Xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid trong thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC MS MS))

BỘ Y TẾ


TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI






LÊ THỊ QUỲNH MAI


XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG
SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG
THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
( LC – MS/MS )


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ








HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI







LÊ THỊ QUỲNH MAI


XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG
SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG
THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
( LC – MS/MS )

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. ThS. Đỗ Thị Thanh Thƣơng
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI - 2015


i



em 

n ng dn cho em trong suc
hi n.
 o Vin kim nghi
v sinh thc phm Quc G Hng Hu ki

             












14 








ii

MC LC


 i
MC LC ii
DANH MHI VIT TT v
DANH MNG vii
T V 1
 3
1.1. Tng quan vaminoglycosid 3
1.1.1.  3
1.1.2.  3
1.1.3. t 5
1.1.4.  dit khun ca aminoglycosid 5
1.1.5. Ph ng 5
1.1.6. n 6

1.2. Gii hng t 6
1.3. nh aminoglycosid 7
1.3.1. n dch quang hc (Optical Imunobiosensor) 7
1.3.2. n di mao qun (capillary electrophoresis  CE) 7
1.3.3. Sng hi (HPLC) 8
1.3.4. Sng khi ph (LC - MS, LC - MS/MS) 9
1.4. Tc v sng khi ph 10
1.4.1. Sng hi 11
1.4.2. Khi ph (Mass spectrometry) 12
U 16
2.1. i u 16
2.2. t liu  trang thit b 16
2.2.1. t liu 16
2.2.2. Dng c 18
2.3. Nu 18
iii

2.3.1. Kh 18
2.3.2. Th 18
2.3.3. ng d 18
2.4. u 18
2.4.1.  u 18
2.4.2. oglycosid 20
2.4.3.  20
2.4.3.1. c hiu /chn lc 20
2.4.3.2. Gii hn (LOD), Gii hng (LOQ) 21
2.4.3.3. Khong tuyng chun 21
2.4.3.4.  lp l thu hi 22
2.4.4.   liu 22
T QU O LUN 23

3.1. Kh 23
3.1.1. Khu kin khi ph 23
3.1.1.1. Khu kin bi vi ion m 23
3.1.1.2. Khu kin b 24
3.1.2. u kin sng 24
3.1.2.1. Ch 24
3.1.2.2. Chng 25
3.1.2.3. Kh ng 27
3.1.3. Kh u tht 28
3.1.3.1. Ch u 28
3.1.3.2. Kh m chit 29
3.1.3.3. Khdch chit 31
3.1.3.4. Kht chit pha rn SPE cho mu tht 31
3.1.3.5. Kha gii 32
3.1.3.6. Kh a gii 33
3.2. Th 36
3.2.1. c hiu / chn lc 36
3.2.2. nh khong tuy 38
iv

3.2.3.  lp l thu hi 39
3.2.4. Gii hi hng 41
3.2.5. n 41
3.3. u thc t 42
KT LUN NGH 43
Kt lun 43
Kin ngh 44
U THAM KHO
PH LC

v

DANH M VIT TT
u
Ting anh
Ting vit
AOAC
Association of Official Analytical
Community
Hip hi c
c
APCI
Atmospheric pressure chemical
ionization
Ch   t
n
CAD

Collision Gas Pressure

CE
Collision Energy
ng b
CUR
Curtain Gas

CV
Coefficient of Variation
H s bi
CXP
Collision Cell Exit Potential
Th u ra
DP
Declustering Potential
Th 
DHS
Dihydrostreptomycin

ESI
Electrospray ionization
n t
GS1
Ion Source Gas 1
Ngu
GS2
Ion Source Gas 2
Ngu
HPLC

High performance
liquidchromatography
Sng hi
IS
Ionspray Voltage
Th phun ion
LC-
MS/MS
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry
Si ph
hai ln
LOD
Limit of detection
Gii hn
vi

LOQ
Limit of quantification
Gii hng
MRL
Maximum Residue Limit
Gii hng t
MS
Mass spectrometry
Khi ph
R(%)
Recovery
Hiu sut thu hi
SPE
Solid phase extraction
Chit pha rn
SD
Standard Deviation
 lch chun
TEM
Ion source Temperature
Nhi ngun
vii

DANH MNG

Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh nhóm aminoglycosid 4
Bảng 1.2: Mức giới hạn dư lượng tối đa của một số aminoglycosid 7
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu dùng phương pháp HPLC xác định
aminoglycosid 8
Bảng 1.4: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân
tích kháng sinh aminoglycosid 9
Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 23
Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ 23
Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá các ion con của aminoglycosid 24
Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 25
Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 25
Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 26
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của hệ pha động đến thời gian lưu và diện tích pic 26
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu và diện tích pic 27
Bảng 3.9: Chương trình chạy gradient tối ưu 28
Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết 30
Bảng 3.11: Khảo sát pH dịch chiết 31
Bảng 3.12: Khảo sát loại cột chiết pha rắn SPE cho mẫu thịt 32
Bảng 3.13: Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải 33
Bảng 3.14: Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 34
Bảng 3.15: Ion mẹ và ion con của một số aminoglycosid 36
Bảng 3.16: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ streptomycin 38
Bảng 3.17: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định streptomycin
trong thịt 40
Bảng 3.18: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định
dihydrostreptomycin trong thịt 40
viii

Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định gentamicin
trong thịt 40
Bảng 3.20: Kết quả phân tích mẫu thực tế 42

ix


DANH M TH
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử một số aminoglycosid 4
Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khối phổ 13
Hình 1.3: Bộ nguồn ion hóa ESI 14
Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực chập ba 15
Hình 2.1: Các bước của quy trình chiết pha rắn 19
Hình 3.1:Quy trình xử lý mẫu thịt 29
Hình 3.2: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất thu
hồi 30
Hình 3.3: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi 31
Hình 3.4: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của cột chiết đến hiệu suất thu hồi 32
Hình 3.5: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi rửa giải đến hiệu
suất thu hồi 33
Hình 3.6: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích dung môi rửa giải đến
hiệu suất thu hồi 34
Hình 3.7: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 35
Hình 3.8: Sắc đồ mẫu trắng 36
Hình 3.9: Sắc đồ mẫu chuẩn 50 ppb và mẫu trắng thêm chuẩn streptomycin 37
Hình 3.10: Sắc đồ mẫu chuẩn 50 ppb và mẫu trắng thêm chuẩn
dihydrostreptomycin 37
Hình 3.11: Sắc đồ mẫu chuẩn 50 ppb và mẫu trắng thêm chuẩn gentamicin 37
Hình 3.12: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

streptomycin 38
Hình 3.13: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
dihydrostreptomycin 39
Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
gentamicin 39

1
T VN 

Ac phmt v m quan trng ln v mt i
c s n c gii.
T nhi, s tn ti ca 
cm  t v  ng c n sc
khi c phm
.
K c s dng  a b
  ng ca vc lm dng
thu
trng ti sc khi, dn ti ng kh
ng, phn  c aminoglycosid t
c s dng r u tr nh
nhin hong [28]. Vic 
c hi thc khi xudn ti vic
i khng sinh kh v ttrong tht
m. t s p th tn
n ti ng bt li cho sc khe. 
Trung Quc, M, Nht Bn t s quc gia 
ng (MRL) ca aminoglycosid trong i thc
phm n gc ng vt  [28].
T u v qu  mn 

     y   nhy    ki   ng
aminoglycosid loi mu thc phm cn kinh.
Xu nhu cu thc t nhc u vit ca k thut LC -
MS/MS trong  t t dng vthc
2
hi   Xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid
trong thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC -
MS/MS)c 
1. ng ng mt s 
aminoglycosid trong tht bng LC - MS/MS.
2. t s mu thc t.

3

1.1. Tng quan vaminoglycosid
1.1.1. 
  lycosid, hay aminosid     
              

 Streptomyces griseus [24], [8].      c
neomycin t Streptomyces fradiae [8], [25]; ti   ycin t
Streptomyces kanamyceticus  [8], [16]. Gentamip
t x khun Micromonospora purpurea  [9], [21]. Sisomicin c
p t  Micromonospora [8], [23]. c p t
Streptomyces tenebrarius  [15] t dn xung
hp cc   [13].
1.1.2. 
n:
phng.
- Phn Genin:  OH  v c 1,4

  n cht 1,3 - diaminocyclitol hoc 1,4 -
diaminocyclitol) [2], [9].   n l   
ph    -       
streptamin, deoxy - 2 - ng 1.1).
- Ph :   ng amin 6 hoc 5 c   -
glucosaminneosamin, L - streptose, D - [2], [14].
C c th c 
i .
4












Hình 1.1: Cấu trúc phân tử một số aminoglycosid
Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh nhóm aminoglycosid

Diamino -1,3- cyclitol
Diamino -
1,4-cyclitol
Genin
Streptamin
Streptidin

Deoxy  2 - streptamin
Fortamin



Spectinomycin
Streptomycin

Neomycin
Framycetin
Paromomycin
Lividomycin
Ribostamycin
Butirosin

Kanamycin
Gentamicin
Tobramycin
Sisomycin


Apramycin
Fortamin A




Dihydro
streptomycin

Amikacin
Dibekacin
Netilmycin





Dihydrostreptomycin
: C
21
H
41
N
7
O
12


Streptomycin
: C
21
H
39
N
7
O
12

Gentamicin
: C
19-21
H
39-41
N
5
O
7

5
1.1.3. t
 Streptomycin 
n phy c
 nhau.
- Tinh th  ng, rc
- Bn  pH 6  8, b thm trong pH acid
- h
 Gentamicin:
- Bt km, r

- Bn trong pH acid
- o mui tan vi acid
1.1.4.  dit khun ca aminoglycosid
Aminoglycosid g     30S c   n dng
ribosom, ng hp protein ca vi khu
 Cn tr vic tc hp khu
  ti  sp x

t qu a t t
n b t.
 Chuy   mt ribosom tip cn
vi s t dc theo s tng hp chui
peptid mi [4].
1.1.5. Ph ng
ng hn ch n Gr (+),
   u tr nhim khun Gr (-) hi    ng bao
gm: Serratia spp, Proteus spp, Klebsiella spp, Enterobacter spp, E.Coli,
Acinetobacter spp, Providencia spp, Flavobacter spp [4], [26].
6
1.1.6. n
- 
Bao g [17], [18]. 
riu cht kh m nhn s cao.
 tiu, buu, mt
ng [9]. i phc
i s  m th  [18], [19].
- n:
Do s  li ca aminoglycosid   n gn.
Triu chng: gim sc lc cu thn, protein nit thanh;
hoi t ng thn cp, git (p) [14].
- Chn dn truyn th
 c ch ging
thi gim s nhy cm  hi vi cht dn truyn
dn truyn th [14].
1.2. Gii hng t
Tc, sinh hi s dng
ng mc c chuy
con vi h tng.

Gii h ng t   ng cao nht ca mt loi i
ng c th p nhn cho n t
v   i s d
v.
nh s  - BYT ca B ng B Y t v 
nh gii hn tm sinh hc trong thc ph, m
ng t     c ph i vi mt s   
aminoglycosid [3] nh  bng 1.2:
7
Bảng 1.2: Mức giới hạn dư lượng tối đa của một số aminoglycosid
trong thực phẩm
STT
Aminoglycosid
ng
MRL (g/kg)
1



Dihydrostreptomycin/
streptomycin
Th
600
Th
1000
S
200
Tht ln
600
Gan ln

600
Thn ln
1000
M ln
600
2
Gentamicin
Th
100

2000
Sg/l)
200
Tht ln
100
Gan ln
2000
Thn ln
5000
M ln
100

1.3. nh aminoglycosid
1.3.1.  min dch quang hc (Optical Imunobiosensor)
 min dch quang hc hong d
- . G. Baxter ng s ng dng  nh
ng streptomycin trong sa [11].
1.3.2. in di mao qun (capillary electrophoresis  CE)
ng s [22]  dn di mao qun
trong vi trng. 

u s dng dung dm gm 30 mM natri dihydrophosphat,
8
5 mM acid     natri tetraborat   dng acetonitril  
u chnh.
1.3.3. Sng hi (HPLC)
t trong nhng k thu bin nh
d u nn m
p thu bc x  - Vis rt
       dng v     ng
trong thc ph u phi thc hin to dn xunh
n bng detector hu  nhy.
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu dùng phương pháp HPLC xác định
aminoglycosid
TL
TK
Nn mu kih

[9]
Nn mu: Tht ln
 u kin s
- Ct C
18

- A: 93 % 10 mM natri 1 - pentan -
sulfonat trong 0,4 mM acid 1,2 
naphthoquinon  4 - sulfonic
- B: 7 % Acetonitril
- T : 1 ml/ 
- : 356 nm
- Bc : 439 nm

- Streptomycin:
 LOD : 0,1 ppm
 LOQ : 0,35 ppm
  thu hi :
80 - 81,5 %
- Dihydrostreptomycin:
 LOD : 0,15 ppm
 LOQ : 0,5 ppm
  thu hi :
79,6 - 84,4 %
[12]
Nn mu: Sa
 u kin s
- ng: 0,8 g acid 1,2 - naphthoquinon
- 4 - sulfonic trong 880 ml natri hexan - 1
- sulfonic 0,01 M
 LOD :
Streptomycin (8 
Dihydrostreptomycin
(12 
  thu hi :
9
- T 0,5 ml/ ph
-  nm
- : 435 nm
84 - 92 %


1.3.4. Sng khi ph (LC - MS, LC - MS/MS)
 nh c hip cho vii

p thu UV - 
k thut LC -  - c nhiu u s dng 
osid (bng 1.4).
Bảng 1.4: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để
phân tích kháng sinh aminoglycosid
TL
TK
Nn
mu

chit
ng
SPE
K
thut

thu
hi
(%)
LOD,
LOQ
[26]

ng
vt
2 % acid
percloric,
0,4 mM
Na
2

EDTA, 10
mM KH
2
PO
4

ACN/ H
2
O 
50 mM HFBA
Oasis
WCX
HPLC -
MS/MS
70
-
107
- LOD:
0,2  2
ng/g
- LOQ:
0,1 -
0,5
mg/kg
[26]
Sa

2,9 % acid
perchloric,
0,6 mM

Na
2
EDTA, 15
mM KH
2
PO
4

ACN/ H
2
O 
50 mM HFBA
Oasis
WCX
HPLC -
MS/MS
113
-
139
LOQ:
0,01 -
0,1
mg/kg
[20]
Sa
10 mM
NH
4
OCOCH
3

/
0,4 mM
Na
2
EDTA/1 %
NaCl/2 %TCA
20 mM
HFBA/H
2
O 
20 mM
HFBA/ACN
Oasis
HLB
UPLC/
MS/MS
77,7
-
93,4

10
[7]
Sa
5 % acid
trichloroacetic,
0,6 mM
Na
2
EDTA, 15
mM KH

2
PO
4

H
2
O : ACN
(950 : 50),
20 mM HFBA 
ACN : H
2
O
(800 : 200)
20 mM HFBA
Plexa
LC -
MS/MS
67
-
107

[6]
Tht

10 ml acid
trichloroacetic
5 %
H
2
O : ACN

(950 : 50),
20mM HFBA
- ACN : H
2
O
(800 : 200),
20 mM HFBA
Plexa
LC -
MS/MS
71
-
93,3

[27]
Mt
ong
15 ml acid
trichloroacetic
5 %
H
2
O : ACN
(950 : 50),
20 mM HFBA
- ACN : H
2
O
(500 : 500),
20 mM HFBA

Oasis
HLB
LC -
MS/MS
72
-
116

[27]
Bu
dc
ln
10 ml acid
trichloroacetic
5 %
H2O : ACN
(950 : 50),
20 mM HFBA
- ACN : H2O
(500 : 500),
20 mM HFBA
Oasis
HLB
LC-
MS/MS
81
-
98

[10]


20 m
phosphat
H
2
O, HCOOH
0,05 % - ACN,
HCOOH 0,05 %
Polymeric
LC-
MS/MS
101

105
LOQ:
2 

1.4. Tng quan c v sng khi ph
Sng khi ph (LC   thu kt
ni gia sng hi thit b khi ph (MS).
11
 nghii ta mi kt
n   a s chm tr   
 k thut l th 
ci ph. K t n nay sng khi ph 
tric tm quan trng c
i ph n l nh c hiu cao. Gii hn
 n 10
-14
gam. Do vi ph 

dng r c khoa h  
ng vc cu t
dch sinh hn phn gc t c bi
 ng vt trong mn phc tp [28].
1.4.1. Sng hi
St rn
   t l      n qua ct, t  di
chuyi ca cht v
pha n qua ct cn
u ch ra gii thi gian h [1].
- 
 t nhi cm v n hp gm
nhit rn xc nh - 10
   c ch to t c
t silica. 
bn chi:
 S m
glycol             n-hexan,
toluen, iso propyl ether. Trong s n chc nht
12
c ra gi c cng, th
gim dn.
 So: pc.
Trong sc nhc ra gi
 c cng th [1].
- ng trong HPLC
a gii ct s
     c hn h  l nht
nh. Trong sc
: n - hexan, benzen, chloroform Trong s

         ay hn hp ca
 [1].
- Detector trong HPLC
 phn  
a ri ra khi ct si chetector s 
t vi nnh
n trong m
cng cht c c la ch 
nhng chng vi detector. c s
dng trong HPLC: hp th UV-Vis, hunh quang,  dn.
1.4.2. Khi ph (Mass spectrometry)
Khi ph t b  nh kh
t cp chc bng vic  theo t s gia khi
c tng ion
c gia t b n detector.
ng v c th hin bng mt s v
 p h kh
13
(kh, nhn dnh cng
t [1].
Cu to ca thit b khi ph gm 3 ph n ion, thit b


Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khối phổ
- Ngun ion
i ph   mu
 trot s k thuc s dng trong s
lng khi phn tu
 dng k thun (ESI).
 n t (ESI)

 ra khi ct s
t ng mao qun bng kim loi cao th (3  5 kVc phun
mn b
2
ng mao qung cn
th  tt nhuy u ng
mao qu  nh
dnc t phn

2
  do m
Ngun ion

khi
Detector
X 
gi s liu


H c