Bài thuyết trình phân tích nhóm vitamin, kháng sinh bằng phương pháp sắc kí lỏng (HPLC)

Báo cáo
Phân tích nhóm Vitamin, kháng sinh bằng
phương pháp sắc kí lỏng (HPLC)
Báo cáo viên: Vũ Thị Khắc
Đơn vị: Phòng phân tích và kiểm tra chất lượng sản phẩm
Hà Nội, ngày 28/4/2016


Tổng quan về vitamin và thuốc kháng sinh
•

1. Vitamin

•

Vitamin hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động
chuyển hóa bình thường của cơ thể sinh vật. Có nhiều loại vitamin và chúng khác
nhau về bản chất hóa học lẫn tác dụng sinh lý.

•

Có 2 nhóm vitamin:

Vitamin tan


1. Vitamin
•

Vitamin là những hợp chất hữu cơ rất cần
thiết cho cơ thể, nhưng cơ thể không tự

tổng hợp được, phần lớn phải bổ sung
bằng đường ăn uống. Với liều lượng rất
nhỏ, nhưng vitamin đóng vai trò quan
trọng đối với sự sống của con người: đó là
những chất xúc tác không thể thiếu cho sự
chuyển hóa các chất trong cơ thể, thiếu
vitamin có thể gây ra một số bệnh.

•

Bổ sung vitamin bằng rau củ, thực phẩm
hằng ngày và bằng thực phẩm chức năng,
thuốc.


2. Thuốc kháng sinh
•

Kháng sinh còn được gọi
là Trụ sinh là những chất
có khả năng tiêu diệt vi
khuẩn hay kìm hãm sự
phát triển của vi khuẩn một
cách đặc hiệu. Nó có tác
dụng lên vi khuẩn ở cấp
độ phân tử, thường là một
vị trí quan trọng của vi
khuẩn hay một phản ứng
trong quá trình phát triển
của vi khuẩn.

•

Kháng
nhóm:

sinh

gồm

có 7


Vai trò của thuốc kháng sinh
•

Mục đích tạo ra và sử dụng
các kháng sinh chính là dùng
để kìm hãm và ức chế quá
trình phát triển của các vi
khuẩn, thậm chí là loại bỏ các
vi khuẩn này hoàn toàn. Thông
thường, thì thuốc kháng
sinh có tác dụng lên vi khuẩn
ở cấp độ phân tử, thường là
một vị trí quan trọng của vi
khuẩn hay một phản ứng trong
quá trình phát triển của vi
khuẩn.

•

Thuốc kháng sinh có tác dụng
điều trị bệnh nhưng nếu dùng
không đúng cách ( quá liều
lượng, lạm dụng, không đúng
loại) sẽ trở thành nguy hại cho
sức khỏe của chính người sử
dụng thuốc.


Nhu cầu phân tích xác định hàm lượng vitamin, kháng sinh


2. Phương pháp phân tích sắc kí lỏng ( HPLC)
Khái


• Nguyên tắc: HPLC được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy một lượng chất lỏng dưới áp suất cao và
hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được nhồi đầy một loại chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc
tách các thành phần của mẫu. Chất hấp phụ – được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica, polymers)
với kích thước từ 2 – 50 µm. Các thành phần trong hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức
độ tương tác khác nhau với các hạt chất hấp phụ. Dòng chất lỏng dưới áp suất cao thường là hỗn hợp
của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được gọi là “pha động”. Thành phần và nhiệt
độ dung môi đóng vai trò chính trong quá trình tách chất do tương tác xảy ra giữa các thành phần của
mẫu và chất hấp phụ. Về bản chất, các tương tác này là tương tác vật lý như tương tác kị nước (phân
tán), tương tác lưỡng cực và tương tác ion, thông thường nhất là tổng hợp của tất cả các tương tác trên.


Các vitamin được phân tích xác định bằng HPLC

Xác định hàm lượng
Vitamin bằng phương
pháp HPLC :
B1, B2, B3, PP, B5, B6,
C, A, D, E, K

Phân bón

B1 0,3 mg/kg
B2 0,3 mg/kg
B3 0,3 mg/kg
PP 0,3 mg/kg
B5 0,3 mg/kg
B6 0,3 mg/kg
C 0,1 µg/kg
A 0,3 mg/kg
D 0,3 mg/kg
E 1,0 mg/kg
K 0,5 mg/kg

Xác định hàm lượng
Vitamin bằng phương
pháp HPLC:
B1, B2, B3, PP, B5, B6,
C, A, D, E, K

Thuốc thú y.

115. Xác định hàm
B1 0,3 mg/kg

B2 0,3 mg/kg
B3 0,3 mg/kg
PP 0,3 mg/kg
B5 0,3 mg/kg
B6 0,3 mg/kg
C 0,1 mcg/kg
A 0,3 mg/kg
D 0,3 mg/kg
E 1,0 mg/kg
K 0,5 mg/kg

Xác định hàm lượng
Aflatoxin B1,B2,G1,G2
bằng phương pháp
HPLC:

Thức ăn chăn
nuôi

Aflatoxin B1 0,13 µg/kg
Aflatoxin B2 0,12 µg/kg
Aflatoxin G1 0,09 µg/kg
Aflatoxin G2 0,15 µg/kg

l31ku010
HPLC

l31ku010
HPLC

Ref.BAKERBOND
Application; AOAC
990.33
AOAC 986.16
CASE.SK.0018
HPLC


Các loại kháng sinh được phân tích bằng HPLC
Sulfamethoxazole
Sulfaquinoxaline
Erythromycine
Lincomycine
Ormetoprim
Spiramycin
Josamycin
Tiamuline HF
Trimethoprim
Tylosin
Amoxicilline
Ampicilline
Cloxacilline
Penicilline
Chloramphenicol
Florfenicol
Thiamphenicol

Thức ăn chăn
nuôi

Sulfamethoxazole 0,2 mg/kg
Sulfaquinoxaline 0,2 mg/kg
Erythromycine 2,5 mg/kg
Lincomycine 0,5 mg/kg
Ormetoprim 0,25 mg/kg
Spiramycin 0,5 mg/kg
Josamycin 0,5 mg/kg
Tiamuline HF 1,0 mg/kg
Trimethoprim 0,5 mg/kg
Tylosin 0,5 mg/kg
Amoxicilline 0,5 mg/kg
Ampicilline 0,5 mg/kg
Cloxacilline 1,0 mg/kg
Penicilline 0,5 mg/kg
Chloramphenicol 0,25 mg/kg
Florfenicol 1,0 mg/kg
Thiamphenicol 1,0 mg/kg

Họ Tetracylines :
Chlortetracyline,
Doxycyline,
Oxytetracyline,
Tetracyline
Họ (Fluoro)
Quinolones :
Ciprofloxacine,
Danofloxacine,
Difloxacine,
Flumequine,
Norfloxacine,

Ofloxacine, Oxolinic acid.
Họ Sulfonamines Sulfadiazine,
Sulfadimidine,
Sulfaguanidine,
Sulfamethoxazole,Sulfaquinoxaline
Họ Marcrolides :
Erythromycine,
Lincomicine,
Ormetoprim,
Spiramycine, Josamycin
Họ Beta-Lactams :
Tiamuline HF,
Trimethoprim, Tylosin ,
Amoxicilline,
Ampicilline,
Cloxacilline, Penicilline.
Họ Amphenicols :
Chloramphenicol,florfenicol,thiamphenicol

Thuốc thú y,
Thuốc thú y
thủy sản

Chlortetracycline 0,25 mg/kg
Doxycycline 0,25 mg/kg
Oxytetracycline 0,25 mg/kg
Tetracycline 0,25 mg/kg
Ciprofloxacine 0,25 mg/ g
Danofloxacine 0,25 mg/kg
Difloxacine 0,25 mg/kg

Flumequine 0,25 mg/kg
Norfloxacine 0,25 mg/kg
Ofloxacine 0,25 mg/kg
Oxolinic acid 0,25 mg/kg
Sulfadiazine 0,2 mg/kg
Sulfadimidine 0,2 mg/kg
Sulfaguanidine 0,2 mg/kg
Sulfamethoxazole 0,2 mg/kg
Sulfaquinoxaline 0,2 mg/kg
Erythromycine 2,5 mg/kg
Lincomycine 0,5 mg/kg
Ormetoprim 0,25 mg/kg
Spiramycin 0,5 mg/kg
Josamycin 0,5 mg/kg
Tiamuline 1,0 mg/kg
Trimethoprim 0,5 mg/kg
Tylosin 0,5 mg/kg
Amoxicilline 0,5 mg/kg
Ampicilline 0,5 mg/kg
Cloxacilline 1,0 mg/kg
Penicilline 0,5 mg/kg
Chloramphenicol 0,25 mg/kg
Florfenicol 1,00 mg/kg
Thiamphenicol 1,00 mg/kg

l32hu010
HPLC

Ref. HPLC-USP29
NF24 2006; MN –

Reversed phase HPLC
Application Guide
l32hu010 HPLC


Phân tích Vitamin tan trong nước bằng phương
pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
•

Sử dụng sắc ký pha đảo với pha
động phân cực, pha tĩnh kém
phân cực.

•

Nguyên tắc: Pha động sau khi
được bài khí được bơm đưa vào
hệ thống sắc ký. Thực nghiệm
viên tự bơm mẫu vào. Pha động
khi đi ngang qua sẽ cuốn mẫu
phân tích đi theo. Khi vào trong
cột sắc ký, chất nào có ái lực
mạnh với pha động sẽ theo pha
động đi ra trước, chất nào có ái
lực yếu hơn sẽ đi ra sau. Đầu dò
phát hiện các cấu tử đi ra khỏi
cột, chuyển tín hiệu cho máy ghi
kết quả.

• Hệ thống thiết bị

Các bước tiến hành
Chuẩn


Một số lưu ý
• Việc thực hiện phân tích các Vitamin cần tuân
theo các yêu cầu bảo đảm không bị thất thoát
hay sai số hàm lượng Vitamin do một số loại
Vitamin rất dễ bay hơi, hoặc biến tính do tác
động của ánh sáng, nhiệt độ: Vitamin C dễ bay
hơi khi có ánh sáng,…
• Cần thực hiện nghiêm ngặt QA/QC trong phân
tích để đảm bảo số liệu đo đạc được chính xác
nhất.


Phân tích Kháng sinh trong nước bằng phương pháp sắc
kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan
ngại của hầu hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế
giới. Một số kháng sinh bản thân nó có thể gây ra tác động có
hại cho sức khỏe người tiêu dùng (chloramphenicol,
malachite green…), một số loại khác như các kháng sinh
nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể
động vật có thể sinh ra những hợp chất có đọc tính cao đối
với cơ thể sống. Chính vì vậy, những kháng sinh này bị cấm
sử dụng hoàn toàn trong nuôi trồng vào bảo quản thực phẩm.
• Phân tích dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm và

thức ăn chăn nuôi chính là nhằm mục đích quản lý và kiểm
soát chất lượng sản phẩm an toàn cho người và gia súc sử
dụng.


Phương pháp định lượng Sulfonamit trong sản phẩm thủy sản bằng
sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Đối tượng: Phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất sulfonamit
gồm: sulfadiazine, sulfothiazole, sulfamethazine,
sulfamethoxypiridazine, sulfacloropyridazine, sulfadoxine,
sulfamethoxazoll, sulfadimethoxine, sulfachinoxaline.
• Nguyên tắc: các chất sulfonamit có trong mẫu sản phẩm được chiết
tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclorometan. Dịch chiết sau khi cô
cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamine để tạo dẫn suất
huỳnh quang. Hàm lượng dẫn suất được xác định trên hệ thống
HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.


Phương pháp định lượng Sulfonamit trong sản phẩm thủy sản bằng sắc kí
lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Thiết


Cách tiến hành
654321-


Một số lưu ý
•

Dư lượng thuốc kháng sinh có
trong thức ăn chăn nuôi, thuốc
thú ý có hàm lượng rất nhỏ, vì
vậy cần đảm bảo quy trình
phân tích tuân thủ nghiêm
ngặt yêu cầu kỹ thuật, QA/QC
để đảm bảo số liệu phân tích
chính xác.

•

Công tác bảo hộ lao động
cũng cần chú ý thực hiện để
đảm bảo an toàn sức khỏe
của thử nghiệm viên.


TRÂN TRỌNG CẢM ƠN!!!