Bài giảng các cơ chế điều hòa trao đổi chất ở vi sinh vật (Điều hòa sinh tổng hợp enzyme)

VI SINH THỰC PHẨM
Food microbiology
Chapter 3:
Các cơ chế điều hòa trao đổi chất ở vi sinh vật
(Điều hòa sinh tổng hợp enzyme)


NGUỒN ENZYME


Enzyme từ vi sinh vật

•
•
•

Amylase, protease: Aspergillus oryzae KC, A. oryzae 1476, Bacillus subtilis, …
Pectinase: A. awamori,
Renin (chymosin): Renin từ VSV bền nhiệt hơn (khó bất hoạt hơn), kém về hương
vị và hiệu suất đông. Thể chủ: Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis.

(TLTK: Công nghệ SX enzyme, protein và ứng dụng. GS.TS. Nguyễn Thị Hiền. NXB
GDVN, 2012.)


Nguyên tắc tuyển chọn vi sinh vật
Ở đâu có cơ chất thì ở đó có VSV phân giải cơ chất đó.

•

Tự nhiên: có ưu điểm là hệ gen ổn định. Nhược điểm là năng suất sinh học không cao, chưa

thích nghi sản xuất quy mô công nghiệp.

•

Ngân hàng giống vi sinh vật (Trung tâm giữ giống)

Mục đích
Lựa chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn.

•

Nấm mốc trở thành nguồn vi sinh vật chủ yếu dùng trong sản xuất enzyme.


Sàng tuyển enzyme mới
Giai đoạn 1:

•
•
•
•

Tìm ý tưởng
Xác định sự cần thiết ưu thế thương mại
Đánh giá mức độ tiếp nhận của thị trường
Đầu tư nghiên cứu

Giai đoạn 2:

•

•

Xác định tính chất của enzyme: nhiệt độ, pH cho năng suất tối ưu, độ ổn định,
hằng số động học, khả năng bị ức chế.
Cải tiến


QTCN lên men sản xuất enzyme

Lên men

Tách chiết

Cô đặc

Loại tế bào

Tách chiết

Tinh sạch

Hoàn thiện


QTCN lên men sản xuất enzyme

•
•
•
•

Tổng hợp enzyme
Thu nhận
Tinh sạch
Tạo chế phẩm


Glucoamylase và pectinase từ Aspergillus niger
•
•

Nấm mốc Aspergillus niger được giữ giống trên môi trường Czapek-dox.
Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase gồm: cám gạo 70%, trấu 22%, bã sắn 5%,
acid oleic 3%, nước cất và thành phần khoáng Czapek-dox tạo độ ẩm 50%. Nuôi cấy trong 54h ở nhiệt độ
phòng [3].

•

Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: cám gạo 65,5%, trấu 21,5%, bột cà rốt
11%, (NH4)2SO4 2%, độ ẩm 55%. Nuôi cấy trong 48h ở nhiệt độ phòng [1].

•

Hòa tan môi trường qua nuôi trong nước cất hoặc dung dịch đệm thích hợp (VD. nước cất), tỉ lệ nước cất
và môi trường là 3:1. Chiết lấy dịch lỏng qua vải lọc. Ly tâm dịch qua lọc 4000 vòng/phút trong 10 phút. Thu
dịch sau ly tâm ta được enzyme ở dạng hòa tan.


β-GALACTOSIDASE từ LACTOBACILLUS
ACIDOPHILUS

Thu sinh khối và thu enzyme beta-galactosidase thô

•

Giống VK được hoạt hóa trong môi trường MRS lỏng và được nuôi trong môi trường cảm
ứng sinh beta-galactosidase gồm: lactose (10 g/l), cao nấm men (60 g/l), cao thịt (10 g/l),
Tween 80 (6 g/l), K2HPO4 (3 g/l), KH2PO4 (1 g/l), CH3COONa (3 g/l), MgSO4.7H2O (0,5
g/l), MnSO4(0,15 g/l).

•

Quá trình lên men thựcc hiện trong erlen 500 ml, ở 37oC, pH 6,0, tốc độ lắc 100 vòng/phút
trong 50 giờ.

•

Kết thúc quá trình lên men, ly tâm canh trường 5000 vòng/phút trong 15 phút, ở 4oC thu
nhận sinh khối.


β-GALACTOSIDASE từ LACTOBACILLUS
ACIDOPHILUS
Thu sinh khối và thu enzyme beta-galactosidase thô

•

Rửa sinh khối hai lần bằng dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0. Bảo quản sinh
khối ở -20oC.

•

Beta-galactosidase được thu nhận bằng cách phá vỡ tê bào vi khuẩn bằng phương pháp xử
lý sóng siêu âm dịch huyền phù vi sinh vật 5% w/v trong đệm sodium phosphate pH 7,0,
công suất siêu âm 396kW, thời gian siêu âm 3,2 phút. Dịch huyền phù sau khi xử lý sóng
siêu âm được đem ly tâm ở 6000 vòng/phút, 4oC, 15 phút, để thu dịch enzyme thô.


GIỐNG VI SINH VẬT


1.Yêu cầu về giống vi sinh vật trong CNLM

+ Cho năng suất cao, chất lượng tốt, ít sản phẩm phụ không mong muốn

+ Sử dụng nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền

+ Thời gian lên men ngắn

+ Dễ tách sinh khối hay sản phẩm sau khi lên men


+ Vi sinh vật phải thuần chủng, không chứa vi sinh vật lạ, đặc biệt là không chứa
bacteriophage ký sinh.
+ Chủng vi sinh vật phải khỏe, phát triển nhanh.
+ Có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường.
+ Dễ bảo quản và ổn định các đặc tính sinh lý, sinh hóa trong thời gian sử dụng
+ Có khả năng thay đổi các đặc tính bằng các kỹ thuật đột biến, kỹ thuật gen để không
ngừng nâng cao chất lượng sản phẩm.

2. Nguồn giống vi sinh vật
2.1. Phân lập trong tự nhiên

Để phân lập được chủng vsv ta phải tiến hành làm giàu số lượng tế bào vsv đó trong môi

trường và điều kiện thuận lợi nhất đối với chúng và ức chế các chủng không mong muốn


Quy trình phân lập giống trong tự nhiên:
Thu mẫu

Hòa loãng

Cấy lên môi trường

Nuôi

Thuần khiết

Kiểm tra

Khi hòa loãng đối với vsv dễ chết trong nước cất và nước muối sinh lý thì dùng dung dịch
pepton 0,1%.
Đối với vsv yếm khi khi nuôi phải cho thêm chất khử, gắn paraffin hoặc nuôi trong môi trường
không có oxy.


Click to edit Master text styles
Second level
Third level

Fourth level
Fifth level


2.2. Thu nhận từ trung tâm giữ giống

+ Mỹ: ABBOTT, ATCC, NRRL…
+ Canada: CANAD - 212
+ Nhật: FERM, HIR…
+ Úc: CC
+ Trung Quốc: IMASP
+ Việt Nam: Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (Vietnam Type Culture Collection hay
gọi tắt là VTCC)


3.Cải tạo giống vi sinh vật
*Ưu điểm:
+ Cho năng suất cao
+ Thời gian lên men ngắn ít tạo bọt trong khi lên men
+ Ít tạo sản phẩm phụ trong quá trình lên men
+ tạo đựoc nhiều sản phẩm quý mà chủng khác không có được như insulin, kháng
nguyên Hbs (chống viêm gan B)
+ Khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường cao


3.Cải tạo giống vi sinh vật
*Nhược điểm:

-Yêu cầu kỹ thuật cao
- Trong quá trình sản xuất có thể xuất hiện hiện tượng hồi biến.

* Phương pháp tạo giống mới

+ Đột biến nhân tạo

+ Tái tổ hợp gen: Biến nạp, tiếp hợp, tải nạp.

+ Lựa chọn thường xuyên


4. Giữ giống vi sinh vật

*Ý nghĩa: Giữ được những đặc tính quý (không bị thoái hóa) của vi sinh vật và bảo đảm cung cấp giống
cho các quá trình sản xuất

*Nhiệm vụ của việc giữ giống:

Sử dụng các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vsv có tỷ lệ sống cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và
không bị tạp nhiễm


* Các phương pháp giữ giống:

+ Bảo quản trong môi trường thạch nghiêng và định kỳ cấy chuyển:
0
Bảo quản trong tủ lạnh với hiệt độ 4 – 6 C, thời gian tối đa là 3 tháng

Ưu điểm: Đơn giản được sử dụng phổ biến

Nhược điểm: Thời gian bảo quản ngắn, tính chất của chủng dễ bị thay đổi qua những lần cấy chuyển


+ Giữ giống trong cát hoặc trong đất sét vô trùng

Đất và cát được xử lý để đạt đến độ mịn và vô trung tuyệt đối, sau đó trộn với vi sinh vật và đem bảo quan trong không
gian kín.

Ngoài cát và đất sét người ta còn sử dụng các hạt ngũ cốc hoặc trên silicagen

Phương pháp bảo quản giống này chủ yếu áp dụn cho vsv sinh bào tử như nấm mốc hoặc xạ khuẩn


+Giữ gống bằng phương pháp lạnh đông

Nguyên tắc: Ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện lạnh sâu
(-25--750C)

Các chất bảo quản: Glyxerin 15%
Huyết thanh ngựa
Dung dich glucoza hoặc lactoza 10%
0
Quá trình làm lạnh từ từ: 1-2 C/phút
Thời gian cấy chuyển định kỳ:
0

0

T = -15 đến -20 C: 6 tháng/lần
0

T0 = -30 C : 9 tháng/lần
0
T0 = -40 C: 12 tháng/lần
0
T0 = -50 C: 36 tháng/lần
0
T0 = -70 C: 120 tháng/lần

Phương pháp náy đạt hiệu quả cao và hiện nay được
sử dụng rất phổ biến


+ Giữ giống bằng phương pháp lạnh khô:

Các chất bảo vệ:
Glutamate: 3%
Lactoza: 1,2% + pepton 1,2%
Saccharoza 8% + 5% sữa + 1,5% gelatin

Đây là phương pháp giữ giống tối ưu nhất, có thể giữ giống qua hàng chục năm với tỷ lện sống cao, không bị
biến tính và chiếm ít diện tích bảo quản.

+ Giữ giống bằng ngân hàng gen