Sàng lọc, tuyển chọn và nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp LACCSE với tiềm năng ứng dụng loại màu thuốc nhuộm

SVTH: Nguyễn Hoài Thu

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
SÀNG LỌC, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI
CẤY THÍCH HỢP CỦA CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
LACCSE VỚI TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM

Người hướng dẫn:TS. Đinh Thị Thu Hằng
Sinh viên thực hiện:Nguyễn Hoài Thu
Lớp: 11-04

Hà Nội - 2015

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu

Lời Cảm Ơn !

Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Đặng
Thị Cẩm Hà, TS. Đinh Thị Thu Hằng đã tận tình chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và
dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp
tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tớiKS. Trần Thị Thu Hiền, Th.S Đào Thị Ngọc
Ánh, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS. Nguyễn Hải Vân, KS. Hoàng Thị Nhung, CN.

Nguyễn Văn Huynh và các anh chị trong phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi
trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã quan tâm, giúp đỡ và dạy bảo tận tình cho tôi trong quá trình làm khóa luận tốt
nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với thầy cô trong Khoa Công Nghệ Sinh
Học- Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn
thành khóa học và thực hiện khóa luận này.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn bố mẹ và những người thân yêu nhất đã tạo điều
kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành khóa
luận này.
Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2015

Nguyễn Hoài Thu

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1

ENZYME LACCASE ........................................................................... 3

1.1.1

Giới thiệu về laccase .......................................................................... 3

1.1.2

Cấu trúc phân tử của laccase............................................................... 3

1.1.3

Cơ chế xúc tác của laccase ................................................................. 5

1.1.4

Tính chất hóa sinh của enzyme laccase ............................................... 7

1.1.5

Sự phân bố và khả năng sinh laccase của một số VSV ........................ 8

1.1.6

Ứng dụng của laccase ....................................................................... 10

1.2

TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI .............................................................. 11

1.2.1

Nấm sợi ............................................................................................ 11

1.2.2

Khả năng sinh laccase của nấm sợi ................................................... 11

1.3

THUỐC NHUỘM ............................................................................... 11

1.3.1

Khái niệm thuốc nhuộm ................................................................... 11

1.3.2

Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại ô nhiễm của nó .................. 14

1.3.2.1 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm.................................. 14
1.3.2.2 Tác hại của ô nhiễm ........................................................................... 15
1.3.3

Khả năng xử lý thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học ................ 16

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 18
Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu

2.1

VẬT LIỆU ........................................................................................... 18

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 18

2.1.2

Hóa chất và môi trường nuôi cấy ...................................................... 18

2.1.3

Thiết bị, máy móc............................................................................. 19

2.2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................... 20

2.2.1

Sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh laccase ............................ 20

2.2.2

Phương pháp xác định hoạt tính laccase ........................................... 20

2.2.3

Định danh chủng nấm....................................................................... 21

2.2.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống ........................................ 21
2.2.3.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS
(ITS1 - 5,8 S - ITS2) ..................................................................................... 21
2.2.4

Nghiên cứu chọn lọc môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp lên

khả năng sinh laccase của chủng nấm đại diện .............................................. 24
2.2.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ................................................. 24
2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ........................................... 24
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chất cảm ứng ........................................................... 24
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CuSO4 .................................. 24
2.2.4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon ........................................................... 25
2.2.4.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ ...................................................... 25
2.2.5

Đánh giá khả năng loại màu của dịch enzyme thô của chủng nấm được

chọn

25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27
3.1

SÀNG LỌC CÁC CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SINH LACCASE
27

3.2

PHÂN LOẠI CHỦNG FAXS1 ........................................................... 28

3.2.1

Phân loại theo phương pháp truyền thống ......................................... 28

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
3.2.2

Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS

(ITS1 - 5,8 S - ITS2) ..................................................................................... 29
3.3

CHỌN LỌC MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ............. 31

3.3.1

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh laccase ........ 31

3.3.2

Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh laccase ................................... 33

3.3.3

Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase ................... 34

3.3.4

Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CuSO4 lên khả năng sinh

laccase. 35
3.3.5

Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh laccase................... 37

3.3.6

Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ lên khả năng sinh laccase ............. 38

3.4
KHẢ NĂNG LOẠI MÀU CỦA DỊCH ENZYME THÔ TỪ CHỦNG
NẤM MYROTHECIUM SP. FAXS1 ............................................................... 39
3.4.1

Khả năng loại màu nhóm anthraquinone của dịch enzyme thô từ chủng

Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết ................................... 40
3.4.2

Khả năng loại màu trong nhóm màu azo của dịch enzyme thô từ chủng

Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết ................................... 41
3.4.3

Khả năng loại màu thương mại của dịch enzyme thô từ chủng

Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết ................................... 43
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 46
4.1 Kết luận ....................................................................................................... 46
4.2 Kiến nghị..................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

Ace

Acetosyringone

bp

Base pair

CLS

Dimaren Black CLS

DDT

Dichloro - Trichloroethane Diphenyl

DNA

Deoxyribonucleic acid

Đtg

Đồng tác giả

HCH

Hexachlorocyclohexane

HOBT

Hydroxybenzotriazole

ITS

Internal transcribed spacer

Lac

Laccase

LF-2B

Everzol Red

LiP

Lignin peroxidase

MnP

Manganese peroxidase

NY1

Acid red 299

NY5

Acid red 266

NY7

Acid blue 281

PCR

Polymerase Chain Reaction

RBBR

Remazol brilliant blue R

Si

Sinapic acid

Syr

Syringaldehyde

TNT

Trinitrotoluen

VIO

Violuric acid

VSV

Vi sinh vật

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase ............................................. 9
Bảng 1.2. Một số loại thuốc nhuộm đại diện ......................................................... 14

Bảng 2.1. Danh sách các màu sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 18
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy ........................................................... 19
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng xác định hoạt tính laccase ................................... 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ............................................................................ 23
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt ....................................................................................... 23
Bảng 2.6. Thành phần các chất trong phản ứng loại màu ...................................... 26

Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc của 6 chủng nấm trên môi trường PDA chứa guaiacol
.............................................................................................................................. 27
Bảng 3.2. Hoạt tính laccase của 6 chủng nấm sau 8 ngày....................................... 28

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc không gian 3 chiều của laccase .................................................. 4
Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase ............................................................. 5
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase ...................................................................... 6
Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của laccase trong công nghiệp .......................................... 7
Hình 1.5. Màu Orange II (nhóm màu azo) bị phân hủy dưới tác dụng của
hydrogenase .......................................................................................................... 17
Hình 3.1.Hình thái của chủng FAXS1 dưới hiển vi quang học với độ phóng đại 400
lần ......................................................................................................................... 29
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR trình tự vùng ITS của chủng nấm FAXS1 ..... 30
Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm sợi FASX1 ............................. 31
Hình 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh laccase của chủng
Myrothecium sp. FAXS1 ....................................................................................... 32
Hình 3.5.Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp. FAXS133

Hình 3.6. Ảnh hưởng của một số chất cảm ứng lên hoạt tính laccase của chủng
Myrothecium sp. FAXS1 ....................................................................................... 34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium
sp. FAXS1 ............................................................................................................. 36
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium
sp. FAXS1 ............................................................................................................. 37
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp.
FAXS1 .................................................................................................................. 38
Hình 3.10. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY5 (A); RBBR (B) của dịch enzyme
thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết........................ 40
Hình 3.11. Sự thay đổi màu NY5 bởi laccase thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1
khi có mặt các chất gắn kết .................................................................................... 41
Hình 3.12. Sự thay đổi màu RBBR bởi laccase thô từ chủng Myrothecium sp.
FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết ....................................................................... 41
Hình 3.13. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY1 (A), NY7 (B) của dịch enzyme
thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết........................ 42
Hình 3.14. Sự thay đổi màu NY1 bởi laccase thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1
khi có mặt các chất gắn kết .................................................................................... 43
Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY7 bởi lacase thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1
khi có mặt các chất gắn kết .................................................................................... 43
Hình 3.16. Khả năng loại màu CLS (A) và LF-2B (B) của dịch enzyme thô từ
chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết .................................. 44
Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
Hình 3.17. Sự thay đổi màu CLS bởi dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp.
FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết ....................................................................... 44
Hình 3.18. Sự thay đổi màu LF-2B bởi dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp.
FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết ....................................................................... 45

Khóa luận tốt nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoài Thu

MỞ ĐẦU

Ngày nay, ô nhiễm môi trường, đặc biệt ô nhiễm môi trường nước ngày càng
tăng và trở nên nghiêm trọng. Ô nhiễm môi trường do tác động của thiên tai và các
hoạt động của con người (sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt, vui chơi
v.v.). Trong đó, nước thải từ hoạt động công nghiệp có ảnh hưởng nhiều nhất đến
môi trường nước do tính đa dạng và phức tạp. Một trong những ô nhiễm do sản xuất
công nghiệp gây ra được quan tâm hiện nay là ô nhiễm thuốc nhuộm.
Việt Nam là một trong những nước có tình trạng ô nhiễm môi trường bởi
thuốc nhuộm đang trở nên báo động,do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu
chuẩn đối với việc thải chất thải vào môi trường. Các phương pháp xử lý đang được
áp dụng phổ biến hiện nay như hấp phụ, keo tụ-tạo bông kết hợp lọc, oxy hoá hoá
học, phương pháp điện hoá v.v. thường không đạt hiệu quả cao. Bên cạnh đó, loại
màu và phân hủy thuốc nhuộm bằng con đường sinh học đang được quan tâm vì
vừa mang lại hiệu quả kinh tế và đặc biệt rất thân thiện với môi trường. Trong đó,
việc sử dụng các enzyme ngoại bào do các vi sinh vật sinh ra để xử lý, loại bỏ các
chất ô nhiễm là một lựa chọncó tiềm năng ứng dung cao.
Các enzyme ngoại bào như laccase, maganese peroxidase (MnP), lignin
peroxidase (LiP) từ lâu đã được sử dụng để xử lý ô nhiễm môi trường. Trong đó,
laccase là enzyme được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất. Laccase xuất hiện nhiều
ở các loại thực vật bậc cao và nấm, hoạt động ở dải pH tối thích rộng và có khả
năng chịu nhiệt cao. Chúng có khả năng phân hủy phenol và các dẫn xuất của
phenol. Ngoài ra, laccase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khử độc và
loại màu thuốc nhuộm do các ngành công nghiệp dệt nhuộm thải ra, xử lý nước thải,

trong công nghiệp giấy và thực phẩm, mỹ phẩm v.v.
Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới về laccase, chủ yếu tập trung vào các
chủng nấm đảm vì chúng có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao. Các
nghiên cứu tìm kiếm và khai thác enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase và
Khóa luận tốt nghiệp

Trang 1


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
peroxidase từ nấm đảm đã đạt những bước tiến rất lớn. Đã có tới gần 100 loại
enzyme laccase đã được xác định với trọng lượng phân tử khác nhau với các tính
chất khác nhau. Những năm gần đây, việc sản xuất enzyme ngoại bào nói chung và
laccase nói riêng từ nấm sợi đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan
tâm. Tuy nhiên laccase từ nấm sợi được tìm thấy chưa nhiều. Do đó đề tài “Sàng
lọc, tuyển chọn và nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng
nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp laccase với tiềm năng ứng dụng trong loại
màu thuốc nhuộm” đã được tiến hành với một số nội dung như sau:
-

Sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase từ bộ sưu tập
nấm đã được phân lập từrừng Quốc gia Xuân Sơntỉnh Phú Thọ và tỉnh Bình
Định;

-

Phân loại chủng nấm lựa chọn bằng phương pháp truyền thống và so sánh
trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2);

-

Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng
hợp laccase của chủng đại diện;

-

Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng đại diện;

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 2


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1

ENZYME LACCASE
1.1.1 Giới thiệu về laccase
Laccase (p- benzenedoil: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm

enzyme oxy hóa khử. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa
cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử.
Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao
gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm,
benzenethiol, PCB (polychlorinated biphenyl), dioxin và cả các hợp chất vô cơ như
iot. Các laccase được tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ
glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học[29].
1.1.2 Cấu trúc phân tử của laccase

Một loài vi sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng
enzyme này khác nhau về trình tự acid amin và một số tính chất về động học xúc
tác. Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl
hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate. Nấm Trametes versicolor có 5 dạng
isozyme và chúng chỉ khác nhau về thành phần carbohydrate, thành phần
carbohydrate của chúng thay đổi từ 10 – 45% so với khối lượng của thành phần
protein. Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric
protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kD. Phần lớn laccase
của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 10
– 25% [28]. Ngoài ra còn có nhiều loại enzyme giống laccase (laccase-like) [1].
Tuy vậy, tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với
4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1),
loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện
tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện
Khóa luận tốt nghiệp

Trang 3


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và
có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh (Hình 1.1).

Hình 1.1.Cấu trúc không gian 3 chiều của laccase
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B, C có
khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác
của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm
một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt
chung của vùng A và vùng C.
Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên kết với

một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử
đồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ
ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng.
Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3.
Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử
đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ(Hình 1.2) [29].

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 4


SVTH: Nguyễn Hoài Thu

Hình 1.2.Trung tâm hoạt động của laccase
1.1.3 Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp
chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn
các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng. Sự phù hợp của các
cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp
giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa
thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa
học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V
[8]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác bởi laccase thường tạo thành một
gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính
laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme nhờ hydrate hóa,
phân ly hoặc polymer hóa.
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy
hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử
đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử

đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển
đồng thời 4 điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 5


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
tripeptit bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo
thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.3).

Hình 1.3.Cơ chế xúc tác của laccase
Trong công nghệ tổng hợp các hợp chất hay trong các công nghệ khác, cơ
chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế ở hình 1.3. Cơ chế đơn giản
nhất có thể xảy ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động của
enzyme. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo phức tạp hoặc có thế khử
quá lớn. Vì vậy, chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử
laccase. Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian gọi là mediator
(chất gắn kết) (Hình 1.4). Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản
ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do[41]. Sau đó chất trung
gian ở dạng sạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành chất khử, tiếp
tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Ngược lại, laccase sau khi cho chất trung gian một
điện tử thì trở thành dạng khử và bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham
gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo.
Các chất gắn kết thường được sử dụng cho laccase là: 3-hydroxyanthranillic
acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 1hydroxybenzo-trialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (ViO)

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 6


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
v.v. [41]. Sự tham gia của chất gắn kết làm cho laccase có khả năng tham gia xúc
tác với nhiều chất hơn, tức là làm tăng tính không đặc hiệu cơ chất.
Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như: azide, cyanide,
fluoride. Các ion này liên kết vào trung tâm đồng và cản trở các dòng điện tử đi đến
các nguyên tử này. Các chất ức chế khác là EDTA, tropolone, kojic acid và
coumaric acid, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn. Các hợp
chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được
coi là chất ức chế enzyme laccase.

Hình 1.4.Cơ chế xúc tác của laccase trong công nghiệp
1.1.4 Tính chất hóa sinh của enzyme laccase
Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis-Menten
(Km). Hằng số này của laccase dao dộng trong một khoảng giới hạn khá rộng từ 2500 µM phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme và cơ chất. Giá trị Km thấp nhất với
cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của hai phân tử 2,6- dimethoxyphenol
liên kết với nhau bằng cầu nối azide). Ái lực đối với oxy ít phụ thuộc vào enzyme
và chỉ dao động trong khoảng 20-50 µM.
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với các cơ chất
phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của
Khóa luận tốt nghiệp

Trang 7


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase. Mặt
khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của cơ chất phenolic, do đó cơ chất

phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt tính của laccase ở các pH khác
nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa
khử laccase- cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion
hydrocide. Đối với các cơ chất không phải phenolic như ATBS thì phản ứng oxy
hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng
2-3. Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm từ 8-9.
Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi
sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30-50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt
độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc
Prokaryote, ví dụ như: thời gian bán hủy của laccase ở Streptomyces lavendulae là
100 phút ở 70oC và của protein CotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC.
Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thường dưới 60 phút ở 70oC và
dưới 10 phút ở 80oC [8; 29; 30; 44].
1.1.5 Sự phân bố và khả năng sinh laccase của một số VSV
Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực
vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase được phát hiện lần đầu tiên ở cây
Ruhs vernicifera . Việc nghiên cứu laccase trên đối tượng thực vật và nấm đảm rất
phổ biến. Laccase còn được phát hiện trong các loài nấm thuộc các lớp Ascomyces,
Deuteromyces, Basidomyces và các loài nấm có khả năng phân hủy lignocellulose
như Agaricus basidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum, Coprius,
cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus, Pycnoporus
cinnabarius, Trametes versicolor. Tuy nhiên các nghiên cứu về laccase trên các đối
tượng xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sợi không nhiều. Một số loại VSV có khả năng
sinh enzyme laccase được trình bày ở bảng 1.1[19; 20; 32; 40].

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 8

SVTH: Nguyễn Hoài Thu
Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase
Nấm đảm

Phanerochaete chrysosporium
Pycnoporus cinnabarinus
Rhizotonia solani
Trametes villosa
Trametes versicolor
Pleurotus ostreatus
Lentinula edodes
Agaricus bisporus
Botrytis cinerea

Nấm sợi

Melanocarpus albomyces
Fusarium oxysporum
Aspergillus nidulans
Trichoderma harzianum
Aspergillus niger
Aspergillus terreus
Pholiota spp.
Peniophora spp.
Mauginiella sp.

Xạ khuẩn

Streptomyces lavendulae
Streptomyces psammoticus

Streptomyces viridosporus
Streptomyces coelicolor

Vi khuẩn

Bacillus licheniformis
Bacillus halodurans
Thermus thermophilus
Escherichia coli
Bacillus subtilis

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 9


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
1.1.6 Ứng dụng của laccase
Phương pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme được xem là phương pháp khả
thi có thể thay thế các phương pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với
môi trường, có tính đặc hiệu và hiệu suất cao. Laccase là một trong các enzyme oxy
hóa được ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ
chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân tử chứ không cần các
chất nhận điện tử đắt tiền khác như NAD(P)+. Laccase được ứng dụng trong các
lĩnh vực sau :
-

Laccase được sử dụng trong một số ngành công nghiệp giấy để phân hủy
lignin trong bột gỗ; tẩy trắng trong công nghiệp dệt nhuộm; xử lý các hợp
chất polyphenol và loại bỏ oxy không mong muốn trong một số ngành công

nghiệp thực phẩm; hóa mỹ phẩm, dược phẩm v.v. ;

-

Laccase có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các
biosensor có độ nhạy cao ;

-

Laccase tham gia xúc tác chuyển hóa phân hủy các chất độc, đặc biệt là các
chất có cấu trúc phức tạp, không tan như hợp chất (poly) phenol, chất ô
nhiễm chứa phenol và các dẫn xuất clo của phenol khác như các hợp chất
PAH, PCB từ ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ TNTtrong ngành khai
khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu DDT, HCH, thuốc diệt cỏ (2,4-D, 2,4,5-T)
v.v. dùng trong nông nghiệp[17] ;

-

Trong công nghiệp thực phẩm: sử dụng trong quá trình ổn định hàm lượng
acid, điều chỉnh các hợp chất phenol trong sản xuất rượu, tăng tuổi thọ bia,
đuổi oxy ra khỏi dầu ăn, làm tăng hương vị và tuổi thọ của dầu ;

-

Trong y dược: laccase được sử dụng trong quá trình tổng hợp các loại thuốc
phức tạp trong y tế như thuốc mê, thuốc chống viêm, thuốc kháng sinh,
thuốc an thần v.v. [21; 25; 26] ;

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 10


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
1.2

TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI

1.2.1 Nấm sợi
Nấm sợi (filamentous fungi) thuộc nhóm vi nấm, có kích thước hiển vi.
Chúng là một hệ sợi phức tạp, đa bào, có màu sắc phong phú. Nấm sợi có cấu tạo cơ
quan sinh sản với nhiều hình thức sinh sản khác nhau. Đây là một trong những tiêu
chuẩn chủ yếu để phân loại chúng [3; 4].
Nhiều tác giả đã đưa ra những hệ thống phân loại khác nhau. Mỗi hệ thống
đều có ưu, nhược điểm nhất định. Nhưng đều theo hai hệ thống phân loại chung.
Hệ thống phân loại hình thái: dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm
sinh lý, sinh hoá và phương thức sinh sản. Hệ thống phân loại dựa trên các phương
pháp sinh hoá và sinh học phân tử được sử dụng rất ít. Khoá phân loại phổ biến hiện
nay thường dùng là khoá phân loại hình thái của Robert A. Samson (1984) [38].
1.2.2 Khả năng sinh laccase của nấm sợi
Nấm sợi là một trong nhóm VSV có khả năng sinh nhiều loại enzym có hoạt
tính sinh học cao. Nấm sợi là nhóm VSV có tiềm năng lớn sinh các loại như: Lignocellulose, protease, amylase, kitinase, pectinase, oxygenase, laccase v.v. [5]. Trong
đó, laccase đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm. Với
nhiều phương pháp khác nhau, một số nhà khoa học đã tìm ra các chủng nấm sợi
sinh laccase như: Aspergillus sp. FNA1, Myrothecium sp. FNBLa1, Trichoderma
harzianum WL1, M. verrucaria 24G-4, M.melanosporum, M.verrucaria NF-05, v.v.
[1; 7; 36; 44; 48; 50]
1.3

THUỐC NHUỘM

1.3.1 Khái niệm thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm là những chất hữu cơ có màu, hấp thụ mạnh một phần nhất

định của quang phổ ánh sáng nhìn thấy và có khả năng gắn kết vào các vật liệu dệt.
Thuốc nhuộm có thể có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp. Hiện nay, chúng ta
hầu như chỉ sử dụng thuốc nhuộm tổng hợp. Đặc điểm nổi bật của thuốc nhuộm là
Khóa luận tốt nghiệp

Trang 11


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
độ bền màu- tính chất không bị phân hủy bởi các điều kiện, tác động khác nhau của
môi trường, đây vừa là yêu cầu với thuốc nhuộm lại vừa là vấn đề với xử lý nước
thải dệt nhuộm. Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa học của nó.
Phân tử thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu và nhóm trợ màu.
Thuốc nhuộm tổng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc, phạm vi
sử dụng. Dưới đâylà cách phân loại dựa trên cấu tạo của nhóm mang màu, theo đó
thuốc nhuộm được phân thành 20-30 họ thuốc nhuộm khác nhau. Các họ thuốc
nhuộm chính bao gồm:
• Thuốc nhuộm azo: nhóm mang màu là nhóm azo (-N=N-), phân tử
thuốc nhuộm có một (monoazo) hay nhiều nhóm azo (diazo, triazo, polyazo). Đây
là họ thuốc nhuộm quan trọng nhất và có số lượng lớn nhất, chiếm khoảng 60-70%
số lượng các thuốc nhuộm tổng hợp, chiếm 2/3 các màu hữu cơ trong Color Index.

• Thuốc nhuộm anthraquinone: trong phân tử thuốc nhuộm chứa một
hay nhiều nhóm anthraquinon hoặc các dẫn xuất của nó. Họ thuốc nhuộm này
chiếm đến 15% số lượng thuốc nhuộm tổng hợp. Đây là họ phổ biến thứ 2 sau thuốc
nhuộm azo trong số các loại thuốc nhuộm tổng hợp.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 12


SVTH: Nguyễnn Hoài Thu
• Thuốc nhuộộm triaryl metan: triaryl metan là dẫn xuấtt ccủa metan mà
trong đó nguyên tử C trung tâm sẽ tham gia liên kết vào mạch
ch liên kkết của hệ mang
màu. Họ thuốc nhuộm
m này ph
phổ biến thứ 3, chiếm 3% tổng số lượng
ng thu
thuốc nhuộm.
C

C

diaryl metan

triaryl metan

• Thuốc nhuộộm phtaloxianin: hệ mang màu trong phân ttử của chúng là
hệ liên hợp khép kín. Đặặc điểm chung của họ thuốc nhuộm
m này là nh
những nguyên tử
H trong nhóm imin dễ dàng bbị thay thế bởi ion kim loạii còn các nguyên tử
t N khác
tham gia tạo phức vớii kim loại
lo làm màu sắc của thuốc nhuộm thay

ay đổi. Họ thuốc
nhuộm này có độ bềnn màu vvới ánh sáng rất cao, chiếm khoảng
ng 2% tổng
t
số lượng
thuốc nhuộm.

Ngoài ra, còn các hhọ thuốc nhuộm khác ít phổ biến,
n, ít có quan tr
trọng hơn
như: thuốc nhuộm
m nitrozo, nitro, polymetyl, arylamin, azometyn, thu
thuốc nhuộm lưu
huỳnh…

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 13


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
Bảng 1.2.Một số loại thuốc nhuộm đại diện

Nhóm

Màu

C.I

Ký

hiệu

Trọng lượng

Độ hòa

phân tử

tan

(g/mol)

(g/l)

λmax
(nm)

Axit xanh 62

62045

NY3

400,5

40

595

Axit xanh 281

-

NY5

580,6

20

600

61200

RBBR

626,5

-

595

Axit đỏ 299

-

NY1

519,6

10

520

Axit đỏ 266

17101

NY7

467,8

15

499

-

NY8

474,5

4

440

Anthraquinone

Remazol
Brilliant Blue
R

Azo

Axit da cam
116

1.3.2 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại ô nhiễm của nó
1.3.2.1 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm
Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm phụ thuộc vào các hóa chất, chất trợ, thuốc
nhuộm và công nghệ sử dụng. Trong đó ô nhiễm do thuốc nhuộm trở thành vấn đề
chủ yếu đối với nước thải dệt nhuộm. Thuốc nhuộm sử dụng hiện nay là các sản
phẩm tổng hợp hữu cơ. Nồng độ thuốc nhuộm trong môi trường nước tiếp nhận đối
với công đoạn dệt-nhuộm phụ thuộc vào một số yếu tố: mức độ sử dụng hàng ngày
của thuốc nhuộm,độ gắn màu của thuốc nhuộm lên vật liệu dệt, mức độ xử lý trong
các công đoạn xử lý nước thải, hệ số pha loãng trong nguồn nước tiếp nhận.
Mức độ gắn màu là một yếu tố quan trọng, nó phụ thuộc vào độ đậm màu,
công nghệ áp dụng, tỷ lệ khối lượng hàng nhuộm và dung dịch nước dùng trong
máy nhuộm, vật liệu và thuốc nhuộm sử dụng. Tổn thất thuốc nhuộm đưa vào nước
trung bình là 10% với màu đậm, 2% với màu trung bình và <2% với màu nhạt.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 14


SVTH: Nguyễn Hoài Thu
1.3.2.2 Tác hại của ô nhiễm
Họ thuốc nhuộm azo và các sản phẩm phân hủy thứ cấp có vòng thơm mang
nhóm amine[8] độc và gây đột biến đối với các cơ thể sống.
Các thuốc nhuộm hữu cơ nói chung được xếp loại từ ít độc đến không độc

đối với con người được đặc trưng bằng chỉ số LD50. Các kiểm tra về tính kích thích
da, mắt cho thấy đa số thuốc nhuộm không gây kích thích với vật thử nghiệm (thỏ)
ngoại trừ một số cho kích thích nhẹ.
Tác hại gây ung thư và nghi ngờ gây ung thư: không có loại thuốc nhuộm
nào nằm trong nhóm gâyung thư cho người. Các thuốc nhuộm azo được sử dụng
nhiều nhất trong ngành dệt, tuy nhiên chỉ có một số màu azo, chủ yếu là thuốc
nhuộm benzidin, có tác hại gây ung thư. Các nhà sản xuất châu Âu đã ngừng sản
xuất loại này, nhưng trên thực tế chúng vẫn được tìm thấy trên thị trường do giá
thành rẻ và hiệu quả nhuộm màu cao.
Mức độ độc hại với cá và các loài thủy sinh: các thử nghiệm trên cá của hơn
3000 thuốc nhuộm được sử dụng thông thường cho thấy thuốc nhuộm nằm trong tất
cả các nhóm từ không độc, độc vừa, độc, rất độc đến cực độc. Trong đó có khoảng
37% thuốc nhuộm gây độc vừa đến độc cho cá và thủy sinh, chỉ 2% thuốc nhuộm ở
mức độ rất độc và cực độc cho cá và thủy sinh.
Khi đi vào nguồn nước nhận như sông, hồ, v.v. với một nồng độ rất nhỏ
thuốc nhuộm đã cho cảm nhận về màu sắc. Thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng càng
nhiều thì màu nước thải càng đậm. Màu đậm của nước thải cản trở sự hấp thụ oxy
và ánh sáng mặt trời, gây bất lợi cho sự hô hấp, sinh trưởng của các loài thủy sinh
vật. Nó tác động xấu đến khả năng phân giải của vi sinh đối với các chất hữu cơ
trong nước thải. Các nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải trực tiếp thuốc nhuộm
hoạt tính bằng vi sinh rất thấp. Ở Việt Nam, qua số liệu điều tra tại các công ty dệt
may lớn đều cho thấy màu nước thải dệt nhuộm chủ yếu do thuốc nhuộm hoạt tính
và một phần do các loại thuốc nhuộm không tan hết khác gây ra.

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 15


SVTH: Nguyễn Hoài Thu

1.3.3 Khả năng xử lý thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học
Ở nước ta hiện nay, phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm được áp dụng
phổ biến chủ yếu theo 3 phương pháp: phương pháp hóa lý ( keo tụ- tạo bông, hấp
thụ và lọc), phương pháp oxy hóa bậc cao (sử dụng các chất oxy hóa như chloride
(Cl2), hydroxyl peroxide (H2O2) và ozone (O3)) và phương pháp sinh học. Trong đó,
xử lý sinh học nước thải dệt nhuộm bằng bùn hoạt tính hiếu khí và kỵ khí cho hiệu
quả cao.
Cơ chế loại màu gồm: hấp phụ sinh học, phân hủy bằng enzyme, keo tụ tạo
bông sinh học hoặc kết hợp cả ba [49]. Hiệu quả loại màu phụ thuộc vào lớp thuốc
nhuộm cũng như các nhóm thế khác nhau của mỗi loại thuốc nhuộm và các đặc tính
hóa lý của nước thải, chẳng hạn như nguồn carbon, nitơ, pH, nhiệt độ, hàm lượng
muối và sự hiện diện của các chất ô nhiễm hữu cơ.
Dưới điều kiện phù hợp, thuốc nhuộm có thể bị chuyển hóa, phân hủy bởi
các enzyme reductase nội bào và ngoại bào. Các enzyme reductase nội bào xúc tác
cho phản ứng phân hủy thuốc nhuộm khi có sự hiện diện cáccofactor như FADH2,
NADH, NADPH[12]. Hầu hết các loại thuốc nhuộm azo có nhóm thế sulfonate và
trọng lượng phân tử cao không thể đi qua màng tế bào. Do đó, các hoạt động khử
thuốc nhuộm azo không phụ thuộc nhiều vào sự hấp thu nội bào. Sự oxy hóa thuốc
nhuộm được xúc tác bởi các enzyme ngoại bào là peroxidase và phenoloxidase như
laccase (Lac), manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), tyrosinase
(Tyr), N-demethylase và cellobiose dehydrogenase [21].

Khóa luận tốt nghiệp

Trang 16