Nghiên cứu những biến đổi di truyền (nhiễm sắc thể) ở các đối t ợng bị ảnh h ởng do phơi nhiễm với chất độc hóa học trong chiến tranh và các thế hệ tiếp theo (f1, f2) của họ

bộ y tế

chơng trình 33

trờng đại học y hà nội

báo cáo
tổng kết đề tài nhánh
Nghiên cứu những biến đổi di truyền (nhiễm sắc thể) ở các
đối tợng bị ảnh hởng do phơi nhiễm với chất độc hóa học
trong chiến tranh và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của họ.
CHủ NHIệM Đề TàI NHáNH: Gs. Trịnh Văn Bảo

thuộc đề tài cấp nhà nớc:
nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn Dịch,
sinh hoá, huyết học và tồn lu dioxin
trên các đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao.
chủ nhiệm đề tài: pgs.ts Nguyễn văn Tờng
CƠ QUAN CHủ QUảN: bộ Y Tế
cơ quan CHủ TRì : TRƯờNG ĐạI HọC Y Hµ NéI

hµ néi – 2003

5462-1
13/10/2005

0


đặt vấn đề
Trong cuộc chiến tranh ở Việt Nam, quân ®éi Mü ®· sư dơng c¸c chÊt

®éc ho¸ häc, trong đó chủ yếu là các chất diệt cỏ và làm rụng lá. Chất độc
hoá học đà sử dụng từ năm 1961 đến năm 1972 trong chiến dịch Ranch
Hand. Trong thời gian này hơn 70.720m3 chất diệt cỏ và làm rụng lá đÃ
đợc rải xuống miền Nam Việt Nam với tổng diện tích bị rải chiếm 10%
tổng diện tích miền Nam Việt Nam. Khoảng 15 loại hoá chất đà đợc dùng
trong ®ã cã h¬n 42 triƯu lÝt chÊt da cam. Trong chÊt da cam, ngoµi 2,4 - D
vµ 2,4,5 - T là hai thành phần chính, còn có tạp chất 2,3,7,8 - tetrachloro
dibenzo paradioxin còn gọi tắt là dioxin. Dioxin là một chất cực độc. Tổng
lợng dioxin đà rải xuống miền Nam Việt Nam theo số liệu trớc đây
khoảng 170 kg trong chiến dịch Ranch Hand; theo công bố mới đây nhất,
lợng Dioxin có thể cao hơn 2 4 lần so với công bố trớc đây [26] .
Hai cuộc hội thảo quốc tế về nhiều vấn đề khác nhau liên quan với
chất diệt cỏ, làm rụng lá và dioxin đà đợc tổ chức ở thành phố Hồ Chí
Minh (1983) và ở Hà Nội (1993). Hội nghị khoa học Việt Mỹ về chất da
cam / dioxin dà đợc tổ chức vào tháng 3 năm 2002.
Ngay từ những ngày đầu khi quân đội Mỹ sử dụng chiến tranh hoá
học, một số nhà khoa học Việt Nam đà nghiên cứu đánh giá tác hại của
cuộc chiến tranh này. Uỷ ban 10/80 trớc đây và Uỷ ban 33 hiện nay đà và
đang tiến hành các cuộc điều tra về hậu quả và nghiên cứu các biện pháp để
khắc phục hậu quả của cuộc chiến tranh hoá học này.
Trong các nghiên cứu đánh giá tác hại của chất độc, đánh giá đột biến
nhiễm sắc thể là một trong các nghiên cứu sớm nhất. Tôn Thất Tùng và
Bạch Quốc Tuyên là những ngời Việt Nam nghiên cứu sớm nhất về vấn đề
này và đà có những nhận xét khoa học rất có giá trị. Thời gian sau đó, một
số tác giả Việt Nam cũng nh nớc ngoài đà tiếp tục nghiên cứu vấn đề này.
Kể từ khi quân đội Mỹ ngừng rải chất độc hoá học ở miền Nam Việt Nam
cho đến nay đà hơn 30 năm. Cho đến nay ý kiến của các nhà khoa học về
vấn đề độc học gen (genotoxic effect) còn cha thèng nhÊt.

1

Với nhận thức: Việt Nam đà và đang chịu ảnh hởng nặng nề của
cuộc chiến tranh hoá học do quân đội Mỹ thực hiện, các nghiên cứu kỹ càng
và đồng bộ nhiều mặt tác hại và hậu quả của cuộc chiến tranh đó để có
những nhận xét, kết luận thực tế ở Việt Nam nhằm chăm sóc, bảo vệ sức
khoẻ cộng đồng. Trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nớc "Nghiên cứu các
biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hóa, huyết học và tồn lu dioxin
trên các đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao" đề tài nhánh "Nghiên cứu
các biến đổi về mặt di truyền.." đợc thực hiện với mục tiêu sau:
1. Xác định tần số các dạng đột biến nhiễm sắc thể ở nhóm chứng và
nhóm phơi nhiễm.
2. Xác định tần số trao đổi chromatid chị em ở nhóm chứng và nhóm
phơi nhiễm.
3. Xác định bộ nhiễm sắc thể ở một số đối tợng bị dị tËt bÈm sinh.

2


I. tổng quan tài liệu
1.1. Tác nhân gây đột biến.
Các tác nhân trong môi trờng bao gồm các tác nhân môi trờng vĩ
mô và tác nhân môi trờng vi mô. Sự ô nhiễm của môi trờng toàn cầu hay
ở từng địa phơng với những tác nhân vật lý, hoá học, sinh học khác nhau
cũng nh những bất thờng tinh vi trong quá trình chuyển hoá vật chất trong
cơ thể, trong tế bào đều có thể dẫn đến những bất thờng của cơ thể. Sự trả
lời của cơ thể đối với những thay đổi đó trong đa số trờng hợp là sự thích
nghi để tồn tại và phát triển, nhng trong nhiều trờng hợp cơ thể không
thích nghi đợc và những bất thờng của cơ thể xuất hiện trong đó có những
bất thờng của tế bào:

- Tế bào bị chết.
- Vật chất di truyền trong tế bào bị biến đổi từ đó dẫn đến những tế
bào bị đột biến.
Có thể xếp các tác nhân độc hại trong môi trờng thành ba nhóm:
- Nhóm các tác nhân gây đột biến (Mutagens): Gây biến đổi vật liệu
di truyền ở mức độ nhiễm sắc thể hoặc mức độ gen.
- Nhóm các tác nhân gây ung th (Carcinogens): Gây những biến đổi
trong tế bào dẫn đến sự xuất hiện tế bào ung th.
- Nhóm các tác nhân gây quái thai (teratogens): Tác động vào tế bào
trong các giai đoạn phát triển phôi thai dẫn đến các phôi thai dị dạng.
Đặc điểm và tính chất của các chất gây đột biến.
- Các chất gây đột biến có thể có bản chất là những tác nhân vật lý,
tác nhân hoá học hoặc các tác nhân sinh học. Danh mục các tác nhân gây
đột biến càng ngày càng đợc bổ sung. Đặc điểm chung của các chất gây
đột biến là có khả năng gây tăng sinh các gốc tự do trong tế bào. Một đích
quan trọng của các gèc tù do lµ ADN cđa tÕ bµo.

3


- Các chất gây đột biến có thể tác động đến tế bào sinh dỡng (soma)
hoặc tế bào sinh dục (germ lines). Những đột biến ở tế bào sinh dỡng chỉ
tồn tại trong đời cá thể bị đột biến, còn những đột biến ở tế bào sinh dục có
thể di truyền cho các thế hệ tiếp theo.
- Đột biến ở tÕ bµo sinh d−ìng hay tÕ bµo sinh dơc cã thể là những
đột biến gen hoặc những đột biến nhiễm sắc thể. Những đột biến đó có thể
là những đột biến ở từng gen, từng nhiễm sắc thể riêng biệt nh−ng cịng cã
thĨ x¶y ra ë c¶ bé gen (genome).
- Phần lớn các đột biến sau khi xảy ra đợc tự sửa chữa để trở lại
trạng thái bình thờng, một số không tự sửa chữa đợc có thể dẫn đến

những biến đổi của kiểu hình ở những mức độ khác nhau.
1.2. Đột biến nhiễm sắc thể.
Nh đà biết nhiễm sắc thể chỉ hình thành rõ rệt khi tế bào phân chia,
còn tế bào ở gian kỳ (interphasis) trong nhân tế bào chỉ có thể quan sát thấy
chất nhiễm sắc (chromatine).
Vào năm 1956 Tjio và Levan [28] đà xác định chính xác số lợng
nhiễm sắc thể ở tế bào soma của ngời là 2n = 46. Năm 1960 Moorhead và
cộng sự [19] đà đề xuất phơng pháp nuôi cấy tế bào lympho ở máu ngoại
vi của ngời để quan sát nhiễm sắc thể với sự sử dụng PHA
(Phytohemagglutinin) đợc chiết xuất từ Phaseolus vulgaris để kích thích
chuyển dạng lympho bào. Từ đó đến nay, phơng pháp này đợc sử dụng
rộng rÃi trong các phòng di truyền tế bào để nghiên cứu nhiễm sắc thể với
những cải tiến nhỏ tuỳ từng phòng thí nghiệm.
1.2.1. Phơng pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể.
1.2.1.1. Nghiên cứu nhiễm sắc thể ở gian kỳ.
Nh đà nêu ở trên, ở gian kỳ nhiễm sắc thể tồn tại ở dạng chất nhiễm
sắc. ĐÃ có phơng pháp chính đợc đề xuất để nghiên cứu NST ở gian kỳ
này:

4


- Kü tht ph¸t hiƯn vËt thĨ Barr: ph¸t hiƯn chÊt nhiƠm s¾c giíi tÝnh
(biĨu hiƯn cho mét NST X không hoạt động sinh lý) để tham gia xác định sự
bất thờng của cặp NST giới tính.
- Kỹ thuật phát hiện vật thể Y: phát hiện vùng chất nhiễm sắc bắt màu
huỳnh quang đậm của NST Y để tham gia xác định sự bất thờng của NST
Y.
- Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH): phát hiện sự bất thờng
của một NST nào đó tùy thuộc vào Kit đợc dùng.

1.2.1.2. Nghiên cứu NST ở tế bào đang phân chia.
Đây là phơng pháp chủ yếu để nghiên cứu đột biến NST.
Tế bào thờng đợc dùng để nghiên cứu NST là tế bào lympho ở máu
ngoại vi. Ngoài ra, ngời ta còn dùng tế bào tuỷ xơng, tế bào bào thai, tế
bào trong dịch ối, tế bào tua rau thai, tế bào máu cuống rốnYêu cầu của
kỹ thuật là
- Có nhiều tế bào đang phân chia.
- Các tế bào tồn tại ở dạng kỳ giữa (metaphase) hoặc giữa kỳ đầu và
kỳ giữa (prometaphase) để có thể phân tích ở kính hiển vi quang học.
- Và có cách nhuộm NST thích hợp để có thể phân tích các đặc điểm
cần phân tích.
- Nhuộm NST theo phơng pháp nhuộm giemsa thông thờng.
Phơng pháp nhuộm này đợc hầu hết các phòng thí nghiệm di
truyền tế bào áp dụng vì đơn giản, NST hiện rõ nét, có thể phân biệt rõ các
tổn thơng nhỏ của NST nh các đứt đơn (break) hoặc các chỗ nhạt (gap).
Tuy nhiên, phơng pháp nhuộm này trong nhiều trờng hợp không đủ để
xác định vị trí chính xác của các NST, nhất là các NST giống nhau nh NST
nhóm C, nhóm D
- Nhuộm băng (Banding techniques).
Sự phân bố các chất dị nhiễm sắc (heterochromtine) và nhiễm sắc
thực (euchromatine) là đặc trng cho từng NST. Khi xử lý NST bằng các
phơng pháp xử lý và nhuộm khác nhau trên các NSt sẽ hiện lên các băng
sẫm và nhạt, các băng này đặc trng cho từng NST và do vậy có thể xác
5


định chính xác vị trí của từng NST, tuỳ theo cách xử lý và nhuộm mà có tên
tơng ứng của các kỹ thuật băng: Băng G, sau khi xử lý NST đợc nhuộm
bằng giemsa; băng Q, sau khi xử lý, NST đợc nhuộm bằng phẩm nhộm
huỳnh quang (Quinacrine hoặc Quanacrine mustard); băng C: NST đợc

nhuộm ở phần tâm (centromere); băng R: sự phân bố của các băng sẫm và
nhạt ngợc lại với băng G.
- áp dụng kỹ thuật FISH với NST ở metaphase hoặc intermetaphase.
Thờng đợc dùng để xác định một kiểu hình bất thờng nào đó
tơng ứng với kit ADN đà có. Sự bổ sung của ADN đích trên NST với kit
ADN sẽ đợc phát hiện bằng phơng pháp lai tại chỗ với các loại phẩm
nhuộm huỳnh quang thích hợp.
- áp dụng kỹ thuật nhân nhỏ ở tế bào lympho của ngời
(Micronucleus test)
Kỹ thuật này đợc Countryman và Headle đề xuất vào năm 1976 [8].
Nhân nhỏ đợc hình thành do sự kết đặc của các đoạn NST bị đứt
không mang tâm động, hoặc do có các NST bị thất lạc trong quá trình di
chuyển ở kỳ sau. Có thể nói nhân nhỏ là hình ảnh của các rối loạn cấu trúc
và rối loạn NST xảy ra trong lần phân bào trớc. Nhân nhỏ chỉ biểu hiện ở
các tế bào đang phân chia. Nhân nhỏ có thể quan sát thấy ở tế bào tạo hồng
cầu của tuỷ, ở tế bào lympho. Với việc dùng cytochalasin B để ức chế sự
phân chia của tế bào chất có thể quan sát các nhân nhỏ (nếu có đột biến) ở
các tế bào có hai nhân.
1.2.1.3. Phơng pháp trao đổi chromatid chị em (Sister Chromatid
Exchange = SCE).
Phơng pháp này đợc Perry và cs đề xuất vào năm 1974.
Bằng cách dùng 5 - Bromodeoxyuridin (5 - BrdU) và các tiền xử lý để
nhuộm hai chromatid chị em, từ đó quan sát thấy các trao đổi giữa hai
chromatid cũ và mới. Sự trao đổi này thể hiện các biến đổi bên trong NST ở
các locus tơng ®ång cđa hai chromatid bao gåm sù ®øt ra vµ nối lại của
từng phần của hai chromatid chị em trong chu kỳ tế bào. Tần số trao đổi

6

chromatid chị em đợc sử dụng nh một test nhạy cảm để đánh giá tác động
gây đột biến của các tác nhân khác nhau.
1.2.2. Phơng pháp đánh giá đột biến NST.
1.2.2.1. Lợc sử xếp bộ NST của ngời.
Để đánh giá đột biến NST, trớc hết cần xác định cách xếp bộ NST
(karyotype). Hội nghị các nhà di truyền tế bào häc ë Denver (1960), ë
London (1963) vµ ë Chicago (1965) đà thống nhất đợc các điểm chính sau
đây:
- 46 NST của ngời đợc xếp thành 7 nhóm: Nhóm A (3 cỈp NST),
nhãm B (2 cỈp NST), nhãm C (6 cỈp NST + NST X), nhãm D (3 cỈp NST),
nhãm E (3 cỈp NST), nhãm F (2 cỈp NST), nhãm G (2 cặp NST + NST Y).
- Các NST đợc xếp theo tiêu chuẩn: chiều dài tơng đối của NST
(giảm dần từ nhóm A đến nhóm G) và chỉ số tâm.
- Một số ký hiệu NST trong trạng thái bình thờng và trạng thái bị đột
biến, ví dụ:
46, XX: Bộ NST của ngời nữ bình thờng.
46, XY: Bộ NST của ngời nữ bình thờng.
Sau khi có kỹ thuật băng trên NST, hội nghị ở Paris và các hội nghị
Di truyền học ngời sau đó đà bổ sung các ký hiệu mới. Danh pháp NST của
ngời đà đợc thông tin chi tiết trong ISCN 1995 [13].
1.2.2.2. Xếp loại các dạng đột biến NST của ngời.
- Đột biến số lợng NST.
+ Đa bội thể bao gồm cả đa bội nội sinh (endoreduplication).
+ Lệch bội (Aneuploidy) bao gồm các dạng monosomi, trisomi NST
thờng hoặc NST giới.
- Đột biến cấu trúc NST.
+ Nếu các tác nhân gây đột biến tác động vào NST ở giai đoạn sau
khi ADN đà nhân đôi (vào giai đoạn G2 của chu kỳ tế bào) thì các đột biến
7

cấu trúc ở dạng chromatid (chromatide type). Đột biến cấu trúc dạng
chromatid gồm: gap (hoặc khuyết, nhạt), đứt đơn (break), trao đổi
chromatid tạo thành hình 3 cánh (triradial) hoặc 4 cánh (quadriradial).
+ Nếu các tác nhân gây đột biến tác động vào NST ở giai đoạn ADN
cha nhân đôi (vào giai đoạn G1 của chu kỳ tế bào) thì các đột biến cấu trúc
ở dạng nhiễm sắc thể (chromosome type). Đột biến cấu trúc dạng NST bao
gồm:
- Gap kép hoặc isogap
- Đứt kép.
- NST hình vòng (r = ring).
- NST hai tâm (d = dicentric).
- Nhân đoạn (dup = duplication).
- Các dạng NST chuyển đoạn (t = translocation).
- Các dạng NST đảo đoạn (inv = inversion).
- NST đều (i = isochromosome).
- Đứt đoạn nhỏ (minute).
- Hoặc các NST lạ (mar) cha xác định rõ nguồn gốc.
+ Trong một số trờng hợp cả bộ NST (genome) bị nát vụn hoặc bắt
màu không đều.
1.3. Đột biến NST do tác động của chất da cam / Dioxin.
1.3.1.Các nghiên cứu ở trong nớc.
Các nhà nghiên cứu Việt Nam là những ngời đầu tiên nghiên
cứu tác động của các chất diệt cỏ và làm rụng lá, trong đó có chất da cam /
dioxin lên NST của ngời.
Ngời đầu tiên đặt vấn đề và thực hiện nghiên cứu là giáo s Tôn
Thất Tùng và giáo s Bạch Quốc Tuyên. Trong công trình nghiên cứu Tác
hại của việc sử dụng chất diệt cỏ liên tục và liều cao đến ngời dân thờng
Việt Nam [33] đột biến NST đà đợc nghiên cứu. Công trình đà đợc báo
cáo ở Hội nghị chiến tranh hoá học do Liên đoàn những ng−êi lµm khoa häc

8


ở Orsay Paris tổ chức năm 1971. Năm 1973 Bạch Quốc Tuyên, Trịnh Kim
Anh, Nguyễn Xuân Huyên và cs [34] đà công bố công trình nghiên cứu
Chất làm rụng lá và đột biến NST. Công trình dà nghiên cứu đột biến NST
ở 54 nạn nhân bị nhiễm chất độc hoá học từ miền Nam ra nằm điều trị tại
bệnh viện E Hà Nội. Sau đó, Bạch Quốc Tuyên và cs đà thực hiện các
nghiên cứu về NST ở một số ngời sống ở vùng đà từng bị rải chất độc hoá
học ở Quảng Nam (năm 1978), ở huyện Hoài Nhơn tỉnh Bình Định (năm
1979), ở huyện Trà Mi, Quảng Nam (năm 1980). Trong báo cáo ở hội thảo
quốc tế lần thứ nhất về "tác động lâu dài của chiến tranh hoá học ở Việt
Nam", Bạch Quốc Tuyên và cs [35] đà tổng hợp các số liệu đà nghiên cứu
(138 ngời bị phơi nhiễm, 177 ngời thuộc nhóm đối chứng). Các tác giả đÃ
có kết luận: "Các chất diệt cỏ làm rụng lá gây ra rối loạn NST với tần suất
tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng".
Năm 1980 Cung Bỉnh Trung đà bảo vệ luận án phó tiến sĩ y học với
đề tài: "Một số hậu quả di truyền tế bào học do chất độc hoá học Mỹ rải ở
miền Nam Việt Nam [30]". Tác giả này cũng có nhận xét: ở những ngời bị
phơi nhiễm với chất diệt cỏ làm rụng lá, tần số các dạng đột biến NST tăng
cao. Đột biến NST cũng đợc Cung Bỉnh Trung, Vũ Văn Diệu và Cs nghiên
cứu ở những ngời trực tiếp bị nhiễm độc do chất hoá học rải ở miền Nam
Việt Nam [31].
Đặc điểm của các nhà nghiên cứu của Việt Nam trong các công trình
đà nêu ở trên là;
- Tình trạng của bộ NST đợc đánh giá rất sớm, ngay sau khi phơi
nhiễm một thời gian rất ngắn.
- Đa số những ngời đợc xét nghiệm sống ở những vùng bị rải chất
diệt cỏ làm rụng lá nhiều lần, có thể bị phơi nhiễm nặng.

Những dẫn liệu khoa học trong các báo cáo trên là những số liệu khoa
học rất có giá trị, những nghiên cứu của các tác giả nớc ngoài hoặc các nhà
nghiên cứu Việt Nam ở các giai đoạn sau không thể có đợc.
Do cách nhìn nhận vấn đề khác nhau, thực hiện nghiên cứu ở các thời
điểm khác nhau, với các đối tợng với mức độ phơi nhiễm khác nhau nên
còn có những kết luận khác nhau. Hội thảo quốc tế lần thứ nhất đà có kết
luận nh sau: "Công trình của các nhµ khoa häc ViƯt Nam rÊt hÊp dÉn
9


nhng vì tính gây tranh luận của các y văn đà xuất bản về kết quả di truyền
của các chất diệt cỏ này nên cần có các nghiên cứu thêm ở phòng thí
nghiệm"
Trong hội thảo quốc tế lần thứ hai (1993) về "Chất diệt cỏ trong chiến
tranh, tác hại lâu đối với con ngời về thiên nhiên" một số bản báo cáo khoa
học về di truyền tế bào học đà đợc trình bày. Nguyễn Trần Chiến và Cs [7]
đà giới thiệu tần số trao đổi chromatid chị em và tần số một số dạng đột
biến NST ở 9 ngời đà đợc xác định 2,3,7,8 - TCDD ở mô mỡ dao động từ
5,2ppt đến 34,8ppt. Các tác giả thấy tần số SCE và tần số đột biến NST tăng
cao ở những đối tợng này. Umnova NV và Cs [36] ở Trung tâm nhiệt đới
Việt Nga đà thông báo về tần suất chromatid chị em trong các lymphoxit
máu ngoại vi đợc nuôi cấy của c dân nông thôn tỉnh Sông Bé (nay là tỉnh
Bình Dơng). Bằng phơng pháp nuôi cấy máu 72 giờ và 96 giờ các tác giả
đà ghi nhận sự tăng cao của tần suất tế bào có rối loạn NST, tăng cao tần số
đơn bội và SCE.
Trịnh Văn Bảo và Cs [3] đà nghiên cứu NST ở thế hệ F1 và F2 của
những ngời tiếp xúc với chất độc hoá học trong chiến tranh: 15 trẻ em là
con của những cựu chiến binh đà bị rải CĐHH trực tiếp lên ngời (tuổi
trung bình là (11 5), 15 trẻ em là cháu của các cựu chiến binh đà bị rải
CĐHH trực tiếp lên ngời và 12 trẻ em là cháu của các cựu chiến binh

không bị phơi nhiễm với CĐHH, tuổi của hai nhóm sau tơng đơng nhau
(3 2). Tần số các dạng đột biến NST ở nhóm cháu của những ngời đÃ
phơi nhiễm với CĐHH (F2B) và nhóm không phơi nhiễm với CĐHH (F2A)
không có sự khác biệt. Riêng nhóm con của những CCB đà phơi nhiễm với
CĐHH (F1B) số tế bào có NST bị đứt đơn, đứt kép có phần cao hơn so với
nhóm F2B. Cũng trong hội thảo quốc tế lần thứ hai, Bourakov V.V và Cs [6]
đà cho thấy sự giảm tỷ lệ bắt chéo (Chiasma frequency) trong quá trình
giảm phân ở chấu chấu (Locustes) tại những vùng bị rải CĐHH.
Trong kết luận của hội thảo quốc tế lần thứ hai có câu "Dioxin có thể
ảnh hởng tới các gen trên NST làm rối loạn NST và có thể đợc coi là tác
nhân gây quái thai, sinh sản bất thờng".

10


Sau hội thảo quốc tế lần thứ hai từ năm 1993 đến 1998 Trịnh Văn Bảo
và Cs đà tập trung vào đánh giá những biến đổi di truyền tế bào học và
những bất thờng sinh sản ở những cựu chiến binh và gia đình của các cựu
chiến binh đà từng bị phơi nhiễm với chất dộc hoá học ở miền Nam Việt
Nam. Những nghiên cứu này đợc thực hiện sau khi quân đội Mỹ ngừng rải
CĐHH ở miền Nam Việt Nam hơn 20 năm. Trong báo cáo khoa học "Xét
nghiệm di trun tÕ bµo häc ë 100 cùu chiÕn binh bị bệnh" Trịnh Văn Bảo
và Cs [4] đà thông báo kÕt qu¶ xÐt nghiƯm NST cho 100 cùu chiÕn binh đÃ
từng trực tiếp bị phơi nhiễm ví CĐHH trong chiến tranh ở miền Nam Việt
Nam, những CCB này bị nhiều loại bệnh khác nhau nghi có liên quan với
nhiễm độc dioxin: chloracne, viêm da thần kinh, da bị nổi mẩn và đổi màu
sắc, suy nhợc thần kinh. Kết quả xét nghiệm cho thấy tần số đột biến
NST ở những ngời này ở ngỡng bình thờng, duy chỉ có một CCB bị viêm
da thần kinh cả 3 đứa con đều bị dị tật và nhiều rối loạn NST ở lympho bào
nuôi cấy. Trong một nghiên cứu khác Trịnh Văn Bảo và Cs [5] đà nghiên

cứu đột biến NST ở các gia đình có nhiều con bị dị tật hoặc cháu bị dị tật.
1.3.2. Các nghiên cứu ở nớc ngoài.
2,4 - D và 2,4,5 - T là hai thành phần tạo nên chất da cam nên đà có
một số nghiên cứu di trun tÕ bµo häc vỊ hai chÊt nµy, chđ u là 2,4 - D,
vì chất này đợc sử dụng rộng rÃi trong nông nghiệp. Johnson, 1971 [14]
không thấy sự tăng cao của các dạng đột biến NST ở lympho bào của 10
công nhân sản xuất 2,4 - D; Andreasik và Cs, 1979 [1], Hưgstedt vµ Cs
1980 [11] cịng cã nhËn xét tơng tự khi nghiên cứu NST từ lympho bào của
15 công nhân đóng gói 2,4 - D. Nhng Yoder vµ Cs, 1973 [37], cịng nh−
Crossen vµ Cs, 1978 [9] đà quan sát thấy sự tăng cao của các dạng rối loạn
NST ở lympho bào do tiếp xúc với các hoá chất trừ sâu có chứa 2,4 - D, nhất
là vào các thời vụ phải tiếp xúc nhiều. Bằng phơng pháp phân tích sự trao
đổi chromatid chị em Linnaimaa, 1983 [18] không thấy sự tăng cao tần số
SCE/tế bào ở những ngời phơi nhiễm với 2,4 - D. Lực thống kê của các
nghiên cứu này còn bị hạn chế vì hầu hết các mẫu đợc nghiên cứu không

11


đợc đo độ 2,3,7,8 - TCDD và số mẫu trong các nghiên cứu còn nhỏ. Chính
vì vậy, các kêt luận còn mâu thuẫn và không nhất quán.
Sau sự cố ở Seveso (Italy), các nhà khoa học đà thực hiện các điều tra,
nghiên cứu về di truyền tế bào học. Tenchini và Cs [27] đà thấy sự tăng cao
đáng kể tần số tế bào có rối loạn NST ở tế bào bào thai của các thai sẩy của
các bà mẹ có thĨ ph¬i nhiƠm víi 2,3,7,8 - TCDD. Nh−ng Reggiani, 1980
[23] không thấy sự tăng cao tần số rối loạn NST ở 17 ngời bị chloracne sau
sự cố Seveso.
Kaye và Cs, 1985 [16] thấy đột biến NST tăng cao ở 10 cùu chiÕn
binh ®· tham chiÕn ë ViƯt Nam, nh−ng Mulcahy và Cs, 1980 [20] không
thấy tần số rối loạn NST và trao đổi chromatid chị em tăng cao ở 15 cùu

chiÕn binh tham chiÕn ë ViƯt Nam. Zober vµ Cs, 1993 [38] đà phân tích tần
số các dạng đột biến NST và tần số SCE ở 27 công nhân có nồng độ 2,3,7,8
- TCDD trong máu trên 40ppt đà thấy; không có sự khác biệt về tân số gap,
đứt đơn, đứt kép, trao đổi chromatid và tần số tế bào có nhiều NST bị rối
loạn giữa nhóm nghiên cứu và nhóm chứng. Các tác giả thấy tần số trao đổi
chromatid chị em / tế bào và tần số tế bào có trên 10 trao đổi chromatid tăng
cao ở nhóm nghiên cứu. Kaiumova và Cs, 1998 [15] đà nghiên cứu những
dạng đột biến NST ở một số công nhân sản xuất chất diệt cỏ. Năm 2002
trong hội nghị Dioxin ở Bacelona Nagayama [21] nghiên cứu tần số SCE ở
những trẻ bú sữa mẹ nghi có Dioxin.
1.4. Vấn đề di truyền qua ngời bố.
Trong hội thảo quốc tế lần thứ nhất và lÇn thø hai vỊ chÊt diƯt
cá trong chiÕn tranh, vÊn ®Ị di trun qua ng−êi bè ®Ịu ®−ỵc ®Ị cËp. Nhiều
thực nghiệm đà đợc thực hiện, Anderson [2] đà tập hợp các nghiên cứu đó
thành chuyên đề: Male mediated F1 Abnormalities. Liên quan với dioxin,
Richads và Cs [24] cũng đà công bố bài báo khoa học "Male Reproductive
Toxicity of Dioxin". ở Việt Nam sự tăng cao tần số bất thờng sinh sản ở
những cựu chiến binh miền Bắc bị phơi nhiễm với chất độc hoá học trong

12


chiÕn tranh ë miỊn Nam ViƯt Nam lµ mét dÉn chøng cho sù di truyÒn qua
ng−êi bè.

13


II . Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
Trong khuôn khổ của đề tài cấp nhà nớc Nghiên cứu các đặc điểm

về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lu dioxin trên các
đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao các đối tợng của từng đề tài nhánh
đều thực hiện chung trên cùng nhóm đối tợng chung.
2.1. Địa điểm nghiên cứu:
Đợt nghiên cứu thứ nhất đà đợc thực hiện vào tháng 11 năm 2001 ở
Biên Hoà - Đồng Nai. ở đây có sân bay Biên Hoà; nhiều nghiên cứu với các
mẫu đất ở sân bay Biên Hoà đà xác định có hàm lợng dioxin cao. Đây
cũng là thành phố công nghiệp với nhiều nhà máy, khu công nghiệp rộng
lớn. Ba phờng của Biên Hoà là phờng Trung Dũng, phờng Tân Hạnh,
phờng Tân Phong đà đợc chọn làm địa điểm nghiên cứu. Phờng Trung
Dũng tiếp giáp với sân bay Biên Hoà, nớc từ sân bay chảy ra hồ Biên
Hùng.
Đợt nghiên cứu thứ hai đà đợc thực hiện vào tháng 6 năm 2002 ở
Nam Đông Thừa Thiên Huế. Đây là vùng căn cứ địa cách mạng nằm trong
dÃy Trờng Sơn nên quân đội Mỹ đà rải chất độc hoá học nhiều lần, nơi đây
cũng có một sân bay nhỏ. Đây cũng là vùng sốt rét lu hành nhiều năm.
Ngời dân sống ở đây chủ yếu là dân tộc Ka Tu, mức sống thấp, trình độ
văn hoá rất thấp. Ba xà đà đợc lấy mẫu để nghiên cứu di truyền là Hơng
Sơn, Hơng Hữu và Thợng Long.
Đợt nghiên cứu thứ ba đà đợc thực hiện vào tháng 10 năm 2002 tại
huyện An Hải Hải Phòng. Huyện này ở gần sân bay Cát Bi. 4 xÃ/phờng
đà đợc chọn làm địa điểm nghiên cứu là Tràng Cát, Cát Bi, Đằng Lâm và
Nam Hải. Địa điểm Hải Phòng đợc coi là địa điểm đối chứng vì trừ một số
cựu chiến binh có phơi nhiễm với chất độc hoá học trong chiến tranh còn đa
số ngời dân ở đây không bị ph¬i nhiƠm.

14


2.2.Đối tợng nghiên cứu:

2.2.1. ở Biên Hoà - Đồng Nai.
Các đối tợng nghiên cứu ở Biên Hoà - Đồng Nai đợc chia thành hai
nhóm: nhóm nguy cơ phơi nhiễm thấp và nhóm nguy cơ phơi nhiễm cao
theo qui định chung của đề tài. Bảng 2.1 giới thiệu đặc điểm của các nhóm
nghiên cứu.
Tổng số mẫu máu đà lấy để nghiên cứu các chỉ số di truyền tế bào
học ở Biên Hoà - Đồng Nai là 62 mẫu, trong đó có 22 mẫu từ nam giới và
40 mẫu từ nữ giới.

15


Bảng 2.1.

Số mẫu

Nguy cơ
Tổng số

Nam

Nữ

Địa điểm
Số lợng

Tuổi

Số lợng

Tuổi

4

26 19,8

Thấp
Trung Dũng

6

2

Tân Phong

10

3

55 7,07

7

44,17 4,36

Tân Hạnh

5

2

23

3

41,50 2,12

Tổng số:

21

7

39,2 ± 10,5

14

40 ± 10,50

Trung Dịng

26

10

39,92 ± 19,74

16

34,4 ± 19,74

T©n Phong

10

4

54,75 9,03

6

44 8,15

Tân Hạnh

5

1

4

16,33 6,03

41

15

26

39,50 18,96

Cao

Tổng số:

37,52 ± 17,59

16


2.2.2 . ở Nam Đông thành phố Huế
Các đối tợng đợc nghiên cứu ở huyện Nam Đông thuộc thành phố
Huế đợc chia thành hai nhóm: nhóm nguy cơ phơi nhiễm thấp và nhóm
nguy cơ phơi nhiễm cao phân theo bảng kiểm do Ban chủ nhiệm đề tài đề
xuất, hộ gia đình có từ 60 điểm trở lên là hộ gia đình có nguy cơ cao.
Bảng 2.2. trình bày đặc điểm của các nhóm đối tợng
Tổng số mẫu máu đà đợc lấy để nuôi cấy lympho bào phục vụ cho
phân tích đột biến NST và SCE ở huyện Nam Đông là 124 mẫu trong đó có
69 mẫu nam và 55 mÃu nữ. Cũng ở Nam Đông 14 ngời trong 6 gia đình có
ngời bị dị tật bẩm sinh và 4 phụ nữ đợc lấy mẫu sữa cũng đà đợc xét
nghiệm NST vµ SCE.

17


Bảng 2.2.

Số mẫu

Nguy cơ

Tổng số

Nam

Nữ

Địa điểm
Số lợng

Tuổi

Số lợng

Tuổi

11

23 10,93

Thấp
Hơng Sơn

21

10

27,2 10,28

Hơng Hữu

10

10

32,78 19,42

Thợng Long

10

5

46 21,74

5

44,80 13,22

Tổng sè:

41

25

36,21 ± 19,09

16

29,81 ± 15,53

H−¬ng S¬n

32

17

61,31 ± 12,94

15

53,57 ± 19,11

H−¬ng Hữu

32

17

51,94 13,87

15

51,60 14,62

Thợng Long

21

11

48,36 12,02

10

41 9,58

Tổng sè:

85

45

36,21 ± 19,09

40

29,81 ± 15,53

Cao

18


2.2.2. ở An Hải thành phố Hải Phòng
Các đối tợng ở địa điểm này đều là cựu chiến binh hoặc thanh niên
xung phong và một số con cháu của những ngời này. Các đối tợng này
đợc chia thành các nhóm:
- A1.1: Cựu chiến binh ở miễn Bắc có tuổi đời đến khi đợc nghiên
cứu là 41 49 tuổi, có con bị dị tật.
- A1.2: Cựu chiến binh nh trên nhng không có con bị dị tật.

- A2: Cựu chiến binh ở miền Bắc cỏ tuổi đời đến khi nghiên cứu là
40 tuổi, trong gia đình không có ai bị dị tật.
- B1: Cựu chiến binh miền Bắc đà tham gia chiến đấu ở miền Nam, có
con bị dị tật.
- B2: Cựu chiến binh nh B1 nhng vợ đà bị tai biến sinh sản hoặc bản
thân bị bệnh.
- B3: Cùu chiÕn binh nh− B1 nh−ng kh«ng cã bÊt th−êng sinh sản,
không có con bị dị tật.
- E2: Con của cựu chiến binh bị dị tật.
Số liệu về các nhóm này đợc trình bày trong bảng 2.3

19


Bảng 2.3.

Số mẫu
Nhóm

Tổng số

Nam

Nữ

Số lợng

Tuổi

Số lợng

A1.1

9

9

47 4,64

A1.2

19

18

54,63 12,52

1

A2

26

11

27,38 ± 8,42

15

B1

12

11

52,91 ± 5,49

1

B2

24

24

54,13 ± 8,70

B3

17

16

57,41 ± 5,03

E2

6

6

Tæng sè:

113

95

Tuæi

1
18

20

27,77 ± 8,42


2.3. Phơng pháp nghiên cứu.
2.3.1. Lấy mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.
- Các mẫu đợc lấy cùng một lần chung với các mẫu để phân tích các
chỉ số huyết học, miễn dịch, hoá sinh. Lợng máu đợc lấy cho mỗi ngời để
phân tích di truyền tế bào học khoảng 2 4 ml. Máu đợc chống đông bằng
heparin.
- Mẫu máu đợc bảo quản trong lạnh và chuyển ngay trong ngày về
phòng thí nghiệm bằng máy bay.
2.3.2. Phơng pháp nuôi cấy tế bào và phơng pháp đánh giá đột biến
nhiễm sắc thể.
3.3.2.1. Lympho bào máu ngoại vi đợc cấy theo phơng pháp của Moorhead
có cải tiến. Môi trờng để cấy lympho bào là môi trờng Karyomax complete
(Gibco). Làm dừng phân bào ở kỳ giữa bằng Karyomax colcemid (Gibco).

Tiêu bản NST đợc nhuộm bằng phơng pháp nhuộm giemsa thông
thờng và bằng phơng pháp nhuộm băng G có xử lý bằng trypsin.
2.3.2.2. Phơng pháp đánh giá đột biến NST,
Đánh giá đột biến NST đợc thực hiện trên tiêu bản nhuộm giemsa
thông thờng và nhuộm băng G.
Các tiêu bản NST đợc đánh giá theo các qui định quốc tế về xếp loại
đột biến và các danh pháp di truyền tế bào học (An International System for
Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN). C¸c chØ sè chủ yếu đợc đánh giá
là:
- Các tế bào có rối loạn số lợng NST.
+ Các tế bào lệch bội (aneuploid cells): các nhân tế bào vẫn còn nền bào
tơng có chøa sè NST d−íi l−ìng béi (44 hc 45 NST) hoặc trên lỡng bội
(47- 48 NST).
21


+ Các tế bào đa bội (polyploid cells): các tế bào có chứa 69 hoặc 92
NST, các NST tơng đồng trong tế bào có hình thái và bắt màu giống nhau. Tế
bào đa bội nội sinh cũng xếp vào nhóm này.
- Các tế bào có rối loạn cấu trúc NST.
Bao gồm các tế bào có rối loạn cấu trúc kiểu nhiễm sắc tử (chromatid
type) và rối loạn cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể (chromosome type).
+ Các rối loạn cấu trúc nhiễm sắc tử gồm:
* Gap (hay còn gọi là nhạt hoặc khuyết màu).
* Đứt (breaks).
* Trao đổi nhiễm sắc tử.
+ Các rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể gồm:
* Isogap (hay còn gọi là nhạt hoặc khuyết màu kép hoặc gap kép).
* Đứt kép (isobreaks): bao gồm các NST bị mất đoạn, các đoạn
không tâm, các minut.

* NST hình vòng (ring) có tâm hoặc không tâm.
* NST hai tâm (dicentric) hoặc đa tâm.
(Các dạng rối loạn cấu trúc NST nêu trên có thể đánh giá xác định ngay
khi phân tích NST ở kính hiển vi).
* Các tế bào mang NST chuyển đoạn (translocation), đảo đoạn
(inversion), nhân đoạn (duplication), nhiễm sắc thể đều (isochromosome) chỉ
có thể phân tích khi lập karyotyp với NST đà đợc nhuộm băng.
+ Các rối loạn cấu trúc của cả cụm NST.
Tất cả các NST trong tế bào bị nát vụn hoặc bắt màu thuốc nhuộm
không đều.
Trung bình cho mỗi ngời 50 tế bào ở kỳ giữa đợc đánh giá ở kính hiển
vi và 3 karyotyp đợc lËp.

22


2.3.3. Phơng pháp nuôi cấy tế bào và phơng pháp phân tích sự trao đổi
nhiễm sắc tử (chromatid) chị em.
2.3.3.1. Phơng pháp nuôi cấy lympho bào để đánh giá tần số SCE
.
Về cơ bản phơng pháp nuôi cấy tế bào giống nh phơng pháp nuôi
cấy để đánh giá đột biến NST. Để nhuộm SCE chúng tôi dùng phơng pháp
của Perry và Wolf (1974) [22].
- Vào giờ thứ 24 của quá trình nuôi cấy, 5 - BromodeoxyUridin (5BrdU)
đợc cho vào môi trờng nuôi cấy với nồng độ 10àg/ml. Tế bào đợc thu
hoạch vào giờ thứ 72.
- Tiêu bản đợc nhuộm với dung dịch Hoechst 33258 nồng độ 0,5àg/ml,
xử lý đèn UV trong 2 giờ và dung dịch 2 SSC. Tiêu bản đợc nhuộm bằng
giemsa 5%.
2.3.3.2. Phơng pháp đánh giá tần số SCE.

Trung bình cho mỗi ngời 25 tế bào ở kỳ giữa đà đợc phân tích ở kính
hiển vi và 3 tế bào đà đợc chụp ảnh.
Hai chỉ số đợc đánh giá là:
- Tần số SCE / tế bào.
- Tần số SCE / nhiễm sắc thể.
2.3.4. Xử lý số liệu.
Các số liệu đợc xử lý bằng phơng pháp thống kê toán học. Giá trị
trung bình thực nghiệm, độ lệch chuẩn, so sánh hai giá trị trung bình đà đợc
tính toán.

23


III. kết quả và nhận xét
Sự phân bố của các đối tợng đợc phân tích NST ở các địa điểm đợc
trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Phân bố nhóm đối tợng nghiên cứu ở các địa điểm.
Số mẫu đợc đánh giá NST

Địa điểm
Nhóm

Số mẫu đợc
đánh giá SCE

Nam

Nữ

Nam

Nữ

10
2

16
4

10
2

16
4

0
2

4
2

0
2

4
2

4
3
21

6
7
39

4
3
21

6
7
39

17
10

15
10

15
0

13
0

17
10

15
0

0
0

0
0

11
6
71

10
4
54

5
0
20

4
0
17

Biên Hoà Đồng Nai
- Trung Dũng
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
- Tân Hạnh
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp

- Tân Phong
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
Tổng số:
Nam Đông Huế
- Hơng Sơn
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
- Hơng Hữu
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
- Thợng Long
+ Nguy cơ cao
+ Nguy c¬ thÊp
Tỉng sè:

24