCNR
210
HCTVEEGVQK
260
KTKGWGEEQN
310
TMVGIRFENE
360
KNCSGKERDR
410
DIQTLKNYHW
460
YQAVKRWTKG
510
GHRICEILLQ

20
30
40
50

TIFRFCDRSV PPARALLKRR RSDSTLFSTV DTDEIPAKRP
70
80
90
100
NSLYNAASLF GFPFQLTTKP MVTSACNGTR NVAPSGEVFS
120
130
140
150
GSWNNMLKLG NKSPNGISDY PKIRVTVTRD QPRRVLPSFG
170
180
190
200
RPGGRRHSKG NPESSLMWKP QEQAVTEMIS EESGKGLRRP
220
230
240
250
EEREKYRKLL ERLKESGHGN SVCPVTSNYH SSQRSQMDTL
270
280
290
300
HGVKTTQFVP KQYRLVETRG PLCSLRSEKR CSKGKITDTE
320
330
340
350

SRRGYQLEPD LSEEVSARLR LGSGSNGLLR RKVSIIETKE
370
380
390
400
RTDDLLELTE DMEKEISNAL GHGPQDEILS SAFKLRITRG
420
430
440
450
LNDEVINFYM NLLVERNKKQ GYPALHVFST FFYPKLKSGG
470
480
490
500
VNLFEQEIIL VPIHRKVHWS LVVIDLRKKC LKYLDSMGQK
520
530
540
550
YLQDESKTKR NSDLNLLEWT HHSMKPHEIP QQLNGSDCGM
560
570
580
FTCKYADYIS RDKPITFTQH QMPLFRKKMV WEILHQQLL

Hình 6: Trình tự amino acid của SENP2.
1.2. Hệ biểu hiện E. coli
1.2.1. Đặc điểm của vector biểu hiện
Vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho

phép thực hiện sự phiên mã các gen được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của
chúng trong Escherichia coli. Vector biểu hiện cần có đầy đủ các cấu trúc cần thiết
sau:
- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào
vật chủ.
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc để đảm bảo duy trì vector trong tế
bào.
- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac tryp..) cho phép sản xuất một
lượng lớn mRNA từ các gen tạo dòng.
Trần Thị Thanh Tuyền

10

Lớp 1102 K18


- Các trình tự kiểm
m soát dịch
d
mã như trình tự kiểm soát dịch
ch mã nh
như trình tự
liên kết ribosome đượcc bbố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG.
- Một polylinker để
đ đưa gen ngoại lai vào tế bào vật chủ theo m
một hướng
chính xác với promoter.
1.2.2. Vector biểu hiện
n pET22b(
pET22b(+)

Để biểu hiện
n gene trong E. coli vector biểu hiện có thể dùng là các plassmid,
phage, cosmid. Vector bi
biểu hiện là một plasmid được thiết kế nhằm
mm
mục đích sản
xuất protein với lượng
ng llớn khi được kích thích bằng chất cảm ứng
ng (lactose ho
hoặc
IPTG). Cấu trúc củaa vector pET22b(+) được biểu hiện trên hình 8. Plasmid này có
chứa một vài yếu tố quan trọng
tr
như gene lacI mã hóa cho protein ứ
ức chế biểu hiện
gene ngoạii lai, promoter T7 đặc hiệu vớii RNA polymerasae, operator, vvị trí đa
điểm cắt (multicloning
multicloning site),
site điểm khởi đầu tái bản f1, gene chọn lọ
lọc (gene kháng
kháng sinh ampicillin).

Hình 8: Bản đồ vector pET22b(+).
Gene củaa protein tái tổ
t hợp cần sản xuất được chèn vào vị trí cắt đa điểm
trong vector. Promoter T7 và lac operator đều nằm ở đầu 5’ củaa gene. Bình th
thường
Trần Thị Thanh Tuyền

11

Lớp 1102 K18


T7 RNA polymerase bị ức chế bởi sự kiểm soát của sản phẩm genlacI là lac
repressor và T7 RNA polymerase được tạo thành từ genome của chủng E. coli DE3,
nhờ đó gene ngoại lai được phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein. Sơ đồ cơ chế
kiểm soát biểu hiện gen bằng chất cảm ứng IPTG được thể hiện ở hình 9.

Hình 9: Sơ đồ cơ chế kiểm soát biểu hiện gen bằng chất cảm ứng IPTG.
IPTG induction: chất cảm ứng IPTG.
E. coli genome: hệ gen của Escherichia E. coli.
Repressor: ức chế.
Inactive: bất hoạt.
Target gene: gen đích.
Host cell: tế bào chủ.

Trong vector pET22b(+) còn có trình tự tiết pelB dài 22 axit amin giúp
protein ngoại lai tiết ra khoang chu chất. Sau khi đi vào khoang chu chất thì đoạn
peptide tín hiệu này sẽ bị cắt bởi một protease xác định. Môi trường trong khoang
chu chất tạo điều kiện cho các enzyme xúc tác quá trình hình thành và sắp xếp các
mối liên kết disunfit, tạo ra cấu trúc không gian đúng cho chuỗi polypeptide hoàn
chỉnh. Các chuỗi polypeptide này khi chuyển vào khoang chu chất đều không còn
chứa gốc Methionine hoặc formyl Methionine ở đầu tận cùng N.
Ngoài ra, phía sau vùng đa nối có một đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin
Histidine tích điện âm được gọi là đuôi His-tag giúp protein tái tổ hợp được giữ lại
khi chúng được đưa qua cột sắc ký ái lực do lực hút tĩnh điện giữa phần điện tích

Trần Thị Thanh Tuyền

12

Lớp 1102 K18


âm của đuôi His-tag với điện tích dương của các cation có trong cột tinh sạch. Các
protein này sẽ được tách qua cột khi chho qua dung dịch đệm pH thích hợp.
1.2.3. Chủng biểu hiện E. coli BL21
E.coli là một hệ biểu hiện lý tưởng, dễ thao thác, có thể sản xuất protein tái tổ
hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau cũng như có khả năng thu nhận các vector bản
chất là plasmid. Vi khuẩn E. coli đáp ứng được hầu hết các yêu cầu của một hệ biểu
hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E. coli làm
tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp.
E. coli là vi khuẩn Gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy
nhất hay còn gọi là nucleotide. Kích thước genome của E. coli khoảng 4,6 x 106
base pairs. Chi phí để biểu hiện protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn E. coli là khá rẻ,
đặc biết chúng lại có thời gian sinh trưởng nhanh, có khả năng duy trì lên men và
tạo sinh khối lớn bằng việc cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng vào những thời điểm
nhất định nên đây là hệ biểu hiện được ưu tiên lựa chọn hàng đầu trong sản xuất
protein tái tổ hợp. Quá trình biểu hiện gene (bao gồm phiên mã và dịch mã) luôn tạo
ra phân tử mRNA và protein nhanh chóng. Toàn bộ trình tự của vi khuẩn này đã
được giải mã bằng máy giải trình tự thế hệ mới [7].
Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E.coli chính là việc thiếu các quá trình cải
biến sau dịch mã như glycosyl hóa, phosphoryl hóa, … do đó các protein có tái tổ
hợp có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn không cuộn xoắn đúng cấu trúc, protein
tái tổ hợp thường tạo thành dạng không tan, theo đó hoạt tính sinh học cũng bị giảm
đi đáng kể. Tuy nhiên đã có nhiều biện pháp để khắc phục như biểu hiện các protein
ngoại lai ở dạng dung hợp với một protein khác có chức năng như chaperon để bảo
vệ protein tái tổ hợp hoặc làm tăng khả năng cuộn xoắn đúng của protein vì thế mà
protein được tổng hợp ra có chức năng sinh học. Vì vậy, với những ưu điểm vượt

trội E. coli vẫn được lựa chọn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất
trong công nghệ DNA tái tổ hợp.
E. coli BL21 là chủng biểu hiện thương mại được sử dụng nhiều làm vật chủ.
Hệ gene của chủng này đã được cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal, dcm, λ

DE3. Ý nghĩa của việc cải biến đó như sau:

Trần Thị Thanh Tuyền

13

Lớp 1102 K18


- Gene ompT: là một gene mã hóa cho protease nằm trên màng ngoài tế bào,
chủng khuyết gene ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy ngay
trong tế bào [14].
- Gene hsdS: là một gene có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập
tế bào chủ [15], chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ hợp
được hiệu quả hơn.
- Gene gal: chủng BL21 khuyết gene gal giúp tránh việc tế bào sử dụng
galactose làm nguồn carbon cho sinh trưởng [16].
- Gene dcm: là gene methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng
khuyết gene dcm tránh việc trình tự gene ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác
trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp [17]
- T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter
lacUV5 dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là một promoter đã được đột
biến và được tạo ra từ phageλ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu
hiện vi khuẩn tự nhiên nào [18].
Ngoài ra chủng E. coli BL21 (DE3) còn một dạng thương mại nữa là dạng có

tích hợp thêm plasmid pLysS, plasmid này mang gene mã hóa cho T7 lysozyme là
một loại protein có hai chức năng: phân giải thành tế bào vi khuẩn và là khóa sự
hoạt động của T7RNA polymerase (hay còn gọi là promoter lacUV5) không được
kích hoạt cho đến khi cảm ứng IPTG, lúc đó số lượng T7RNA Polymerase tăng
nhanh chóng, vượt quá khả năng ức chế của T7 lysozyme.

Trần Thị Thanh Tuyền

14

Lớp 1102 K18


CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Các chủng vi sinh vật, plasmid
- Vector tách dòng pUC57 mang gen senp2 kích thước 681 nucleotide mã
hóa vùng trung tâm hoạt động của SENP2 có 227 amino acid. Vector này do phòng
kỹ thuật di truyền thiết kế.
- Chủng tách dòng E. coli DH10B.
- Vector biểu hiện pET22b(+).
- Chủng biểu hiện: E. coli BL21.
2.1.2. Hóa chất, enzyme
- Hóa chất: DNA chuẩn,protein chuẩn, ampicillin, Tris-HCl, glycine, SDS,
phenol, chloroform, methanol, iso-amylalcohol, glycerol, ethanol, Na2CO3,
Na2HPO4, NaH2PO4, KCl, NaCl, K2HPO4, HCl, H2SO4, acetic acid, cao nấm men,
bacto-pepton, bacto-tryptone và các hóa chất thông dụng khác.
- Các enzyme hạn chế: NcoI, XhoI, EcoRV, PstI.
- Enzyme nối: T4 – DNA ligase.
2.1.3. Máy móc

Máy ly tâm lạnh cỡ lớn, máy ly tâm lạnh cỡ nhỏ, box cấy, máy điện di DNA,
máy vortex, bộ điện di và máy điện di protein, máy speedvac, máy lắc ổn nhiệt, bể
ổn nhiệt, máy siêu âm, máy đo OD, tủ lạnh 4oC, -20oC, -80oC,…
2.1.4. Các môi trường và dung dịch sử dụng
2.1.4.1. Môi trường dùng trong biến nạp và nuôi cấy
- Môi trường LB lỏng: cao nấm men (0,5%), bactor pepton (1%), NaCl (1%).
- Môi trường chọn lọc LBA lỏng: thành phần gồm môi trường LB lỏng, bổ
sung Amp để đạt nồng độ cuối cùng là 100µg/ml.
- Môi trường LB đặc: LB lỏng có bổ sung 1,6% agar.
- Môi trường LBA đặc: LBA lỏng có bổ sung 1,6% agar.

Trần Thị Thanh Tuyền

15

Lớp 1102 K18


2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid
Dung dịch I (Sol I):
Tris-HCl, pH 8

25mM

EDTA, pH 8

10mM

Glucoza

50mM

- Dung dịch II (Sol II):
NaOH

0,2%

SDS

1%

- Dung dịch III ( Sol III):

-

-

Kali axetat

3M

Axit axetic

5M

Dung dịch đệm TE:
Tris HCl pH 8

10 mM

EDTA pH 8

1 mM

Dung dịch chloroform/isoamylalcohol (24:1): 24 lần thể tích

chloroform cộng với 1 lần thể tích isoamylalcohol.
-

Dung dịch phenol/chloroform/isoamyalcohol (25:24:1):25 lần thể tích

phenol cộng với 24 lần thể tích chloroform và 1 lần thể tích isoamylalcohol.
2.1.4.3. Các dung dịch dùng để chạy điện di DNA trên gel agarose
- Dung dịch đệm TAE 50 lần(100ml):

-

-

Tris

24,2%

Axit axetic

5,71 ml

EDTA 0,5M, pH 8

10 Ml

Đệm tra mẫu (Loading dye 6X):
Bromophenol blue

0,25%

Xylen cyanol FF

0,25%

Glycerol

30%

Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5µg/ml.

Trần Thị Thanh Tuyền

16

Lớp 1102 K18


2.1.4.4. Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide
Bảng 1: Công thức chế 1 bản gel acryalmide.

Thành phần
H2O

Gel tách (4,5 mL)

0,55 ml

Gel cô (1 mL)
0,45 ml

Tris-HCl 1,5M
(pH 8,8)

1,123 ml

-

Tris-HCl 1,5M (pH 6,8)
Glycerol (50%)
Acryamide (30%)
SDS (10%)
APS
TEMED

0,9 ml
1,89 ml
45 µl
30 µl
3 µl

0,3 ml
0,14 ml
4 µl
8 µl
1 µl

-

Đệm xử lý mẫu (treatment buffer 6X):
Tris-HCl 1M (pH 6,8)

7ml

Glycerol 100%

3ml

SDS

1g

2-Mercaptoethanol

0,6ml

Bromophenol blue

1,2ml

- Đệm chạy điện di (Running buffer), pH 8,4:
Tris

0,05M

Glycine

0,192M

SDS

0,1%

2.2. Phương pháp
2.2.1. Phương pháp biến nạp DNA vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
Cơ sở lý thuyết:
Dưới tác dụng của CaCl2, Ca2+ bám vào màng phosphor lipid của tế bào và lỗ
màng làm cho lỗ màng tích điện dương. Trộn DNA-bản chất tích điện âm sẽ bám

Trần Thị Thanh Tuyền

17

Lớp 1102 K18


được lên lỗ màng nhờ lực hút tĩnh điện. Khi tăng nhiệt đôt ngột, chênh lệch nhiệt độ
ở trong và ngoài tế bào tạo cho lỗ màng tế bào dãn nở, đẩy DNA vào trong tế bào.
Cách tiến hành:
a.

Chuẩn bị tế bào khả biến

- Làm tươi khuẩn lạc E. colitrên đĩa môi trường LB, ủ ở 37oC qua đêm.
- Cấy 1 khuẩn lạc rời E. colivào môi trường 10 ml LB lỏng, lắc 250
vòng/phút, ở 37oC qua đêm.

- Hút 1ml ml dịch nuôi cấy qua đêm chuyển sang 100 ml môi trường LB lỏng
(bình 500 ml), tiếp tục cấy lắc 300 vòng/phút ở 37oC cho tới khi OD600 đạt 0,4 đến
0,8. Đặt bình nuôi trong đá 30 -60 phút để dịch tế bào lạnh. Từ bước này trở đi, mẫu
phải được giữ lạnh.
- Ly tâm 1500 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút thu tế bào.
- Tủa tế bào được rửa lại nhẹ nhàng bằng CaCl2 50 mM lạnh rồi ly tâm 2000
vòng ở 4oC trong 10 phút (bước này được thực hiện 2 lần).
- Hoà tế bào vào 2 ml CaCl2 50 mM có chứa 15% glycerol lạnh (tương
đương 0.6x108 tế bào/µl).
- Chia dịch tế bào khả biến vào các Eppendorf mới và đặt trên đá, mỗi
eppendorf 100 µl.
b.

Biến nạp

- Bổ sung 1 µl DNA plasmid (10-40 pg DNA) vào 50 µl dịch tế bào khả biến
và đảo nhẹ để DNA plasmid phân bố đều và để trên đá khoảng 10 phút.
- Chuyển mẫu sang bể ấm 42oC trong 1 đến 2 phút và đặt nhanh mẫu vào đá.
- Bổ sung ngay 1 ml môi trường LB lỏng vào mẫu và trộn đều để tế bào
không bị sốc, dùng pipet đảo đều và nuôi lắc ở 250 vòng/phút trong 45 phút ở 37oC.
- Trải sản phẩm biến nạp lên môi trường LBA và ủ ở 37oC qua đêm.
2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli
Cơ sở lý thuyết:
Dưới tác dụng của các hóa chất NaOH, SDS thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ
và các phân tử protein, DNA genome bị biến tính. Khi thay đổi giá trị pH của dịch
chiết tế bào bằng dung dịch Kali acetate, các phân tử protein và DNA genome sẽ kết
tủa. Phần protein còn lại cùng các mảnh vỡ của tế bào sẽ hòa tan trong dung dịch

Trần Thị Thanh Tuyền

18

Lớp 1102 K18


chloroform: isoamylalcohol (24:1 v/v) và được tách ra khỏi phần dung dịch chứa
DNA plasmid bằng cách ly tâm ở tốc độ cao. DNA plasmid nằm ở pha trên được
thu lại bằng cách tủa trong cồn tuyệt đối. RNA có trog dung dịch được loại bỏ bằng
cách bổ sung nước chứa Rnase 10µg/µL.
Cách tiến hành:
- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc riêng rẽ vào ống peniciline chứa 2 ml môi trường
LBA, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút qua đêm ở 37oC.
-Hút 2 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5
phút và thu tế bào.
-Hòa tan tế bào thu được với 100 µl dung dịch I, để 10 phút ở nhiệt độ
phòng. Từ lúc này, các thao tác với mẫu được thực hiện ở nhiệt độ lạnh.
- Bổ sung 200 µl dung dịch II, đảo đều nhẹ nhàng để tránh đứt gãy DNA, đặt
trên đá 5 phút.
-Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, đảo đều nhẹ nhàng và nhanh sau đó đặt
trên đá 10 phút. Tủa protein sẽ xuất hiện và có màu trắng đục.
-Bổ sung tiếp 450 µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ để các
protein nhỏ hòa tan vào dịch có chloroform. Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5
phút. Lúc này mẫu hình thành 3 lớp: lớp trên cùng có chứa plasmid ADN, lớp giữa
là protein lớn không có khả năng hòa tan và lớp dưới cùng là
chloroform:isoamylalcohol có chứa protein tạp.
-Dùng pipet hút nhẹ nhàng dung dịch lớp trên và chuyển sang ống Eppendorf
loại 1,5 ml mới, sau đó dùng 2 lần thể tích ethanol 100% để tủa plasmid DNA và ủ
ở20oC trong 20 phút.
-Ly tâm thu tủa ở 13000 vòng/phút trong 10 phút.
-Thêm 500 µl ethanol 70%, đảo đều rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

thu tủa.
- Làm khô DNA trong máy hút chân không.
- Bổ sung Rnase 0,1% cho mỗi ống, ủ ở 37oC trong 30 phút.
-Hút 3 µl dịch chạy điện di kiểm tra plasmid tách được trên gel agarose
0,8%.
2.2.3. Điên di DNA trên gel agarose
Trần Thị Thanh Tuyền

19

Lớp 1102 K18