Nghiên cứu quy trình xác định atorvastatin bằng phương pháp von ampe trên điện cực glassy cacbon ( GC)”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A
Lời cảm ơn

Những dòng đầu tiên của bản kháo luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đối với TS. Nguyễn Thị Kim Thường đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn và
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn chỉnh đề tài này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Hóa nói chung
và bộ môn phân tích nói riêng đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý
báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại khoa, và tạo mọi điều kiện hết
sức thuận lợi về mặt thiết bị và hóa chất giúp em hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, các bạn trong lớp K57AHóa học, và các bạn sinh viên trên phòng thí nghiệm hóa phân tích đã trao đổi giúp
đỡ cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày

tháng

Sinh Viên
Phạm Thị Hương

1

năm


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Tiếng anh

Tiếng việt

Viết tắt

1

Anodic Stripping
Voltammetry

Von-ampe hòa tan anốt

ASV

2

Asorptive Stripping
Voltammetry

Von-ampe hòa tan hấp phụ

AdSV

3

Cathodic Stripping
Voltammetry

Von-ampe hòa tan catốt

CSV

4

Cyclic Voltammetry

Von-ampe vòng

CV

5

Differential Pulse
Voltammetry

Von-ampe hòa tan xung
vi phân

DPV

6

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOD

7

Limit of Quantity

Giới hạn định lượng

LOQ

Liquid ChromatographySắc kí lỏng khối phổ khối phổ
Tandem Mass Spectrometry

8

LCMS/MS

9

Low -Density Lipoprotein

Cholesterol xấu

LDL

STT

Tiếng anh

Tiếng việt

Viết tắt

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

10

Mercury Film Electrode

Điện cực màng thủy ngân

MFE

11

Hanging Mercury Dropping
Electrode

Điện cực giọt thủy ngân treo

HMDE

12

High Perfomanc Liquid
Chromatography

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao

HPLC

13

High performance thin
layer chromatography

Sắc kí bản mỏng hiệu năng
cao

HPTLC

14

Reversed- Phase HighPerformance Liquid
Chromatography

Sắc kí lỏng pha đảo

RPHPLC

15

Static Mercury Dropping
Electrode

Điện cực giọt thủy ngân tĩnh

SMDE

16

Stripping Voltammetry

Von-ampe hoà tan

SV

Von-ampe hòa tan sóng
vuông

SqW

Square-Wave Stripping
Voltammetry

17

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG KHÓA LUẬN

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

5

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A
Mục Lục

Contents

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A
Mở đầu

Hiện nay, các hợp chất có hoạt tính sinh học dùng làm thuốc chữa bệnh cho
con người có rất nhiều loại, mà hàm lượng các hoạt chất trong dược phẩm có tính

chất quyết định đến liều dùng và khả năng chữa bệnh, đồng thời khả năng chuyển
hóa và đào thải thuốc trong cơ thể người cần được theo dõi và kiểm tra. Thuốc được
sử dụng nhằm mục đích chữa bệnh nhưng nhiều tổ chức cá nhân đã lợi dụng cho ra
đời nhiều loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng làm nguy hại cho sức khỏe và kinh
tế cho con người. Ngày 27-5-2014, theo các nghiên cứu của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO), tốc độ tăng trưởng hàng năm của "ngành công nghiệp tội lỗi" này lên tới
100% từ năm này sang năm khác. Theo WHO, thuốc giả chiếm tới 30% và thậm
chí, có khi còn lên tới 50% lượng dược phẩm lưu hành ở một số nước đang phát
triển, còn tại Nigeria và Guinee, cứ 10 viên thuốc bán ra có tới 6 viên là thuốc giả.
Các mẫu thuốc giả chủ yếu là thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau, thuốc giảm các
yếu tố độc hại trong cơ thể (hạ đường huyết, giảm cholesterol...). Điều khiến nhiều
người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp, nên công
tác kiểm tra ngày càng khó khăn hơn. Theo TS. Trương Quốc Cường, Cục trưởng
Cục Quản lý dược- Bộ Y tế, tỷ lệ thuốc kém chất lượng ở Việt Nam hiện dao động
khoảng 3% và thuốc giả dưới 0,02%. Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của
thuốc theo đúng tiêu chuẩn là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết.
Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào
chế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh
học để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại, cũng như khả năng hấp phụ của thuốc trong
cơ thể. Ngày nay, có rất nhiều phương pháp được dùng để xác định xác nhóm chất
có hoạt tính sinh học, chủ yếu là các phương pháp sắc ký như HPLC, GC,.., phương
pháp UV-VIS…. Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền,
quy trình phân tích phức tạp…Vì thế cần đòi hỏi một phương pháp có thể đảm bảo
độ đúng, độ chọn lọc mà quy trình đơn giản và chi phí phân tích không cao. Trong
các phương pháp phân tích công cụ hiện đại, thì phương pháp Von-ampe hòa tan có
thể đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Vì vậy, tôi đã chọn phương pháp Von-ampe
hòa tan hấp phụ để thực hiện đề tài khóa luận của mình:“ Nghiên cứu quy trình
xác định Atorvastatin bằng phương pháp von-ampe trên điện cực glassy
cacbon ( GC)”. Atorvastatin là thuốc làm giảm lượng Cholesterol trong máu và bổ
trợ cho các quá trình làm giảm các lipid khác, được dùng cho người tăng

Cholesterol trong máu, những người có nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch.

7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu về Atorvastatin
1.CấuủtạoacAnsrvàihđóệ x
Atorvastatin là một thuốc làm giảm cholesterol. Tên khoa học, theo IUPAC:
(3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-(propan-2-yl)- 1Hpyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic axit và được biết đến với tên thương mại là
Liptor hay Atova.[1]
Công thức cấu tạo của Atorvastatin:

Hình 1: Công thức cấu tạo của Atorvastatin
Công thức phân tử là : C33H35FN2O5, khối lượng mol là 558,64( g/mol); pKa=4,6[1]
Hoạt chất sử dụng của Atorvastatin là Atorvastatin Canxi

Hình 2: Công thức cấu tạo của Atorvastatin Canxi
AtorvasinCxcóêkhọeIUPlà:(bR,d)-2rfuopnyihx5sl3e-4(carbmoy)p1htnid:2e.CôgứcấuạolàH18a6F2N4O03hy(C32)5.H[1]
trAovasincxókhốilượngpâtửà209,14(g/mol) Atorvastatin và dạng muối Atorvastatin Canxi tồn tại ở dạng bột tinh thể rất
ít tan trong nước: 20,4 µg/mL( ở pH 2,1); 1,23 mg/mL( ở pH 6,0), tan ít trong
etanol, tan hoàn toàn trong metanol.[1]

8

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

21.DượclựhọvàđộngủaAtosrCix
1.1.2.1. Dược lực học
Atorvastatin là chất ức chế cạnh tranh và chọn lọc men khử 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA), là một enzyme khóa trong sinh tổng hợp
cholesterol. Sử dụng Atorvastatin làm giảm lượng cholesterol, Atorvastatin làm
giảm lipoprotein và cholesterol. Atorvastatin ức chế quá trình chuyển hóa HMGCoA thành mevalonat, một tiền chất của sterol, bao gồm cholesterol. Atorvastatin
canxi tan rất ít trong nước cất; acetonitrin; tan ít trong etanol và tan nhiều trong
metanol. Atorvastatin để điều trị tăng lipit trong máu và phòng các bệnh về tim
mạch.[2][3]
1.1.2.2.Dược động học .
Atorvastatin được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ thuốc trong
huyết tương tối đa đạt được trong vòng 1-2 giờ. Mức độ hấp thu và nồng độ
Atorvastatin tăng tỉ lệ với liều lượng Atorvastatin. Atorvastatin dạng viên có độ khả
dụng sinh học 95-99% so với dạng dung dịch. Độ khả dụng sinh học tuyệt đối của
Atorvastatin là khoảng 14% và độ khả dụng toàn thân của hoạt động ức chế men
khử HMG- CoA là khoảng 30%. Tính khả dụng toàn thân thấp là do sự thanh lọc ở
niêm mạc đường tiêu hóa hoặc chuyển hóa lần đầu ở gan. Khoảng 98 % atorvastatin
gắn kết với các protein trong huyết tương. Nồng độ thuốc trong huyết tương khi
dùng thuốc buổi chiều tối thấp hơn khi dùng buổi sáng, tuy nhiên nồng độ thuốc
trong huyết tương xấp xỉ 0,25 % cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào hồng cầu thấp,
nhưng hiệu quả giảm LDL thì như nhau. Thể tích phân phối trung bình của
Atorvastin khoảng 381 lít. Trên 98% Atorvastatin được gắn kết với protein huyết
tương. Tỉ lệ hồng cầu huyết tương xấp xỉ 0,25 cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào
hồng cầu thấp. Atorvastatin và các chuyển hóa của nó được thải trừ chủ yếu qua
mật sau quá trình chuyển hóa tại gan hoặc ngoài gan. Tuy nhiên, thuốc không đi qua
chu trình gan ruột. Thời gian bán hủy trong huyết tương trung bình của Atorvastatin
ở người khoảng 14 giờ, nhưng một nửa thời gian của hoạt động ức chế men khử

HMG- CoA là 10-20 giờ do có sự đóng góp của các chất chuyển hóa có hoạt tính.
Dưới 2% lượng Atorvastatin uống vào được tìm thấy trong nước tiểu.[2][3]

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

1.2.Các phương pháp xác định Atorvastatin
1.2Phươngắpácskí
BaHia và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC kết hợp với detecter
huỳnh quang dùng để xác định đồng thời Amlodipin và Atorvastatin trong hỗn hợp
thuốc. Quá trình đo huỳnh quang sử dụng bước sóng kích thích và bước sóng
huỳnh quang lần lượt là 361nm và 274nm; 442nm và 378nm cho Amlodipin và
Atorvastatin. Trong phương pháp này, BaHia đã tách Atorvastaitn và Amlodipin
bằng cách cho qua cột C18 với thành phần pha động là hỗn hợp dung dịch
acetonitrin: photphat (C= 0,015M; pH=3, tỉ lệ thể tích v/v=45:55). LOD và LOQ
của Atorvastatin và Amlodipin lần lượt là 0,869 µg/mL; 1,149 µg/mL và 2,633
µg/mL; 3,483 µg/mL.[15]
Beata Stanisz và Lukas Kania sử dụng phương pháp HPLC để xác định
Atorvastatin trong các mẫu dược phẩm. Tác giả đã sử dụng cột C18 để tách
Atorvastatin; dung môi là hỗn hợp acetonitrin và nước theo tỉ lệ thể tích v/v = 48 :
52, pH được điều chỉnh về pH = 2 với axit orthophotphoric. Chất phân tích được
phát hiện ở bước sóng λ = 245 nm. Khoảng tuyến tính của thuốc là 0,04 - 0,4
mg/mL, hệ số tương quan là R2 = 0,9990.[19]
Hafez sử dụng phương pháp HPLC để xác định Amlodipin và Atorvastatin
trong mẫu thuốc. Phương pháp được thực hiện trên cột C 18 100A(250×4,6mm;
2,6µm); pha động là hỗn hợp dung dịch dihydrogen photphat( pH=5,5; C= 0,03M)

và acetonitrin ( 65:35v/v), được bơm vaò hệ thiết bị với tốc độ 1,2ml/phút ở 40°C.
Mẫu thuốc được phát hiện ở bước sóng 240nm. Từ điều kiện trên, tác giả đã thu
được khoảng tuyến tính là 5,18- 15,54; 5,26- 15,78 µg/mL; độ chính xác: 99,73±
0,46%; 100,22± 1,04%; độ chụm: 100,34± 0,61; 101,01± 1,72%; giới hạn phát hiện:
0,16 và 0,17µg/ mL; giới hạn định lượng: 0,48 và 0,52 µg/ mL tương ứng cho
Amlodipin và Atorvastatin.[20]
Srinivasa và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng
Atorvastatin, Metformin and Glimepiride trong huyết tương người. Tác giả đã sử
dụng Carbamazepin như một chất nội chuẩn(IS). Mẫu được tách trên cột C18
Alltima HP, với thành phần pha động là acetonitrin và 10mM amoni axetat ( pH
3,0) với tỉ lệ 60:40( V/V); tốc độ dòng 1,1mL/phút. Khoảng tuyến tính 0,50–
150,03 ng/mL cho Atorvastatin, 12,14– 1207,50 ng/mL cho Metformin và 4,97–
494,29 ng/mL cho Glimepiride.[26]

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

Borek và cộng sự đã xác định đồng thời Atorvastatin và 2-hydroxyatorvastatin
trong huyết tương người và thuốc bằng phương pháp HPLC- MS/MS. Tác giả thu
được kết quả sau: khoảng tuyến tính 0,10- 40,00ng/mL cho cả Atorvastatin và 2hydroxyatorvastatin. Giới hạn định lượng là 0,02ng/mL và 0,07ng/mL cho
Atorvastatin và 2-hydroxyatorvastatin.[17]
Waghmare A. N đã sử dụng phương pháp RP-HPLC đánh giá đồng thời
Amlodipin và Atorvastatin trong mẫu thuốc. Phương pháp chuẩn, đơn giản, nhạy,
nhanh với thành phần pha động acetonitrin và KH 2PO4 0,02M (55:45V/V), sử dụng
cột BEH C18( 100mm×2,1mm; 1,7µm) với tốc độ dòng 0,3mL/phút. Tác giả thu
được khoảng tuyến tính cho Amlodipin và Atorvastatin đều là 0,5- 40,0 µg/mL, R 2

là 0,9999 cho Amlodipin và 0,9997 Atorvastatin. Hiệu suất thu hồi trung bình;
LOD; LOQ cho Amlodipin là
100,79%; 0,062µg/mL; 0,078 µg/mL và
Atorvastatin là 99,87%; 0,02µg/mL; 0,026 µg/mL.[27]
K.R.Alagawadi và cộng sự sử dụng phương pháp HPTLC để xác định đồng
thời Atorvastatin, Glimiprid và Metformin trong hỗn hợp thuốc. Phương pháp dùng
bản nhôm TLC, lớp phủ với silica gel 60F -254 như pha tĩnh; hệ thống dung môi gồm
có nước: metanol: amoni sulphat( 3,5: 3,5: 12,6, v/v/v). Xác định Atorvastatin,
Glimiprid và Metformin tại bước sóng 245nm. Hệ số tương quan và khoảng tuyến
tính của Atorvastatin là R2 = 0,9995 ; 100- 700 ng/mL; Glimiprid: R2 = 0,9987; 20140 ng/ml và Metformin: R2 = 0,9967; 100 -1500 ng/mL. Từ điều kiện trên, thu
được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 20ng/mL và 80 ng/mL cho
Atorvastatin; 5 và 20 ng/mL cho Glimiprid; 50 và 100 ng/mL cho Metformin.
Phương pháp có độ chụm, độ thu hồi tương đối tốt và trong giới hạn cho phép.[22]
Sandeep và cộng sự đã ứng dụng phương pháp quang phổ UV và RP-HPLC
để xác định đồng thời Atorvastatin Canxi và Ezetimib trong mẫu dược phẩm tại 2
bước sóng hấp phụ cực đại là 246,0nm và 232,5nm; khoảng tuyến tính 5-25µg/mL
cho cả hai thuốc. Phương pháp RP-HPLC sử dụng cột Luna C 18 và thu được
khoảng tuyến tính 8- 22 µg/mL cho cả 2 loại thuốc.[25]
21.Phươngpátrắcqua
Baldha và cộng sự sử dụng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử UV
xác định đồng thời Atorvastatin Canxi và Ezetimib trong thuốc. Atorvastatin có hai
bước sóng hấp thụ cực đại là 227,0; 246,5nm và Ezetimibe là 235,0; 258,2nm. Từ
điều kiện trên, tác giả thu được khoảng tuyến tính là 5- 30 µg/mL cho cả hai loại.
Độ lệch chuẩn tương đối( ±RSD) và độ thu hồi( ±SD) là 2,565; 98,10± 0,68 đến
11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

100,5± 0,95 cho Atorvastatin Canxi; Ezetimib là 2,106; 98,50±0,65 đến 100,9±0,49.
[16]
31.2PhươngpáVo-ame
Abdul và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phân để xác định
Atorvastatin trong mẫu thuốc sử dụng điện cực giọt thủy ngân( HMDE) với đệm
borat ở pH=7,5 thì thu được một píc khử ở -1310 đến -1340mV( E p). Khoảng tuyến
tính là 2-60 µM. Độ lệch chuẩn không vượt quá 3,8% cho nồng độ của Atorvastatin
2,00 µM( 1,117 µg/mL). Phương trình hồi quy được thể hiện qua hệ số tương quan
tương đối tốt( R2= 0,9994) giữa Ip và khoảng nồng độ: 1,117 đến 33,52 µg/mL. Giới
hạn phát hiện( LOD) và giới hạn định lượng( LOQ) lần lượt là 0,129 µg/mL và
0,390 µg/mL. Hiệu suất thu hồi trung bình là 97,2 đến 104,2%.[14]
Korany và cộng sự sử dung phương pháp von-ampe cực phổ xung vi phân và
von-ampe sóng vuông xác định đồng thời Etofibrat, Fenofibrat và Atorvastatin
trong mẫu dược phẩm và huyết tương . Hệ điện cực: điện cực làm việc là điện cực
giọt thủy ngân, điện cực so sánh Ag/AgCl. Độ lệch chuẩn tương đối< 2%. Giới hạn
phát hiện( LOD) và giới hạn định lượng( LOQ) lần lượt là 0,0370- 0,21g/mL và
0,12- 0,71g/mL.[21]
Nevin và cộng sự đã phát triển phương pháp điện hóa để xác định Atorvastatin
trong mẫu dược phẩm và huyết tương. Phương pháp được thực hiện trong đệm BR. Tác giả tiến hành đo bằng hai phương pháp DPV và SqW với điện cực than ở
pH=2. Tác giả đã pha mẫu chuẩn trong hỗn hợp CH 3OH: H2O( 9:1V/V). Trong quá
trình đo bằng phương pháp DPV, tác giả cài đặt các thông số như sau: tốc độ quét:
20mV/s; thời gian điện phân: 20s; thế hấp phụ: 0,4mV; biên độ xung: 50mV. Với
phương pháp SqW, cài đặt các thông số: biên độ xung: 25mV; thời gian hấp phụ:
20s; thế điện phân 0,4mV; bước thế: 4mV; tần số: 15Hz. Khoảng tuyến tính:
3,5×10-7M ÷ 4,7×10-7M. Giới hạn phát hiện là 4,0×10-9M; 2,0×10-9M với DPV và
1,0×10-8M; 2,0×10-8M với SqW.[23]
Tác giả Ramadan và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phân
trên điện cực giọt thủy ngân tĩnh( SMDE) để xác định Atorvastatin trong mẫu dược
phẩm. Tác giả đã pha mẫu chuẩn 15,18 mg Atorvastatin Canxi trong 50 ml dung

dịch gồm metanol và nước có tỉ lệ thể tích là ( 9:1, V/V). Dung dịch đệm được sử
dụng trong quá trình đo là dung dịch đệm borat( gồm 28,5 g Na 2B4O7.10H2O và 26
ml H3PO4 1 M, định mức trong 1000 ml), nồng độ dung dịch đệm được xác định là
0,075 M ; pH = 7,5. Trong quá trình đo, tác giả cài đặt các thông số đo: biên độ
12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

xung 100 mV, khí trơ N 2, thời gian sục khí 200s, khoảng quét thế từ -900mV đến
-1500mV, bước thế 8 mV, thời gian xung 40ms, tốc độ quét thế 5,714mV/s. Kết quả
xác định được cho thấy píc của Atorvastatin xuất hiện trong khoảng thế E p là từ
-1340 đến 1385 mV, % RSD = 3,2 % cho nồng độ AT( 0,0234μg/mL). Giới hạn
phát hiện( LOD) và giới hạn định lượng( LOQ) lần lượt là 0,024 và 0,071 μg/mL.
Hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 %.[24]
Wli Mohammadi đã xác định đồng thời Amlodipin và Atorvastatin Canxi bằng
điện cực graphit biến tính bề mặt bằng nano cacbon. So với điện cực glassy cabon
thì ống nano cacbon có diện tích bề mặt và độ dẫn điện tốt hơn nên có độ nhạy tốt
hơn. Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ thì xác định được khoảng tuyến
tính là 2,5- 100 µg/mL. Độ lệch chuẩn của Amlodipin là 2,7 đến 7,1% và đối với
Atorvastatin Canxi là 1,8 đến 8,3%. Giới hạn phát hiện của 2 chất đều là 1 mg/mL
trong dung dịch đệm pH=6.[28]
Bercu và cộng sự đã nghiên cứu tính chất điện hóa và xác định đồng thời
Amlodipin Besylat và Atorvastatin Canxi sử dụng đạo hàm bậc 1 của phương pháp
Von-ampe tỉ số. Ngiên cứu tính chất điện hóa của Atorvastatin và Amlodipin trên
điện cực than gương, sử dụng các kĩ thuật von-ampe là DP và SqW. Khoảng tuyến
tính : 4×10-6M đến 10-4M cho Amlodipin và 2×10-6M đến 10-4M cho Atorvastatin.
Giới hạn phát hiện( LOD) cuả Amlodipin là 8,01×10 -7M( ±0,22) ; 8,53×107

M( ±0,13) và Atorvastatin là 5,95×10-7M ( ±0,11); 4,7×10-7M( ±0,08) tương ứng
cho DP và SqW. Giới hạn định lượng( LOQ) của Amlodipin là 2,67×10 -6M;
2,84×10-6M cho DP và SqW ; của Atorvastatin là 1,98×10-6M và 1,57×10-6M cho
DP và SqW.[18]
Qua tổng quan tài liệu cho thấy, phương pháp Von-Ampe có giới hạn xác
định tới 2.10-8 M, thời gian xác định nhanh, chính xác. So sánh với các phương pháp
khác thì phương pháp Von-Ampe hòa tan có những lợi thế lớn đó là thiết bị đơn
giản, chi phí thấp, thời gian xác định ngắn, có thể xác định được các chất ở nồng độ
thấp và có tính chất chọn lọc, đặc trưng.
1.3. Giới thiệu phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ
1.3Ngắuyênct
Về cơ sở lý thuyết, phương pháp AdSV khác biệt cơ bản với phương pháp
ASV ở cơ chế của quá trình làm giàu( hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt cực
làm việc).
13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

+ Giai đoạn làm giàu: trong phương pháp AdSV như sau: trước hết phức của
ion kim loại với phối tử hữu cơ được hình thành sau khi thêm phối tử vào dung dịch
phân tích, tiếp theo phức đó được tích luỹ bằng cách hấp phụ điện hóa lên ranh giới
tiếp xúc dung dịch - điện cực làm việc. Trong thời gian làm giàu, thế trên cực làm
việc được giữ không đổi. Thông thường AdSV có thể được thực hiện trên hầu hết
các loại điện cực dùng trong von-ampe, ví dụ như: HMDE, SMDE, Pt, than
nhão( CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học. Tuy
nhiên đa số các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV thường sử dụng điện cực HMDE
do điện cực này có nhiều ưu điểm: bề mặt được tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động

hoá.
Nếu trong dung dịch phân tích, ion kim loại Men+ tạo với phối tử L (giả sử L
là phối tử trung hòa) phức chất MeLnn+ có tính chất hoạt động bề mặt, thì nó có thể
tích luỹ theo trên bề mặt điện cực làm việc theo cơ chế sau:
(1) Trong trường hợp đơn giản nhất, Men+ phản ứng với L theo phản ứng(1).
Phản ứng này xảy ra trong dung dịch và đây là giai đoạn hóa học của quá trình:
Men+ + nL ⇔ MeLnn+ (dd); (dung dịch)

(1)

Tiếp theo, phức hình thành được hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc:
MeLnn+⇔ MeLnn+ (hp); (hấp phụ)
(2) Sự hấp phụ phối tử L xảy ra trước khi tạo thành phức:
nL (dd) ⇔ nL (hp)
Sau đó, phối tử đã hấp phụ phản ứng tạo phức với Men+ (giai đoạn hoá học):
Men+ + nL (hp)⇔ MeLnn+ (hp)
Nếu tốc độ các giai đoạn hấp phụ và hoá học tương đương nhau, thì sự hấp
phụ phối tử và sự tạo phức thực tế xảy ra đồng thời và do vậy rất khó phân biệt.
(3) Ion kim loại Men+ không tạo thành phức chất hoạt động bề mặt với phối
tử L, mà sản phẩm của quá trình oxy hoá hoặc khử điện hoá sẽ phản ứng tạo phức
với phối tử L:
Men+ ± me ⇒ Men ± m
Men ± m + (n ± m) L ⇔ Men ± m L(n ± m)
Men ± m L(n ± m) (dd) ⇔Men ± m L(n ± m) (hp)
14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

(4) Cuối cùng và cũng thường gặp là quá trình làm giàu Men+ xảy ra theo cơ
chế bao gồm cả cơ chế (2) và (3) ở trên:
nL (dd) ⇔ nL (hp)
Men+± me ⇒Men ± m (dd)
Men ± m + (n ± m) L(hp) ⇔ Men ± m L(n ± m) (hp)
+ Giai đoạn hoà tan: thế được quét theo chiều catot (chiều âm hơn) và lúc
này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo ba cơ chế sau:
(1) Khử ion kim loại trong phức chất.
(2) Khử phối tử trong phức chất.
(3) Khử xúc tác hydro.
Trong phương pháp AdSV, khi ghi đường von-ampe hoà tan, có thể sử dụng
các kỹ thuật ghi đường von-ampe như trong phương pháp ASV. Tín hiệu đỉnh trên
đường von-ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo phương pháp AdSV. Tín hiệu
von-ampe hoà tan tỷ lệ thuận với nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên cực
làm việc theo phương trình (1)
Q = n.F.S.C0
Trong đó,
Q : điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ.
n : Số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng.
F (C/mol): hằng số Faraday.
S (cm2): diện tích bề mặt cực làm việc.
C0 (mol/cm2): nồng độ bề mặt của phức hấp phụ trên điện cực.
Với một tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh hoà tan (Ip) tỷ lệ thuận với Q,
nên Ip tỷ lệ với S và C0. Mà C0 tỷ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C),
nên Ip tỷ lệ với S và C: IP = S.C. Để đạt được độ nhạy cao khi phân tích bằng
AdSV, cần tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình hấp phụ. Do vậy, cường độ
dòng píc phụ thuộc vào một số yếu tố: loại điện cực, thời gian tích luỹ, thế tích luỹ,
dung môi, đặc tính bề mặt của chất, diện tích điện cực, lực ion, pH và nhiệt độ.[5]

15


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

21.3Cáhckĩuậtgniđoíòệaấầpâ
1.3.2.1.Kỹ thuật DPV

Điện cực chỉ thị được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên
tuyến tính với tốc độ chậm( vài mV/s), cuối chu kỳ giọt người ta đặt vào một
xung vuông góc với biên độ 10- 100 mV( thường chọn 50 mV), thời gian đặt
xung 40-100 ms, cường độ dòng được ghi 2 lần tại thời điểm 16,7 ms trước
khi nạp xung và ngắt xung.Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này
vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định và có độ phân giải cao. Do vậy
xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điển.
Thông thường các điều kiện được chọn như sau: thời gian giữa các
xung 100 ms; độ dài xung 30ms; thời gian đo 10ms; bước thế 5mV; khi đó tốc
độ quét cũng đạt 50mV/giây. Cho kết quả tốt với cả hệ thuận nghịch và không
thuận nghịch, nhưng không quét được với tốc độ cao.[5]
1.3.2.2.Kỹ thuật SqW
Đặt vào điện cực một thế một chiều biến đổi tuyến tính theo thời gian
và một điện áp xoay chiều vuông góc. Biên độ từ 1 đến 50mV, tần số 50200Hz, nhờ thiết bị đồng bộ ghi được cường độ dòng điện ở gần cuối chu kỳ
giọt. Tại thời điểm này dòng tụ điện bằng không.
Nếu dùng kỹ thuật SQW thì chọn tần số từ 50 đến 100Hz (nếu máy cho
phép); bước thế 5mV, thì tốc độ quét thế đến từ 100 đến 500mV/giây.
Kỹ thuật SQW tỏ ra thích hợp nhất là đối với các hệ thuận nghịch .
1.3.2.3.Kỹ thuật DC
Kỹ thuật này dựa vào cách chọn thời gian ghi tại thời điểm dòng tụ điện

cực tiểu, cường độ dòng cần đo cực đại. Cho píc hấp phụ cân đối, nhưng khi
quét với tốc độ cao, đường von ampe bị dốc.
1.3.2.4.Kỹ thuật xung thường
Điện cực được phân cực bằng điện áp một chiều không đổi trong suốt
thời gian ghi, tại một thời điểm xác định điện cực được phân cực thêm một
xung điện dạng vuông góc có thời gian tồn tại ngắn( 30-50 ms), sau đó xung

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

bị ngắt và cả quá trình phân cực biên độ xung tăng dần, dòng khử cực được
ghi tại thời điểm xác định( thường 16,7 ms trước khi ngắt xung).[5]
31.CácựlàmviệthườngodùrpơV-aeòấụ
1.3.3.1. Cực HMDE

Cực HMDE là loại cực được dùng phổ biến nhất trong phương pháp
von-ampe hòa tan. Nó là một giọt thủy ngân hình cầu kích thước nhỏ được
treo trên đầu cuối của một mao quản có đường kính trong 0,15–0,5 mm. Sau
mỗi phép đo, giọt thủy ngân bị cưỡng bức rơi ra khỏi mao quản và nó được
thay thế bằng một giọt mới tương tự. Một kiểu cực giống với cực HMDE
cũng thường được dùng là cực giọt thủy ngân tĩnh( SMDE) do hãng
PAR( USA) chế tạo. Cực HMDE và SMDE cho kết quả đo có độ chính xác
cao và độ lặp lại cao, có quá thế với hidro lớn khoảng -1,5 V trong môi trường
kiềm và trung tính, -1,2 V trong môi trường axit, nên các cực này có khoảng
điện hoạt rộng, do đó cho phép chúng ta ngiên cứu trong một khoảng thế
rộng. Chúng được dùng rộng rãi để xác định các kim loại, các hợp chất hữu

cơ... Điểm hạn chế của HMDE và SMDE là khó chế tạo, vì rất khó tạo ra các
giọt thủy ngân có kích thước lặp lại hoàn hảo. Ngoài ra chúng không cho
phép xác định các kim loại có thế hòa tan dương.[4]
1.3.3.2. Cực MFE

Cực MFE là một màng mỏng thủy ngân phủ trên bề mặt cực rắn trơ
(thường là cực rắn đĩa quay) có đường kính 2 ÷ 4 mm và làm bằng các loại
vật liệu trơ như than thủy tinh( glassy carbon), graphit, than nhão( paste
carbon)… Cực MFE được chuẩn bị dễ dàng bằng cách điện phân dung dịch
HgII 10-4–10-5 M trên điện cực rắn đĩa ở thể thích hợp( khoảng -0,8 ÷ -1,3 V so
với điện cực Ag/AgCl/KClbh hoặc Hg/Hg2Cl2/KClbh) và trong thời gian thích
hợp( thường khoảng 3–5 phút). Bằng cách như vậy, cực MFE có thể được
hình thành theo 2 kiểu insitu và exsitu.
- Theo kiểu insitu, dung dịch HgII được thêm vào dung dịch phân tích
và như vậy, khi điện phân làm giàu, cực MFE được hình thành đồng thời với
quá trình tập trung chất phân tích lên cực MFE.

17


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

- Theo kiểu exsitu, cực MFE được tạo ra trước bằng cách điện phân
dung dịch HgII như trên, sau đó tia rửa cực cẩn thận bằng nước sạch, rồi
nhúng cực vào dung dịch phân tích để tiến hành nghiên cứu. Cực MFE dạng
exsitu thường có bề dày màng thủy tinh lớn hơn so với dạng insitu.
Cho đến nay, bản chất của cực MFE vẫn còn là vấn đề hấp dẫn các nhà
nghiên cứu. Khi khảo sát các cực MFE được tạo ra theo kiểu insitu và exsitu,

H.Ping Wu cho rằng: cực MFE như một màng mỏng gồm các giọt thủy ngân
nhỏ li ti và liên tục trên cực rắn đĩa, kích thước các giọt thủy ngân đó phụ
thuộc vào lượng thủy ngân trên mặt cực rắn đĩa và thường khoảng từ 0,1 đến
1 μg.
Ngoài những ưu điểm giống như đối với HMDE, cực MFE còn có một
số ưu điểm khác, do nồng độ kim loại trong hỗn hống của cực MFE cao hơn,
tốc độ khuếch tán của kim loại ra khỏi điện cực MFE nhanh hơn và có đặc
điểm của quá trình điện phân lớp mỏng. Mặt khác, có thể sử dụng cực MFE
quay, nên điều kiện đối lưu và đi kèm là sự chuyển khối sẽ tốt hơn, do đó cực
MFE có độ nhạy và độ phân giải cao hơn so với cực HMDE. Nhưng với vấn
đề phân tích các dung dịch có khả năng hòa tan lên bề mặt điện cực thì dùng
cực HMDE và cực SMDE là tốt hơn, có độ nhạy cao hơn.
Nhược điểm: độ lăp lại và độ phục hồi của các phép đo khi đi từ cực MFE
này đến cực MFE khác thường kém hơn so với các cực HMDE và SMDE. [4]
1.3.3.3. Cực rắn đĩa

Cực rắn đĩa là một mặt phẳng hình đĩa có đường kính khoảng 2 ÷ 4 mm
và được làm bằng kim loại vật liệu trơ như than thủy tinh( GC), than nhão
( PC), graphit, graphit ngâm tẩm…Hầu hết các cực rắn đĩa thường dùng để
xác định các kim loại như Mn, Co, Ce, Sb, As… theo phương pháp CSV.
Điện cực rắn được dùng để xác định các kim loại có thế oxi hóa- khử
tương đối dương như Ag, Au, Hg hoặc các kim loại không tan trong thủy
ngân như As, Mn.
Trong bài khóa luận này, chúng tôi sử dụng điện cực làm việc là điện
cực than gương để xác định Atorvastatin bằng phương pháp von-ampe.

18


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

19

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. Nội dung, mục đích và đối tượng nghiên cứu
12.Mụhcđvàíưốợnitgứêu
Mục đích nghiên cứu của đề tài này là: Nghiên cứu quy trình xác định
Atorvastatin bằng phương pháp von-ampe trên điện cực than gương( GC )
2.1Nộidungứhêc
Từ mục đích và đối tượng nghiên cứu trên thì nội dung cần làm gồm các
phần sau:
- Khảo sát các đặc tính điện hóa của Atorvastatin bằng phương pháp vonampe vòng( CV)
- Tối ưu hóa các điều kiện xác định Atorvastatin.
- Khảo sát ảnh hưởng của Amlodipin tới Atorvastatin.
- Đánh giá phương pháp phân tích.
- Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm- Autolab có ghép nối với máy tính và
phần mềm điều khiển.
Hệ đo gồm 3 điện cực:
 Điện cực làm việc: điện cực than gương.
 Điện cực so sánh: Ag/AgCl/KCl bão hòa.
 Điện cực phụ trợ: thanh platin.

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
2.3.1. Thiết bị
Máy đo pH meter TOA –Nhật Bản.
Cân phân tích StarTorius (độ chính xác 0,1 mg).
Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab có ghép nối với máy tính và
phần mềm điều khiển.

20


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

2.3Dụngc
Pipet: 0,50mL; 1,00mL; 2,00mL; 5,00mL; 10,00mL.
Bình định mức: 25,00mL; 50,00mL; 100,0mL.
Cốc: 100mL; 250mL.
32.Hóachất
Chất chuẩn Atorvastatin dạng bột, tinh khiết 99,99%( Mỹ).
Axit axetic( CH3COOH) đặc( Merck).
NaOH( Merck).
Axit boric( H3BO3) ( Merck).
Na2B4O7.10H2O( Merck).
Metanol(CH3OH) ( Merck).
Mẫu thuốc mua tại các hiệu thuốc trên thị trường.
42.3Chuẩnbịdgc
2.3.4.1. Pha dung dịch đệm BR có pH( 4÷12)(dung dịch đệm vạn năng)
Dung dịch A: Dung dịch hỗn hợp 3 axit H3BO4, H3BO3 và CH3CHOOH cùng
ở nồng độ 0,04 M

Dung dịch B: Dung dịch NaOH 0,2 M
Pha dung dịch đệm vạn năng bằng cách trộn hai dung dịch A và B có tỉ lệ
thích hợp

21


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

2.3.4.2. Pha dung dịch gốc Atorvastatin 10-3M
Dung dịch gốc Atorvastatin được pha trong metanol.
Cân 0,01397g chất chuẩn Atorvastatin( M=558,64mg, cân bằng cân phân
tích StarTorius) pha trong 5÷ 7mL metanol, rung siêu âm 15-20 phút và chuyển
vào bình định mức 25,00mL và định mức tới vạch, được dung dịch có nồng độ
10mM.
Dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh, các dung dịch đo có nồng độ
thấp hơn được pha từ dung dịch gốc và dùng trong ngày.
2.4. Xử lý mẫu
Cân mười viên thuốc có hàm lượng của Atorvastatin bằng cân phân tích, đem
nghiền bằng cối mã não. Cân một lượng thuốc chính xác trên cân phân tích, thêm 57mL metanol vào cốc 100mL, rung siêu âm 15- 20 phút cho thuốc tan hết. Lọc dung
dịch bằng giấy lọc băng xanh vào bình định mức 25,00mL. Sau đó pha loãng và đo
trên hệ thiết bị Autolab.
2.5. Đánh giá thông số phân tích
12.5Xâydựngđưhờuẩc
2.5ớGihạnpát(LOệD),gưđịợlcủaơQ
Giới hạn phát hiện( LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà
phương pháp phân tích có thể xác định được. Dựa vào phương trình hồi quy có thể
tính được LOD.

LOD=3
Sy : độ lệch chuẩn
b : hệ số góc.
Giới hạn định lượng( LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân
tích mà hệ thống phân tích định lượng được. LOQ được tính theo phương trình hồi
quy như sau :
LOQ=10
32.5ặĐộạpli
Là đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ x i tiến hành trên các
mẫu thử giống hệt nhau, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong
22


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

cùng điều kiện thí nghiệm( cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí
nghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn).
Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ
lệch chuẩn tương đối (RSD%)
Công thức tính độ lêch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) như sau :
SD =

∑(S

i

− S tb )

2

n −1

Trong đó:
- Si: chiều cao pic
- Stb: chiều cao trung bình của n lần chạy
- n: số lần chạy lặp( n =6)

23

RSD( % ) =

SD
x100
S tb


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát các đặc tính điện hóa của Atorvastatin bằng phương pháp vonampe vòng( CV)
13.KhảosátqurìnấpụcủaAviêựđệgươ.
Để hiểu được quá trình điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực than gương, phương
pháp von-ampe vòng được sử dụng để nghiên cứu.
Điều kiện đo: Nồng độ Atorvastatin 5.10-5M, thế bắt đầu 0V, thế kết thúc
+1,3V, tốc độ quét 10mV/s.

Hình 3: Đường CV tại pH=4. Đường a là đường CV nền đệm khi có thời
gian tích lũy 60s, đường b là đường CV của Atorvastatin 5.10-5M khi không hấp
phụ làm giàu, đường c là đường CV của Atorvastatin 5.10-5M khi hấp phụ làm giàu
60s.
Đường CV ghi trong trường hợp có hấp phụ tại thế 0V, thời gian hấp phụ
60s, có giá trị cường độ dòng tăng gấp 1,5 lần khi không có hấp phụ làm giàu.

24


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẠM THỊ HƯƠNG – K57A

Trên đường phân cực anot( 0V đến +1,3V) có xuất hiện 1 píc anot tại thế Ep
= +1,01V, trên đường phân cực catot(+1,3V đến 0V) không xuất hiện píc nào. Như
vậy, quá trình điện hóa của Atorvastatin là bất thuận nghịch.

Hình 4: Đường von-ampe vòng quét 5 vòng liên tục có hấp phụ 60s tại thế
0V: 1- quét vòng thứ nhất, 2- vòng quét thứ 2; 3,4,5- vòng quét thứ 3,4,5
Đường CV được quét 5 vòng, vòng đầu tiên thì giá trị cường độ dòng cao hơn, 4
vòng sau đó thì giá trị cường độ dòng thấp hơn. Nguyên nhân là do, quét vòng thứ
nhất, Atorvastatin đã được hấp phụ trên bề mặt điện cực tại thế 0V, thời gian hấp
phụ 60s, sau khi quét vòng thứ nhất thì chất phân tích đã được hòa tan ra khỏi bề
mặt điện cực, vòng thứ 2 cao hơn các vòng 3, 4, 5 có lẽ do chất chưa được hòa tan
hoàn toàn ra khỏi bề mặt điện cực. Các vòng 3, 4, 5 thì giá trị cường độ dòng thấp
25