Nghiên cứu khả năng thủy phân bã sắn giầu tinh bột bởi enzyme từ nấm aspergillus

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu khả năng thủy phân bã sắn giầu tinh bột bởi
enzyme từ nấm Aspergillus
Người hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
Lớp

: TS. VŨ VĂN HẠNH
: NGUYỄN VĂN BÁCH
: KS CNSH 11.01

HÀ NỘI – 2015


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

--------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu khả năng thủy phân bã sắn giầu tinh bột bởi
enzyme từ nấm Aspergillus
Người hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
Lớp

: TS. VŨ VĂN HẠNH
: NGUYỄN VĂN BÁCH
: KS CNSH 11.01

HÀ NỘI – 2015


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh,
Trưởng phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí
nghiệm, chỉnh sửa luận văn và tạo điều kiện về vật tư, hóa chất và thiết bị c
ho nghiên cứu để chúng tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ phòng Các chất chức năng sinh học
đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo Khoa Công nghệ Sinh

học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng
như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp 11.01 và tất cả bạn bè đã
luôn động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt thời
gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Văn Bách


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

LỤC MỤC

LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i
LỤC MỤC ..............................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ........................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ SẮN.......................................................................... 3
1.1.1. Quy trình sản xuất tinh bột sắn ............................................................... 3
1.1.2. Bã sắn ..................................................................................................... 5
1.1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn hiện nay ................................... 6
1.2. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM ASPERGILLUS ................................................ 8
1.2.1. Giới thiệu chung[20]............................................................................... 8
1.2.2 Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm................................................................. 9

1.2.3. Hình thái nấm mốc ................................................................................. 9
1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT SỐNG
CỦA NẤM ASPERGILLUS ................................................................................. 9
1.3.1 Amylase .................................................................................................. 9
1.3.2 α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase) ...................................................... 11
1.3.3. γ-amylase (glucoamylase) ..................................................................... 14
1.4 NUÔI CẤY LÊN MEN LỎNG VÀ LÊN MEN XỐP ............................... 15
1.4.1 Lên men lỏng ......................................................................................... 15
1.4.2 Lên men xốp .......................................................................................... 16
PHẦN 2................................................................................................................. 17
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 17
2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 17
2.1.1 Đối tượng .............................................................................................. 17
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.................................................................. 18
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 19
2.2.1 Hoạt hóa chủng...................................................................................... 19
2.2.2 Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật[9] .................................... 20
2.2.3 Nuôi cấy lên men lỏng, lên men xốp ...................................................... 20
2.2.4 Phương pháp hóa sinh............................................................................ 21
2.2.5 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men
sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột của chủng nấm Aspergillus A13 ..... 24
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân
bã sắn[16],[ 24],[ 26] ...................................................................................... 26
Phần 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 27
3.1 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG LÊN MEN SINH TỔNG
HỢP ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT CỦA CHỦNG NẤM ASPERGILLUS
A13 .................................................................................................................... 27


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

3.1.1 Tối ưu độ ẩm cơ chất môi trường lên men xốp....................................... 27
3.1.2 Tối ưu thời gian nuôi cấy môi trường lên men lỏng (tuổi giống) ............ 28
3.1.3 Tối ưu nguồn nitrogen trên môi trường lên men xốp .............................. 29
3.1.4 Tối ưu nhiệt độ trên môi trường lên men xốp ......................................... 30
3.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ SẮN 31
3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân bã sắn ........................ 31
3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân bã sắn ................................ 33
3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ bã sắn đến khả năng thủy phân bã sắn ............. 34
3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân bã sắn ...... 35
Phần 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 37
Phần 5 PHỤ LỤC .................................................................................................. 41


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Thành phần hóa lý của bã sắn (g/100 g khối lượng khô)
Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn glucose
Bảng 2.3 Xây dựng đường chuẩn Maltose
Bảng 2.4. Xác định hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột
Bảng 5.1 Đường chuẩn maltose
Bảng 5.2 Đường chuẩn glucose
Bảng 5.3 Kết quả tối ưu độ ẩm cơ chất môi trường lên men xốp ở độ ẩm 15%

Bảng 5.4 Kết quả tối ưu độ ẩm cơ chất môi trường lên men xốp ở độ ẩm 20%
Bảng 5.5 Kết quả tối ưu độ ẩm cơ chất môi trường lên men xốp ở độ ẩm 25%
Bảng 5.6 Kết quả tối ưu độ ẩm cơ chất môi trường lên men xốp ở độ ẩm 30%
Bảng 5.7 Kết quả tối ưu độ ẩm cơ chất môi trường lên men xốp ở độ ẩm 35%
Bảng 5.8 Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy môi trường lên men lỏng 1 ngày
Bảng 5.9 Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy môi trường lên men lỏng 2 ngày
Bảng 5.10 Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy môi trường lên men lỏng 3 ngày
Bảng 5.11 Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy môi trường lên men lỏng 4 ngày
Bảng 5.12 Kết quả tối ưu thời gian nuôi cấy môi trường lên men lỏng 5 ngày
Bảng 5.13 Kết quả tối ưu nguồn nitrogen urea trên môi trường lên men xốp
Bảng 5.14 Kết quả tối ưu nguồn nitrogen KNO3 trên môi trường lên men xốp
Bảng 5.15 Kết quả tối ưu nguồn nitrogen NH4NO3 trên môi trường lên men xốp
Bảng 5.16 Kết quả tối ưu nguồn nitrogen NH4CL trên môi trường lên men xốp
Bảng 5.17 Kết quả tối ưu nhiệt độ trên môi trường lên men xốp ở 28 độ C
Bảng 5.18 Kết quả tối ưu nhiệt độ trên môi trường lên men xốp ở 30 độ C
Bảng 5.19 Kết quả tối ưu nhiệt độ trên môi trường lên men xốp ở 32 độ C
Bảng 5.20 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân
Bảng 5.21 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân bã sắn


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Bảng 5.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bã sắn đến khả năng thủy phân
bã sắn
Bảng 5.23 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng thủy
phân bã sắn

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột sắn tại nhà máy Fococev sản
xuất tinh bột sắn
Hình 1.2 Hình ảnh bã sắn( mẫu bã sắn được lấy tại cơ sở sản xuất tinh bột sắn tại
Cát Quế, Hoài Đức, Hà Nội)
Hình 2.1. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng Aspergillus A13 sử dụng trong nghiên cứu
Hình 5.1 Đường chuẩn maltose
Hình 5.2 Đường chuẩn glucose
Hình 5.3 Hình ảnh kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân
bã sắn của chủng Aspergillus A13
Hình 5.4 Hình ảnh kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân bã
sắn của chủng Aspergillus A13
Hình 5.5 Hình ảnh kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bã sắn đến khả năng
thủy phân bã sắn của chủng Aspergillus A13
Hình 5.6 Hình ảnh kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả
năng thủy phân bã sắn của chủng Aspergillus A13


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy
phân tinh bột của chủng Aspergilles A13
Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng tuổi giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

tinh bột của chủng Aspergilles A13
Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nguồn Nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
thủy phân tinh bột của chủng Aspergilles A13
Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân
tinh bột của chủng Aspergilles A13
Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân bã sắn của chủng
Aspergillus A13
Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân bã sắn của chủng
Aspergillus A13
Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ bã sắn đến khả năng thủy phân bã sắn của
chủng Aspergillus A13
Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân bã sắn của
chủng Aspergillus A13


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

MỞ ĐẦU

Theo số liệu thống kê của FAO, Việt Nam là nước xuất khẩu tinh bột sắn đứng
thứ hai trên thế giới, chỉ sau Thái Lan. Tinh bột sắn được sử dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau như thực phẩm, y dược, dệt… Chính vì vậy,
trong những năm gần đây, ở nước ta nhiều nhà máy sản xuất tinh bột sắn ra đời.
Hiện nay, ở Việt Nam có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng công suất
khoảng 38 triệu tấn củ tươi/năm. Theo ước tính một nhà máy chế biến tinh bột sắn
có công suất 30 – 100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5 – 25 tấn tinh bột, kèm theo đó
là 12 – 48 tấn bã [31].
Chất thải rắn chính là vỏ và bã sắn. Bã sắn có độ ẩm trên 80% nên khi phơi dễ

bị nhiễm khuẩn, sinh mùi khó chịu và ảnh hưởng đến môi trường xung quanh. Như
vậy, vấn đề ô nhiễm tại các nhà máy tinh bột sắn hiện nay là vấn đề cần được giải
quyết một cách khẩn trương. Bởi lẽ tình trạng này càng kéo dài thì môi trường ngày
càng bị ô nhiễm trầm trọng.
Thành phần của bã sắn gồm 5,3% protein, 56% tinh bột, 0,1% chất béo, 2,7%
tro và 35,9% chất xơ (tính theo phần trăm khối lượng chất khô) theo FAO, do đó
trong bã sắn vẫn còn giá tri dinh dưỡng khá cao. Tuy nhiên, bã sắn hiện nay chủ yếu
được bán làm thức ăn gia súc ở dạng khô hoặc dạng tươi. Việc sử dụng bã sắn theo
dạng này mang lại hiệu quả về giá trị dinh dưỡng và kinh tế không cao. Vì vậy, việc
xử lí bã sắn vừa làm tăng giá trị cho bã sắn vừa tạo sản phẩm phụ có ích trong các
nhà máy sản xuất tinh bột sắn.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu khả năng thủy phân bã sắn giầu tinh bột bởi enzyme từ nấm
Aspergillus”.
Mục tiêu: Tìm ra giải pháp xử lý bã thải từ chế biến tinh bột sắn bằng chế
phẩm enzyme vừa đem lại giá trị kinh tế, vừa có ý nghĩa môi trường.


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát hoạt tính enzyme α - amylase và enzyme α - glucoamylase của nấm
Aspergillus trong môi trường tối ưu cơ bản
- Nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men xốp (1 loại cơ chất, hỗn hợp cơ chất, dinh
dưỡng ,…) cho sinh tổng hợp enzyme thủy phân tinh bột sống
- Nghiên cứu các thông số lí hóa (nhiệt độ, pH, cơ chất, nồng độ cơ chất, thời gian
thủy phân, phụ gia,…) ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme (α-amylase, α-glucoamylase) thủy phân tinh bột sống.
- Xây dựng quy trình đường hóa tinh bột bởi enzyme thủy phân tinh bột sống.

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là bước đầu tạo điều kiện cho các nghiên cứu
sâu hơn về khả năng thủy phân bã sắn của hệ vi sinh vật có khả năng thủy phân cao
để áp dụng vào việc xử lý bã sắn ở các nhà máy, cơ sở sản xuất tinh bột sắn.


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ SẮN
1.1.1. Quy trình sản xuất tinh bột sắn
Nguyên liệu

Tiếp nhận
Cân

Kiểm tra độ bột

Phễu nạp liệu

Bóc vỏ
Tạp chất
Nước thải của máy
phân ly

Rửa

Chặt

Mài

Sữa loãng

Trích ly thô

Trích ly tinh

Bã sắn


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Phân ly thô
Dịch bào

Nước sạch
Phân ly tinh

Ly tâm

Sấy
210-2200C
Làm nguội
Đóng bao
Hình 1.1. Hình ảnh sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột sắn tại nhà máy
Fococev sản xuất tinh bột sắn.

Trong quá trình sản xuất tinh bột sắn sẽ thải ra một lượng lớn bã sắn bao gồm
hai loại:
-

Loại thứ nhất là bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ, chiếm tỉ trọng ít
và thành phần chủ yếu là cellulose, hemicellulose, cát và sạn. Loại này
thường được chôn lấp hợp vệ sinh hoặc dùng làm phân bón.

-

Loại thứ hai là phần bã còn lại sau khi tách tinh bột sắn được gọi là bã
sắn.


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Trong loại bã này có chứa phần lớn là cellulose và một phần tinh bột còn sót
lại. Mục đích của chúng tôi là sử dụng chế phẩm enzyme sinh học để chuyển các
thành phần này thành các hợp chất đơn giản và dễ hấp thụ cho gia súc, và cũng có
thể sử dụng các hợp chất này làm cơ chất cho các quá trình chuyển hóa tiếp
theo[31].
1.1.2. Bã sắn
Sắn (hay tên gọi khác là khoai mỳ) là cây lương thực ăn củ, thuộc chi Manihot,
loài Manihot Esculenta, thuộc họ thầu dầu Euphrbijaceae. Sắn là một loại cây trồng
phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như Brazil, Thái Lan, Việt Nam.... Nó được
dùng để sản xuất bột sắn, làm thức ăn và sản xuất tinh bột sắn. Mỗi ngày ngành
công nghiệp sản xuất tinh bột sắn thải ra hàng tấn chất thải rắn bã sắn. Nó có thể là
nguyên nhân nghiêm trọng làm ô nhiễm môi trường nếu không có biện pháp xử

lý[8].

a

b

Hình 1.2 Hình ảnh bã sắn( mẫu bã sắn được lấy tại cơ sở sản xuất tinh bột sắn
tại Cát Quế, Hoài Đức, Hà Nội)
(a) bã sắn tươi . (b) bã sắn khô

Hiện nay, bã sắn tại các nhà máy sản xuất tinh bột sắn được bán cho các doanh
nghiệp hoặc người dân chăn nuôi nhỏ với giá rất rẻ khoảng 200 đồng/kg bã tươi và
800 – 1000 đồng/kg bã khô (giá tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn tại Cát Quế -Hoài
Đức- Hà Nội). Với giá thành như vậy thì việc sử dụng bã sắn để sản xuất các sản


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

phẩm khác là hoàn toàn thuận lợi, vừa giải quyết được vấn đề môi trường, vừa tăng
thêm giá trị sử dụng và kinh tế cho bã sắn.

Bảng 1.1. Thành phần hóa lý của bã sắn (g/100 g khối lượng khô)
Thành phần

Soccol
(1994)

Cereda

(1994)

Sterz
(1997)

Vandenberghe
(1998)

Độ ẩm

5,02

9,52

10,70

11,20

Protein

1,57

0,32

1,60

1,61

Lipid

1,06

0,83

0,53

0,54

Chất xơ

50,55

14,88

22,20

21,10

Tro

1,10

0,66

1,50

1,44

Carbohydrates

40,50

63,85

63,40

63,00

(Theo A.Pandey/ Bioresource Technology 74 (2000))

Bã sắn được sử dụng để sản xuất ra các sản phẩm sau: Thức ăn cho động vật nhai
lại; Sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao từ bã sắn; Sản xuất cồn sinh học; Tạo
chất dính cho sản xuất diêm; Dùng làm phân bón; Sản xuất ethanol sinh học.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn hiện nay
Bã sắn là dạng phế liệu của ngành công nghiệp sử dụng các nguyên liệu nông
nghiệp có sản lượng lớn và phổ biến trên trên thế giới. Nền công nghiệp sản xuất
tinh bột sắn ở một số nước đã đạt đến con số hàng nghìn tấn sắn củ sắn mỗi ngày,
đồng nghĩa với việc thải ra hàng trăm tấn bã sắn mỗi ngày. Đây có thể là vấn nạn
của môi trường nếu không có biện pháp xử lý. Hiện nay, nhờ sự phát triển của
ngành công nghệ sinh học mà nguồn phế liệu này đang có xu hướng trở thành
nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác và ngày càng có nhiều nghiên
cứu tập trung đến vấn đề này. Một số nghiên cứu tiêu biểu như:


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả và Bùi Văn Lợi (2009)[13] đã tiến hành
khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia

để làm thức ăn cho gia súc nhai lại. Kết quả cho thấy ủ chua là biện pháp phù hợp
để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ.
Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) và Nguyễn
Kiều Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội)[10] đã sử
dụng chế phẩm vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi trường Nông
nghiệp cung cấp (thành phần chính gồm xạ khuẩn, nấm men, vi khuẩn với hoạt tính
phân giải cellulose, tinh bột và phân giải phosphatase khó tan), sau đó cho ủ cùng
bã sắn theo phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm các nguyên liệu phụ như rỉ mật,
ure, kali, super lân, vôi bột để làm thức ăn cho gia súc [8].
Trên thế giới, một số nước nhờ sự tiến bộ, phát triển của khoa học công nghệ
sinh học đã ứng dụng các tiềm năng sinh học vào quá trình nâng cao giá trị cho các
phế liệu của ngành nông - công nghiệp như bã sắn, bã cà phê, bã táo ép, bã đậu
nành,.... Một số công trình nghiên cứu điển hình như[13]:
Ashok Pandey và cộng sự (2000) [17] đã ứng dụng các thành tựu của công
nghệ sinh học vào nghiên cứu nâng cao giá trị sử dụng cho các phế liệu của ngành
công nghiệp – nông nghiệp như sử dụng bã sắn, bã đậu, bã cà phê, vỏ khoai tây...
làm cơ chất để thu nhận ethanol, enzyme, hỗn hợp acid, amino acid, sản xuất nấm....
S.Gaewchingduang và P. Pengthemkeerati (2010) [25]đã chỉ ra các biện pháp
xử lý bã sắn nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa thành đường khi thủy phân bã sắn
bằng enzyme và bằng acid. Kết quả cho thấy khi thủy phân bã sắn bằng enzyme thì
xử lý nhiệt ở 1300C trong 30 phút sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi đường, trong khi đối
với thủy phân bằng acid là 1200C trong 60 phút.
Shaktimay Kara và cộng sự (2010) [27] đã công bố điều kiện thích hợp để sản
xuất α-amylase bằng Streptomyces erumpens MTCC 7317 trong môi trường lên
men bán rắn của bã sắn. Kết quả cho thấy rằng, khi nuôi cấy Streptomyces
erumpens MTCC 7317 với tỉ lệ 15% (v/w, 2.5 x 106 CFU/ml) vào môi trường bã


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

sắn ở điều kiện nhiệt độ 500C, độ ẩm 60% trong thời gian 60 giờ và có bổ sung
nguồn nitơ từ cao thịt thì khả năng thu nhận enzyme α-amylase là cao nhất.
Adenise Lorenci Woiciechowski và cộng sự (2002) [15] đã chứng minh rằng
quá trình thủy phân bã sắn bằng việc sử dụng kết hợp acid và enzyme sẽ cho hiệu
quả kinh tế cao hơn là chỉ sử dụng acid hoặc enzyme để thủy phân bã sắn.
Rojan P.John và cộng sự (2006) [24] đã sử dụng Lactobacillus (L.casei và
L.delbrueckii) để thực hiện đồng thời hai quá trình đường hóa và lên men bã sắn để
sản xuất acid lactic.

1.2. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM ASPERGILLUS
1.2.1. Giới thiệu chung[20]
Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, có vách ngăn, không màu, màu nhạt
hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định trên khuẩn lạc. Aspergillus
thuộc nhóm vi nấm, không có chất diệp lục do vậy chúng không thể tổng hợp được
các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ các chất hữu cơ có sẵn trong môi
trường để sinh trưởng và phát triển[5].
Khuẩn ty có vách ngăn, không màu, màu nhạt hoặc trở nâu hay sẫm khác ở các
vùng nhất định của khuẩn lạc. Aspergillus hoàn toàn hiếu khí cũng phát triển mạnh
trong điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tương tự như các loài nấm mốc
nói chung, Aspergillus sinh sản bằng hình thức vô tính đó là cách sinh sản bằng mẩu
sợi một đoạn sợi nấm rơi vào co chất gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ
sợi nấm mới. [23].
Các giống Aspergillus phân bố rất rộng rãi. Chúng có thể được phân lập từ đất,
đậu phộng, thóc, gạo, ngô, sơn, giầy da, giấy, phim ảnh, dược liệu, .... Một số giống
Aspergillus được sử dụng trong công nghiệp lên men, sản xuất enzyme(amylase,
protease,pectinase, ...), các acid hữu cơ (acid citric, acid gluco mic, ...). một số tạo
thành mycotoxin có khả năm gây ung thư (Aspergillus favus, A. parasiticus, A.
versicolor, ...)[30].

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

1.2.2 Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm
Sợi nấm là một ống hình trụ dài, có vách ngăn ngang. Các sợi nấm vừa phát
triển theo chiều dài vừa phân nhánh và vừa tạo thành vách ngăn. Các nhánh lại tiếp
tục phân nhánh liên tiếp. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một tế bào
nấm mốc trên môi trường nuôi cấy hoặc trong một số cơ chất tự nhiên gọi là hệ sợi
nấm [3].
Về nguyên tắc cấu tạo tế bào nấm mốc không khác tế bào vi khuẩn và nấm men,
trong tế bào chất thường tạo thành một số không bào chứa đầy dịch bào. Các chuỗi
tế bào được ngăn cách và nối tiếp nhau tạo thành khuẩn ty. Hệ sợi nấm mốc có một
số sợi ăn dau vào cơ chất gọi là khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt
cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Từ khuẩn ty khí dinh sẽ có một đặc trưng cho màu
sắ của nấm mốc khi già[2].
1.2.3. Hình thái nấm mốc
Giống Aspergillus sinh sản bằng bào từ đính (conidia), đây là hình thức sinh
sản vô tính và bào tử nấm mốc là cơ quan sinh sản chứ không phải là dạng tồn tại
bảo vệ như ở các vi khuẩn. Bào tử đính phát triển từ thành tế bào rất dạy bên trong
hệ sợi nấm gọi là tế bào chân đế. Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra
một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là bọng (túi) xung quanh bọng là một hoặc hai
bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào từ hay thể bình. Từ bộ cuống đính
bào từ ngoài cung, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính. Không có một giống nấm
sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính tương tự[7].
1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT SỐNG
CỦA NẤM ASPERGILLUS
1.3.1 Amylase

1.3.1.1 Giới thiệu chung về amylase
Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước [1].


Khóa luận tốt nghiệp
RR’

+

H-OH

Nguyễn Văn Bách – 11.01
RH

+

R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và
dextrin hạn chế. Các amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong
dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm
men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động
vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo.... Amylase của malt thủy phân tinh bột
lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.
Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công
nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp
thực phẩm[4].
1.3.1.2 Lịch sử phát hiện

Năm 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có
tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 400C đến 600C.
Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết
tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ
tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là amylase). Sau này theo đề nghị
của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase.
Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh
bột thành đường. Sau đó, các amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người
và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan
tâm nghiên cứu.
Năm 1862, Danilevxki đã tách được amylase của tuyến tụy bằng phương
pháp hấp thụ chọn lọc.
Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-amylase là
19000.
Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β-amylase là
250000.
Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó
có 4 enzyme α-amylase.


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel
poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-amylase và
glucoamylase trong canh trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt
lực dextrinase và transglucosilase.
1.3.1.3 Phân loại
Hiện nay, có sáu loại amylase được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme

nội bào ) và exoamylase ( enzyme ngoại bào )[14].
- Endoamylase : gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay αdextrin 6-glucanohydrolase), khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên
trong của chuỗi polysaccharide.
- Exoamylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử
của chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có:
+ β-Amylase
+ glucoamylase ( γ-Amylase).
1.3.2 α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase)
1.3.2.1 Cấu tạo
α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi
khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta
đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại αAmylase là taka-Amylase từ Apergillus oryzae và α-amylase của tụy lợn được
nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về
tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi
mạch acid amin của tất cả các α-amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau[4].


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

1.3.2.2 Cơ chế tác dụng của α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase
có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ
chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả.
α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên
song với tốc độ rất chậm[6].
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn[4]:

+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị
thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ
tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine.
Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase

cho tới disaccharide và

monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh
thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase
luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 ).
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose
và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa
13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra
tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh
trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng,
ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử
thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường αAmylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu
với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất
đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin
hóa hay Amylase dịch hóa[16].


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột + α amylase

dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin

tetra và trimaltose

Amylase

oligosacharide

Maltose

maltotriose

di & monosaccharide
poliglucose
maltotetrose

1.3.2.3 Đặc tính α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein
giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic
acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:
+ α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.

+ Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000
+ Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
+ Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 [11].
Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+,
Hg2+. Một số kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+,
không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase. Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết αamylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain[4].
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương
tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm
sợi tỉ lệ là 1:3,79. α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside
của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh.
Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme α-amylase phân cắt tạo thành
dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác
dụng của Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ αamylase của vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến
glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%[6].
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động
nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50oC và bị vô hoạt ở 70oC. Trong dung dịch đệm
pH 4,7 , α-amylase của Aspergillus oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao,
thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực
đường hóa còn 27 - 85%. Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt
hoàn toàn ( Miller 1959 và cộng sự )[12].
1.3.3. γ-amylase (glucoamylase)

1.3.3.1 Cấu tạo
γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) là những
enzyme có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải
phóng ra ở dạng β. glucoamylase hay γ-amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi
sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc Aspergillus, Penicillium và Rhizopus.
amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động
rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme, nói chung
thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa gốc
cystein [21].
Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động
của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc
đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid
glucose mannose, galactose và glucosamin, các amyloglucosidase chủ yếu được tạo
nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái
rắn và bởi độ bền của chúng. amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở
trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này[4].
1.3.3.2 Cơ chế hoạt động
Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp
lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ
thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết
glucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân,
nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân
nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit[4].

1.3.3.3 Tính chất
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside.
Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách
lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose.
enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase;
glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là enzyme ngoại
bào. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng
thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside[12].
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,
amylopecti , dextrin, panose, iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần
có sự tham gia cuả các loại enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các
polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. Các
polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy
phân khá nhanh, đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5
và nhiệt độ 50oC . Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu,
acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+[4].
1.4 NUÔI CẤY LÊN MEN LỎNG VÀ LÊN MEN XỐP
1.4.1 Lên men lỏng
Nấm sợi được nuôi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh
bột có bổ xung nguồn nitơ vô cơ (NaNO3). Để tạo điều kiện cho nấm sợi sinh
trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ xung thêm vào
môi trường một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô,…
Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn môi trường


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Bách – 11.01

cung cấp ôxy cho nấm sợi phát triển. Để thu nhận enzyme, dịch enzyme được cô

đặc ở nhiệt độ thấp[29].
Ưu điểm của phương pháp:
-

Nấm sợi được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong môi trường, nên bề
mặt xung quanh nấm sợi dễ tiếp xúc với dich dinh dưỡng.

-

Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa.

Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:
-

Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối.

-

Trong quá trình nuôi cấy phải khuấy liên tục

-

Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

-

Cần chọn thành phần môi trường với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới
chất cảm ứng để nấm sợi sinh enzyme ở mức tối đa.

1.4.2 Lên men xốp

Phương pháp này tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển trên bề mặt môi trường.
Nguyên liệu để tạo môi trường chính thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay
nhỏ, tấm gạo… được bổ xung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hật ngũ cốc, mạt cưa,… để
làm tăng độ thoáng khí. Môi trường được bổ xung thêm một số chất dinh dưỡng
khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55-60%. Khử trùng ở
115oC-1,5 atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay nấm sợi vào[11].
Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy nấm sợi bán rắn đem lại hiệu quả cao
hơn, vì nấm sợi là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên môi trường này thi
độ thoáng khí cao. Sản lượng enzyme tạo thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm.
Môi trường không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm vi sinh vật lạ cũng
dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khô, bao quản, dễ vận chuyển và ít tốn hao hoạt
tính enzyme. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzyme tinh
khiết, rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang
thiết bị[25].