NGHIÊN cứu, xây DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) và ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ
NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH

HỌ VÀ TÊN
( Tác giả luận văn)

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÂN
TÍCH
HỌ VÀ TÊN
( Tác giả luận văn)

2

Lêi c¶m ¬n
Luận văn Thạc sĩ khoa học Hóa học này được hoàn thành tại phòng thí
nghiệm Pphân tích Hóa – Sinh thuộc bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa học,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội với sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của cô
giáo, TS. Vũ Thị Hương cùng các thầy, các cô trong bộ môn Hóa Phân tích
cũng như các thầy, các cô trong khoa Hóa học, sự giúp đỡ của các anh chị
học viên K21 khoa Hóa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô
giáo, TS . Vũ Thị Hương, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Thạc sĩ này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy, các cô trong
Bộ môn Hóa Phân tích, các thầy, các cô trong khoa Hóa học – Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội, các anh chị cùng toàn thể các bạn học viên – khoa Hóa
học đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình giúp đỡ và
động viên trong suốt thời gian học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm.
Cuối cùng em xin được gửi tới gia đình, người thân và bạn bè lời cảm
ơn chân thành nhất đã giúp đỡ em thu nhập thông tin, tư liệu và động viên,
khích lệ tinh thần em trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Tác giả
Đặng Thanh Huyền

3


4


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN----------&----------

TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG
AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍKÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH
GOUT Ở NGƯỜI

Chuyên ngành

:

Hoá phân tích

Mã số

:
60.44.01.18

CHUYÊN NGÀNH

:

Hoá học

Phân tích
MÃ SỐ:

60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC


Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Thị Hương

Họ và tên học viên :
Giáo viên hướng dẫn

Đặng Thanh Huyền
:

TS. Vũ Thị Hương

Hà Nội -– 2013

MỤC LỤC

HỌ VÀ TÊN...........................................................................................................................1

YTHỬ NGHIỆM TRONG ÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC
SĨ....................................................................................................................1
HÀ NỘI, NĂM.......................................................................................................................1
HỌ VÀ TÊN...........................................................................................................................2

YTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
THẠC SĨ.......................................................................................................2


HÀ NỘI, NĂM.......................................................................................................................2
MỤC LỤC..............................................................................................................................2

DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT.......................................................................33
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ..............................................................................................34
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU........................................................................................36
MỞ ĐẦU................................................................................................................................2

2. Mục đích nghiên cứu...............................................................................3
5. Kết quả đạt được......................................................................................4
Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình
phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit
uric trong mẫu nước tiểu của người. (Phần này sẽ viết lại sau khi kết
thúc các thí nghiệm).....................................................................................5
6. Những điểm mới của đề tài.....................................................................5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN...................................................................................................6

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC.............................................6
1.1.1. Thông tin chung.................................................................................6
1.1.2. Tính chất vật lý..................................................................................6
1.1.3. Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric...7
1.1.4. Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ
thể..................................................................................................................8
1.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp...................9
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric11
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO.............................................................................................................12


1.2.1.1. Khái niệm về sắc ký......................................................................12
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC...............................................13
1.2.2.1. Hệ thống bơm................................................................................13
1.2.2.2. Hệ bơm mẫu..................................................................................14

1.2.2.3. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao......................................................14
1.2.2.4. Detector..........................................................................................14
1.2.2.5. Bộ phận ghi tín hiệu......................................................................16
1.2.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng..........................................................................................................17
1.2.3.1. Hệ số phân bố K (Partition coefficient)......................................17
1.2.3.2. Thời gian lưu tR (Retention time)...............................................17
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’......................................................................18
1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α.............................................................................19
1.2.3.5. Lý thuyết đĩa..................................................................................19
1.2.4. Pha tĩnh trong HPLC......................................................................21
1.2.4.1. Phân loại pha tĩnh.........................................................................21
1.2.4.2. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC..............................................22
1.2.5. Pha động trong HPLC.....................................................................23
1.2.6. Chọn pH cho dung dịch đệm..........................................................24
1.2.8. Cách đánh giá picpícpic..................................................................25
1.3. ỨNG DỤNG CỦA HPLC [8].............................................................25
1.3.1. Định tính...........................................................................................25


1.3.2. Phân tích định lượng.......................................................................25
1.3.34. Sắc ký điều chế...............................................................................26
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM
LƯỢNG AXIT URIC [5,6]........................................................................26
1.4.1. Phương pháp quang phổ phân tử...................................................26
1.4.1.1. Quang phổ hấp phụ UV-VIS........................................................26
1.4.1.2. Quang phổ hồng ngoại..................................................................28
1.4.2. Phương pháp điện hóa.....................................................................28
1.4.2.1. Phương pháp cực phổ...................................................................28
1.4.2. Sơ lược về các phương pháp cực phổ và von ampe......................29

1.4.2.1. Nguyên tắc của phương pháp......................................................29
1.4.2.2. Điện cực làm việc..........................................................................30
1.4.2.3. Ưu điểm của điện cực giọt Hg......................................................31
1.4.2.4. Điện cực so sánh............................................................................31
1.4.2.5. Sóng cực phổ khuếch tán..............................................................32
1.5. YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM
NGHIỆM DƯỢC PHẨM [1]....................................................................35
1.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp.....................................................35
1.5.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính...............................................36
1.5.3. Độ đúng.............................................................................................37
1.5.4. Độ chính xác.....................................................................................37
1.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng....................................37


1.5.5.1. Giới hạn phát hiện ( LOD)...........................................................37
1.5.5.2. Giới hạn định lượng ( LOQ)........................................................39
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM...........................................................................................41

2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ....................................................................41
2.1.1. Hóa chất............................................................................................41
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị...........................................................................41
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................41
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................42
2.3.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký................................................43
2.3.1.1. Lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại..........................................43
2.3.1.4. Khảo sát hệ đệm............................................................................44
2.3.1.5. Khảo sát pH hệ đệm......................................................................44
picpicpic2.3.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm.................................45
2.3.1.3. Lựa chọn bước sóng......................................................................45
2.3.1.74. Khảo sátLựa chọn thời gian lưu của chất.................................45

2.3.1.5. Khảo sát lựa chọn hệ đệm............................................................46
2.3.1.6. Khảo sát pH hệ đệm......................................................................46
2.4. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN.........................................................47
2.4.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric......................................47
2.4.2. Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích
picpícpic sắc ký...........................................................................................47


2.5. ĐÁNH GIÁ TÍNH THÍCH HỢP CỦA PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM
TRA ĐƯỜNG CHUẨN.............................................................................47
2.5.1. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp......................................47
ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM TRA ĐƯỜNG CHUẨN......48
2.5.21. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký...............................48
2.5.23. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp...........................................48
2.5.4. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp......................................49
2.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT
URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU.........................................................49
2.6.1. Xử lý mẫu nước tiểu........................................................................49
2.6.2. Phương pháp xử lý kết quả.............................................................50
2.6.2.1. Nguyên tắc xử lý kết quả..............................................................50
đo mẫu..........................................................................................................................50

2.7. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ................................................50
2.7.1. Nguyên tắc xử lý kết qu ả...................................................................................50
Các số liệu thực nghiệm được kiểm tra sai số thô và xử lý tính toán theo công thức
của các đại lượng thống kê. Xử lý đường chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính
sử dụng chương trình pascal và phần mềm Origin 8.0.................................................50

2.6.2.2. Cách xử lý......................................................................................50
2.6.2.3. Kiểm tra đường chuẩn..................................................................53

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................55

3.1. Xây dựng điều kiện để định tính axit uric........................................55
3.1.1. Lựa chọn phương pháp sắc ký........................................................55


3.1.1.1. Chọn bước sóng hấp thụ cực đại.................................................55
3.1.1.2. Khảo sát thành phần pha động....................................................56
3.1.1.3. Khảo sát tốc độ dòng....................................................................57
3.1.1.4. Khảo sát hệ đệm............................................................................58
3.1.1.5. Khảo sát pH hệ đệm......................................................................59
3.1.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm................................................61
3.1.1.7. Khảo sát thời gian lưu..................................................................63
.....................................................................................................................64
3.1.2. Đánh giá tính thích hợp của phương pháp và kiểm tra đường
chuẩn...........................................................................................................65
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric............................................65
3.1.2.3. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký..............................69
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký..............................70
3.1.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp...........................................71
3.2.2. Các kết quả đo mẫu nước tiểu........................................................73
K...........................................................................................................................................84
iệnpic,picpic,picpicpicpic.....................................................................................................84
..............................................................................................................................................84
2.7.2.1. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu..........................84
Xây dựng đường chuẩn Spic = f(C) theo phương pháp hồi quy tuyến tính, từ đó chọn được
khoảng nồng độ tối ưu mà tại đó diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của mỗi
chất.......................................................................................................................................85
Tìm đường chuẩn dạng: y=ax+b (2.2)..................................................................................85

(2.3).....................................................................................................................................85
(2.4).....................................................................................................................................85
Tính độ lệch chuẩn s:...........................................................................................................85
Thay xi vào phương trình (2.2) vừa tìm, được tính theo lý thuyết.......................................85
Độ lệch chuẩn :.....................................................................................................................85
(2.5).....................................................................................................................................85
(2.6).....................................................................................................................................85
(2.7).....................................................................................................................................85
Trong đó (2.8).......................................................................................................................85
Độ lệch chuẩn tương đối:.....................................................................................................85
Trong đó: Xi là kết quả của lần xác định thứ i.....................................................................85
n là số lần xác định...............................................................................................................86
Đường chuẩn y=(a ± t.sa)x + (b ± t.sb) (2.9).......................................................................86
t là thừa số studen lý thuyết với độ tin cậy thống kê là 95%, hệ số tự do f=n-2..................86
* Đánh giá tính có ý nghĩa của hệ số b.................................................................................86
- Nếu t.sb> b thì b là giá trị không có nghĩa, chấp nhận b=0, tính lại phương trình đường
chuẩn theo dạng y=ax...........................................................................................................86
- Nếu t.sb< b thì b có nghĩa, đúng là b ≠ 0...........................................................................86
** Đánh giá độ đúng của đường chuẩn:...............................................................................86
Pha dung dịch cloram có nồng độ µX coi như chưa biết, ghi đường cực phổ, thay giá trị Yj
vào phương trình đường chuẩn được nồng độ Xj, lặp lại m lần, j = 1÷m............................86
..............................................................................................................................................86
(2.10)....................................................................................................................................86
..............................................................................................................................................86
(2.11)....................................................................................................................................86


..............................................................................................................................................86
(2.12)....................................................................................................................................86

..............................................................................................................................................86
(2.13)....................................................................................................................................86
Giả thuyết thống kê..............................................................................................................87
H0: X ≠ µX do ngẫu nhiên...................................................................................................87
Ha: X ≠ µX không do ngẫu nhiên với độ tin cậy 95%.........................................................87
(2.14)...................................................................................................................................87
So sánh t với tb (0,05; m-1)..................................................................................................87
- Nếu t > tb chấp nhận Ha, X ≠µX đường chuẩn vừa tìm được không phù hợp với độ tin
cậy 95%................................................................................................................................87
- Nếu t < tb chấp nhận H0, X ≠µX chỉ do ngẫu nhiên, đường chuẩn vừa tìm được là phù
hợp........................................................................................................................................87
2.7.2.2. Kiểm tra đường chuẩn.............................................................................................87
Thực nghiệm:.......................................................................................................................87
- Pha mỗi chất hai dung dịch có nồng độ xác định µX1 , µX2 từ các dung dịch chuẩn ban
đầu........................................................................................................................................87
- Hút 10µl sau đó bơm vào sắc ký và chạy sắc ký với điều kiện sắc ký đó chọn ở trên. Mỗi
chất làm lặp lại 7 lần (m=7) cho mỗi nồng độ.....................................................................87
- Sử dụng đường chuẩn tính X1 và X2, so sánh với hai giá trị đã pha µX1, µX2...............87
- Tính giới hạn phát hiện của phương pháp, so sánh với thực nghiệm................................87
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................88
Trong luận văn này, tôi tập trung nghiên cứu điều kiện tối ưu phân tích axit uric trên cơ sở
thiết bị, máy móc, hóa chất, môi trường thí nghiệm ở Việt Nam. Mục đích là dựa trên các
điều kiện này xác định được định tính và định lượng axit uric có trong nước tiểu một cách
nhanh chóng, hiệu quả và chính xác.....................................................................................88


3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric......................................................................88
3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký.....................................................................................88
Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của axit uric, kết hợp với các điều kiện tài liệu tham khảo
và điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm, tôi lựa chọn kiểu sắc ký phân bố pha đảo, sử

dụng cột Silica C18 làm pha tĩnh. Trong quá trình thực nghiệm tôi đã tiến hành khảo sát
các điều kiện sắc ký như: khảo sát các điều kiện về bước sóng hấp thụ cực đại, thành phần
dung môi pha động, tốc độ dòng, lựa chọn hệ đệm với nồng độ và pH thích hợp thích hợp,
thời gian lưu tối ưu cần tiêm vào cột sắc ký.........................................................................88
3.1.1.1 Chọn bước sóng cực đại...........................................................................................88
Việc lựa chọn bước sóng dựa trên cơ sở các tài liệu tham khảo. Axit uric hấp thụ ánh sáng
ở vùng tử ngoại, vì vậy để xác định bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của axit
uric tôi khảo sát trong vùng bước sóng từ 180 nm đến 400 nm. Kết hợp với khảo sát thực
nghiệm: tiến hành bơm mẫu và đợi khi píc gần lên tới đỉnh cao nhất, tiến hành quét bước
sóng trong khoảng từ 180 nm đến 400 nm trên detector UV, tôi đã chọn được bước sóng
tối ưu để phân tích axit uric là 284nm. Đường nền thẳng, píc xuất hiện với thời gian lưu
phù hợp. Vì vậy tôi quyết định chọn bước sóng 284 nm để phát hiện ra axit uric, kết quả
được đưa ra trong hình 3.1:..................................................................................................89
..............................................................................................................................................89
Hình 3.1. Sắc đồ quét phổ của axit uric................................................................................89
Dựa vào kết quả trên hình 3.1 ta thấy axit uric hấp thụ bức xạ tử ngoại cực đại tại bước
sóng 285 nm. Do đó, ta có thể chọn bước sóng tại 285 nm hoặc dao động xung quanh giá
trị này (cộng trừ 10 nm) để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này bước
sóng 284 nm được sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo......................................89
3.1.1.2 Khảo sát thành phần pha động.................................................................................90
Thành phần pha động là một trong các yếu tố quyết định chính đến độ chọn lọc và độ nhạy
của phương pháp HPLC đối với đối tượng cần phân tích. Về nguyên tắc thì ta sẽ chọn pha
động sao cho phù hợp với chất cần phân tích đó là pha động phải có ái lực với pha tĩnh nhỏ
hơn bất kỳ cấu tử nào cần tách trong mẫu. Khi đó, các cấu tử cần tách di chuyển với tốc độ


chậm hơn so với chất rửa giải. Chất nào có ái lực càng cao với pha tĩnh thì bị giữ lại trên
cột tức là di chuyển càng chậm qua cột................................................................................90
Vì axit uric là chất có độ phân cực trung bình và cột được sử dụng trong máy HPLC là cột
ODS C18 - cột có thành phần là octyldecyl, dung môi phù hợp với nó là acetronitril,

methanol và nước cất. Do đó, thành phần pha động được nghiên cứu khảo sát là phần trăm
thể tích của 3 loại dung môi trên..........................................................................................90
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thành phần pha động tới chiều cao và diện tích píc của axit uric
..............................................................................................................................................90
Thành phần pha động...........................................................................................................90
Tỉ lệ pha động (%V).............................................................................................................90
Spíc(mAU)...........................................................................................................................90
Metanol.................................................................................................................................90
Nước cất...............................................................................................................................90
Acetronitril...........................................................................................................................90
Hỗn hợp 1.............................................................................................................................90
50..........................................................................................................................................90
35..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
2938999................................................................................................................................90
Hỗn hợp 2.............................................................................................................................90
60..........................................................................................................................................90
30..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
3484525................................................................................................................................90
Hỗn hợp 3.............................................................................................................................90
65..........................................................................................................................................90


25..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
3353691................................................................................................................................90
Hỗn hợp 4.............................................................................................................................90
70..........................................................................................................................................90
20..........................................................................................................................................90

10..........................................................................................................................................90
3152081................................................................................................................................90
Hỗn hợp 5.............................................................................................................................90
75..........................................................................................................................................90
15..........................................................................................................................................90
10..........................................................................................................................................90
2943591................................................................................................................................90
Từ kết quả thu được, ta thấy với thành phần pha động gồm 60% methanol – 30% nước cất
– 10% acetronitril về thể tích thì cho kết quả píc cân đối, diện tích và chiều cao píc lớn
nhất. Do đó, tỉ lệ này được chọn làm thành phần pha động trong các nghiên cứu tiếp theo.
..............................................................................................................................................91
..............................................................................................................................................91
Hình 3.2. Sắc đồ của axit uric với thành phần pha động gồm 60% methanol – 30% nước
cất – 10% acetronitril, tốc độ dòng là 0,5 ml/phút trong dung dịch đệm photphat pH = 3.2
..............................................................................................................................................91
3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng..............................................................................................91
Tôi tiến hành chạy sắc ký của dung dịch mẫu chuẩn ở các tốc độ khác nhau: 0,25; 0,35;
0,5; 0,75; 1; 1,5 ml/phút. Kết quả cho thấy với tốc độ dòng 0,5 ml/phút các píc được tách
tốt, áp suất cột vừa phải và thời gian lưu ngắn. Vì vậy tôi chọn tốc độ dòng là 0,5 ml/phút
để nghiên cứu định lượng các chất.......................................................................................91


Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ dòng tới chiều cao và diện tích píc của axit uric.............91
Tốc độ dòng..........................................................................................................................92
Nồng độ (mg/l).....................................................................................................................92
tR (phút)...............................................................................................................................92
Spíc(mAU)...........................................................................................................................92
0,25.......................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
Không xuất hiện píc.............................................................................................................92

-.............................................................................................................................................92
0,35.......................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
6.392.....................................................................................................................................92
3227102................................................................................................................................92
0,5.........................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
3,936.....................................................................................................................................92
5179608................................................................................................................................92
0,75.......................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
2,634.....................................................................................................................................92
3234832................................................................................................................................92
1............................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
Không xuất hiện píc.............................................................................................................92
-.............................................................................................................................................92


1,5.........................................................................................................................................92
50..........................................................................................................................................92
Không xuất hiện píc.............................................................................................................92
-.............................................................................................................................................92
3.1.1.4. Khảo sát hệ đệm......................................................................................................93
Hệ đệm cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích hàm lượng axit
uric bằng phương pháp HPLC. Trong nghiên cứu này, một số dung dịch đệm được dùng để
khảo sát. Kết quả khảo sát được đưa ra trong bảng 3.3........................................................93
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến thời gian lưu, diện tích píc của axit uric.....93
Giá trị pH..............................................................................................................................93
tR (phút)...............................................................................................................................93

Spíc (mAU)..........................................................................................................................93
Nước cất...............................................................................................................................93
3,932.....................................................................................................................................93
1595096................................................................................................................................93
Đệm photphat.......................................................................................................................93
pH = 6,0................................................................................................................................93
3,936.....................................................................................................................................93
5076680................................................................................................................................93
Đệm amoni...........................................................................................................................93
pH = 8,0................................................................................................................................93
7,534.....................................................................................................................................93
3265710................................................................................................................................93
Đệm amoni...........................................................................................................................93
pH = 9,0................................................................................................................................93


7,534.....................................................................................................................................93
2766436................................................................................................................................93
Đệm axetat............................................................................................................................93
pH=5,5..................................................................................................................................93
7.400.....................................................................................................................................93
2177910................................................................................................................................93
Từ kết quả trong bảng 3.3 đưa ra được những nhận xét sau:..............................................94
Thứ nhất, xét trong cùng dung dịch đệm amoni, ta thấy tại pH = 8,0 cho thấy việc xác định
axit uric là tốt, tín hiệu píc cao hơn so với dùng đệm amoni có pH = 9,0. Hơn nữa, dùng
đệm amoni pH = 9,0 thì tín hiệu píc không cân đối, diện tích píc (2766436 mAU) thấp hơn
so với trường hợp pH = 8,0 (3265710 mAU) tại cùng một nồng độ. Song, việc sử dụng
đệm amoni so với việc chỉ sử dụng nước cất thì diện tích píc thu được cao hơn so với diện
tích píc thu trong nước (1595096mAU) và đệm axetat (2177910mAU).............................94
Thứ hai, ở cùng một nồng độ axit uric như nhau, các điều kiện khác như nhau thì việc dùng

đệm photphat pH = 6 cho diện tích píc (5076680mAU) cao hơn so với khi dùng đệm
amoni, đệm axetat và nước cất.............................................................................................94
Bên cạnh đó, trong trường hợp sử dụng dung dịch đệm amoni thì thời gian lưu tương ứng
là 7,534 phút còn đối với đệm photphat là 3,936 phút. Thời gian lưu quá dài dẫn tới tốn
kém về mặt dung môi và thời gian phân tích. Thông thường, thời gian lưu tốt nhất cho một
mẫu chất nên xuất hiện ở phút từ 1 đến 5.............................................................................94
Từ những phân tích trên, trong nghiên cứu này, dung dịch đệm phophat được lựa chọn sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.......................................................................................94
3.1.1.5. Khảo sát pH đệm.....................................................................................................94
Việc lựa chọn được môi trường cho kết quả định lượng là tối ưu nhất đặt ra vấn đề phải
khảo sát để tìm ra giá trị pH đáp ứng yêu cầu đó. Trên cơ sở chọn được hệ đệm photphat ta
tiến hành chuẩn bị các dung dịch đệm photphat có lần lượt các giá trị pH tương ứng là 2, 4,
6, 8, 9, 10. Để so sánh tính hiệu quả của phép phân tích định lượng axit uric trong các môi
trường pH này thì tiến hành cân cùng một lượng mẫu axit uric như nhau pha trong cùng


một thể tích xác định các dung dịch đệm đã chuẩn bị. Tiến hành đo trong cùng một điều
kiện đo và ghi lại thời gian lưu, diện tích píc. Từ đó so sánh, nhận xét khả năng của mỗi
môi trường pH trên đối với sự định lượng axit uric.............................................................95
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat đến thời gian lưu, diện tích píc
của axit uric..........................................................................................................................95
Giá trị pH..............................................................................................................................95
tpíc (phút)............................................................................................................................95
Spíc(mAU)...........................................................................................................................95
2,0.........................................................................................................................................95
3,936.....................................................................................................................................95
1921030................................................................................................................................95
4,0.........................................................................................................................................95
3,936.....................................................................................................................................95
1700990................................................................................................................................95

6,0.........................................................................................................................................95
3,936.....................................................................................................................................95
2076680................................................................................................................................95
8,0.........................................................................................................................................95
3,936.....................................................................................................................................95
4354859................................................................................................................................95
9............................................................................................................................................95
3.933.....................................................................................................................................95
2975852................................................................................................................................95
10..........................................................................................................................................95
3,932.....................................................................................................................................95


3808280................................................................................................................................95
Từ kết quả trong bảng 3.4 ta thấy trong cùng một lượng chất và điều kiện như nhau, tại pH
= 8, Spíc đạt giá trị cao nhất (4354859 mAU). Vì vậy, việc phát hiện cũng như xác định
axit trong môi trường kiềm thì thuận lợi hơn. Píc của chất xuất hiện ở pH = 8 là cân đối và
có chiều cao cũng như diện tích lớn nhất đối với khoảng pH khá rộng trên. Tuy nhiên để
tìm pH thực sự tối ưu cho phép phân tích trên tôi sẽ khảo sát quanh giá trị pH=8 lần lượt
các giá trị tương ứng:............................................................................................................96
7,15; 7,5; 7,7; 8; 8,4; 8,7......................................................................................................96
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat quanh giá trị pH=8 đến thời
gian lưu, diện tích píc của axit uric......................................................................................96
Giá trị pH..............................................................................................................................96
tpíc (phút).............................................................................................................................96
Spíc(mAU)...........................................................................................................................96
7,15.......................................................................................................................................96
3,934.....................................................................................................................................96
2145000................................................................................................................................96
7,5.........................................................................................................................................96

3.826.....................................................................................................................................96
3170130................................................................................................................................96
7,7.........................................................................................................................................96
3,936.....................................................................................................................................96
3353748................................................................................................................................96
8,0.........................................................................................................................................96
3,936.....................................................................................................................................96
4354859................................................................................................................................96
8,4.........................................................................................................................................96


3.973.....................................................................................................................................96
3672993................................................................................................................................96
8,7.........................................................................................................................................96
3.935.....................................................................................................................................96
3378834................................................................................................................................96
Từ bảng 3.5 ta thấy trong cùng một lượng chất và điều kiện như nhau, tại pH = 8 diện tích
đạt giá trị cao nhất (4354859 mAU). Do vậy, trong nghiên cứu này tôi lựa chọn dung dịch
đệm photphat có pH = 8 để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo....................................97
..............................................................................................................................................97
Hình 3.3. Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat có pH=8..............................97
3.1.1.6. Khảo sát nồng độ đệm.............................................................................................97
Cùng với pH của dung dịch đệm chất điện ly trong pha động cũng có vai trò quan trọng và
nó phải có nồng độ phù hợp. Việc lựa chọn nồng độ dung dịch đệm dựa trên tài liệu tham
khảo, các nồng độ dung dịch đệm được lựa chọn khảo sát trong khoảng 2.10-3M – 0,2M.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.6...................................................................97
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm photphat đến thời gian lưu, diện tích píc
của axit uric..........................................................................................................................97
Nồng độ đệm(M)..................................................................................................................98
tpíc (phút).............................................................................................................................98

Spíc(mAU)...........................................................................................................................98
2.10-3M................................................................................................................................98
3,957.....................................................................................................................................98
2468384................................................................................................................................98
5.10-3M................................................................................................................................98
3,964.....................................................................................................................................98
2615401................................................................................................................................98


7.10-3M................................................................................................................................98
3,951.....................................................................................................................................98
3226548................................................................................................................................98
0,01M...................................................................................................................................98
3,959.....................................................................................................................................98
4337587................................................................................................................................98
0,03M...................................................................................................................................98
3,958.....................................................................................................................................98
3667346................................................................................................................................98
0,07M...................................................................................................................................98
3,951.....................................................................................................................................98
2524749................................................................................................................................98
0,1M.....................................................................................................................................98
3,953.....................................................................................................................................98
2238577................................................................................................................................98
0,2M.....................................................................................................................................98
3,957.....................................................................................................................................98
-.............................................................................................................................................98
Từ kết quả trong bảng 3.6 ta thấy trong cùng một lượng chất và điều kiện như nhau, tại
nồng độ 0,01M píc cân đối, diện tích đạt giá trị cao nhất (4337587mAU). Do vậy, trong
nghiên cứu này tôi lựa chọn dung dịch đệm photphat có nồng độ 0,01M để tiến hành sắc ký

trong các thí nghiệm tiếp theo của luận văn này..................................................................99
..............................................................................................................................................99
Hình 3.4. Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat nồng độ 0,01M....................99
Từ các kết quả khảo sát, em đã xây dựng một quy trình sắc ký có khả năng phân tích xác
định nồng độ axit uric như sau:............................................................................................99


- Pha tĩnh: Cột ODS C18 (5µm, 4,6 x 150 cm)....................................................................99
- Pha động: 60% methanol – 30% nước cất – 10% acetronitril; dung dịch đệm KH2PO4 +
KOH có pH = 8,0 (nồng độ đệm 0,01M).............................................................................99
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút...................................................................................................99
- Thời gian chạy mẫu: 10 phút.............................................................................................99
- Thể tích mẫu phân tích tối thiểu cần bơm vào cột sắc ký: 10 µl.....................................100
- Phát hiện bằng detector UV: bước sóng 284 nm.............................................................100
- Nhiệt độ phân tích: 40°C..................................................................................................100
Qua thực nghiệm với điều kiện sắc ký như trên, axit uric xuất hiện ở thời gian lưu vừa
phải, píc cân đối và gọn......................................................................................................100
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng...........................................................................100
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric.......................................................................100
Cân chính xác 5mg chất chuẩn axit uric, sau đó thêm đệm photphat (pH=8) vào bình định
mức 100ml và lắc sau đó định mức đến vạch định mức thu được dung dịch axit uric chuẩn
có nồng độ chính xác..........................................................................................................100
3.1.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.........................................................100
Để đánh giá một phép định lượng bằng HPLC mới xây dựng, trước hết ta phải tiến hành
khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.......................................................................100
Việc khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được tiến hành qua việc tiêm lặp lại 6 lần
dung dịch chuẩn axit uric đã được chuẩn bị như 3.1.2.1. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu
(đại lượng có giá trị định tính axit uric), diện tích píc (đại lượng có giá trị định lượng axit
uric), độ phân giải giữa hai píc. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên các
giá trị độ lệch chuẩn tương đối về tR, Spíc, RS. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ

thống HPLC được trình bày ở bảng 3.7.............................................................................100
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký đối với axit uric..............101
STT.....................................................................................................................................101
tpíc (phút)...........................................................................................................................101