Nghiên cứu vi sinh vật sinh methane ứng dụng cho sản xuất biogas trong điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THU HOÀI

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG
CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THU HOÀI

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG
CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 62 420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Đinh Thúy Hằng
2. GS. TS. Nguyễn Lân Dũng

Hà Nội - 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác cùng
với các cộng sự khác.
Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tập san và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của
các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hoài


LỜI CẢM ƠN
Thành công của Luận án này là kết quả của sự cố gắng nỗ lực bản thân
trong suốt quá trình nghiên cứu, tìm hiểu đề tài. Đồng thời bản thân tôi còn
nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô hướng dẫn, các anh
chị và các bạn đồng nghiệp.
Trước tiên, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ
Phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phòng Công nghệ Enzyme - Protein của Viện Vi
sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội vì đã tạo mọi điều
kiện, giúp đỡ về cơ sở vật chất cũng như khích lệ tôi trong quá trình thực tập
Nghiên cứu sinh.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi cảm ơn tới TS. Đinh Thúy
Hằng - Trưởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ

sinh học - ĐHQGHN là người trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và
chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Đồng gửi lời
cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Lân Dũng - chuyên gia cao cấp của Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học - người đã cho tôi nhiều lời khuyên bảo và giúp đỡ
trong thời gian nghiên cứu luận án.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Vi sinh vật
và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cơ sở vật
chất giúp tôi hoàn thành Luận án này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Thường vụ Đảng ủy, Ban Tổng Giám
đốc Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã tạo điều kiện giúp đỡ và khuyến khích,
động viên tôi trong suốt quá trình làm Nghiên cứu sinh.
Tôi mong muốn được cảm ơn đến Phân viện trưởng và các bạn đồng
nghiệp của Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã


nhiệt tình giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thời gian và cơ sở vật chất
trong suốt thời gian tham gia làm Nghiên cứu sinh.
Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
- Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật, các thầy cô giáo của Bộ môn Vi sinh vật học
và Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN đã trực
tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong khóa học Nghiên cứu sinh.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015

Nguyễn Thu Hoài


MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục

1

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

5

Danh mục các bảng

6

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

7

MỞ ĐẦU

10

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

12

Xử lý chất thải hữu cơ theo công nghệ phân hủy kỵ khí sinh
methane trong điều kiện nhiễm mặn

12

1.1.1. Ô nhiễm chất thải hữu cơ trong môi trường nhiễm mặn

12

1.1.2. Xử lý ô nhiễm chất hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí

14

1.1.3. Xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí trong điều kiện
nhiễm mặn

18

1.2.

Bản chất sinh học của phân hủy kỵ khí sinh methane

21

1.3.

Đa dạng di truyền và đặc tính sinh học của VSVSMT

25

1.3.1. Phân bố của VSVSMT trong tự nhiên

25

1.3.2. Vị trí phân loại của VSVSMT

26

1.3.3. Đặc tính sinh học của VSVSMT

30

1.4.

1.3.3.1. Cơ chất của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane

30

1.3.3.2. Sinh hóa của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane

32

1.3.3.3. Một số phương pháp nghiên cứu quần xã VSVSMT

35

1.3.3.4. VSVSMT trong môi trường nước lợ và nước biển

37

Công nghệ xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí sinh
methane

40

1.4.1. Một số công nghệ phổ biến

40

1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phân hủy kỵ khí sinh methane

43

1.4.2.1. Cân bằng dinh dưỡng

43

1.4.2.2. Các yếu tố lý hóa và sinh học

44

1


1.5.

Nghiên cứu về VSVSMT và công nghệ phân hủy kỵ khí tạo biogas
ở Việt Nam

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

46
48
48

2.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

48

2.1.2. Hóa chất, môi trường và thiết bị

48

2.2. Phương pháp nghiên cứu

49

2.2.1. Làm giàu và phân lập VSVSMT

49

2.2.1.1. Làm giàu VSVSMT

49

2.2.1.2. Phân lập VSVSMT

50

2.2.2. Nghiên cứu các đặc tính sinh học của VSVSMT

51

2.2.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái

51

2.2.2.2. Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sinh
trưởng của VSVSMT

51

2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết

52

2.2.3.1. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường

52

2.2.3.2. Tách DNA tổng số của chủng thuần khiết

53

2.2.3.3. Điện di DNA trên gel agarose

54

2.2.4. Phương pháp PCR- DGGE

54

2.2.4.1. Khuếch đại đoạn 16S rDNA cho phân tích DGGE

54

2.2.4.2. Điện di biến tính DGGE

55

2.2.4.3. Cắt băng và thôi gel

55

2.2.5. Phân tích trình tự 16S rDNA của các chủng VSVSMT

56

2.2.6. Thiết lập và phân tích thư viện gen mcrA(clone library)

57

2.2.6.1. Nhân PCR và tinh sạch sản phẩm

57

2.2.6.2. Phản ứng ghép nối gen vào vector

57

2.2.6.3. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5α
bằng phương pháp sốc nhiệt

57

2.2.6.4. Tách dòng và giải trình tự gen mcrA

58

2.2.6.5. Phân tích trình tự gen mcrA và dựng cây phân loại

59

2


2.2.7. Phân tích hóa học

59

2.2.7.1. Phân tích COD hòa tan

59

2.2.7.2. Xác định hàm lượng muối trong nước

60

2.2.7.3. Xác định tổng thể tích khí sinh ra trong quá trình phân hủy kỵ khí

61

2.2.7.4. Xác định hàm lượng methane trong mô hình thí nghiệm

61

2.2.7.5. Xác định hoạt tính sinh methane

62

2.2.8. Thiết lập mô hình phân hủy kỵ khí chất thải hữu cơ ở điều kiện
nước lợ và nước mặn

63
64

2.3. Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà

65
65

3.1.1. Làm giàu VSVSMT trong môi trường nước lợ

65

3.1.2. Làm giàu VSVSMT trong môi trường nước mặn

67

3.2. VSVSMT chiếm ưu thế trong các mẫu làm giàu

70

3.2.1. Mẫu làm giàu bằng methanol và acetate

70

3.2.2. Mẫu làm giàu bằng rong biển Ulva sp.

72

3.2.2.1. Phân tích bằng PCR-DGGE đoạn 16S rDNA
3.2.2.2. Đánh giá VSVSMT trong mẫu làm giàu bằng rong biển qua
thư viện gen mcrA

72
73

3.3. Phân lập VSVSMT từ các mẫu làm giàu

78

3.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng VSVSMT phân lập

84

3.4.1. Khả năng sinh methane của các chủng VSVSMT phân lập

84

3.4.2. Ảnh hưởng của độ mặn tới sinh trưởng của hai chủng M7 và M37

86

3.4.3. Các đặc điểm sinh học của chủng M37

88

3.5. Tạo nguồn VSVSMT để hỗ trợ quá trình phân hủy kỵ khí ở điều kiện
nước lợ và nước mặn

93

3.5.1. Lựa chọn nguồn VSVSMT phù hợp

93

3.5.2. Tạo giống khởi động VSVSMT

95

3.5.3. Bảo quản nguồn VSVSMT trong điều kiện phòng thí nghiệm

99

3

3.6.Thiết lập và vận hành mô hình kỵ khí xử lý chất thải hữu cơ theo
phương pháp phân hủy kỵ khí sinh methane ở điều kiện nước lợ và nước
mặn

99

3.6.1. Thiết lập mô hình

99

3.6.2. Vận hành mô hình

101

3.6.3. Đánh giá VSVSMT chiếm ưu thế trong các mô hình

105

KẾT LUẬN

108

KIẾN NGHỊ

109

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN

110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

111

PHỤ LỤC

4


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AF

Anaerobic Filter

Bp

Base pair

BKM

Bùn kỵ khí ưa mặn

BSA

Bovin serum albumin

VSVSMT

Vi sinh vật sinh methane

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

COD

Chemical oxygen demand

DGGE

Denaturing gradient gel electrophoresis

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate

EDTA

Ethylenediamintetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropylthio - β - D – glucosamine

LB

Môi trường Luria – Bertani

mcrA

Đoạn gen mã hóa cho tiểu phần α của methyl - coenzyme M
reductase

MPN

Most probable number

MQ

Mili – Q

SDS

Sodium dodecyl sunfate

TAE

Tris – acetate – EDTA

TE

Tris – EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

PCI

Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Realtime PCR

UASB

Upflow Anaerobic Sludge Blanket

X-Gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Đặc điểm các chi thuộc 5 bộ VSVSMT

28

2.1

Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE

55

2.2

PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA để định danh VSVSMT

56

3.1

VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 bằng rong biển Ulva
sp.

75

3.2

VSVSMT phân lập từ các mẫu làm giàu của trầm tích biển
Nha Trang và Cát Bà

79

3.3

Vị trí phân loại của mười chủng VSVSMT phân lập dựa trên
so sánh trình tự đoạn 16S rDNA

82

3.4

Khả năng sinh khí biogas và mức độ phát huỳnh quang của tế
bào ở các chủng VSVSMT phân lập

85

3.5

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh trưởng của hai chủng
VSVSMT M7 và M37

86

3.6

Nguồn hữu cơ trong các mô hình

101

3.7

Sự biến động của COD (mg/L) trong các mô hình nghiên cứu

102

6


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Một số nguồn chất thải hữu cơ tại các vùng ven biển Việt Nam

13

1.2

Chuyển hóa cacbon hữu cơ trong phân hủy hiếu khí và kỵ khí

14

1.3

Hầm biogas loại nhỏ phổ biến ở các gia đình nông thôn Việt
Nam

17

1.4

Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí sinh
methane

21

1.5

Vi khuẩn acetogen và VSVSMT trong bùn kỵ khí từ bể biogas

24

1.6

Cây phân loại thể hiện vị trí của VSVSMT so với các ngành cổ

khuẩn khác dựa trên trình tự 16S rRNA

27

1.7

Hình thái tế bào của một số loài VSVSMT đã được mô tả

29

1.8

Con đường hình thành methane từ acetate, methanol và CO2

32

1.9

Sơ đồ mcr-operon ở VSVSMT Methanosarcina mazei

33

1.10

Hình ảnh VSVSMT dưới kính hiển vi huỳnh quang

34

1.11

Cơ chế tác động của các chất ức chế oxyanion nhóm VI tới quá
trình khử sulfate ở vi khuẩn khử sulfate

39

1.12

Bể tự hoại hai ngăn

40

1.13

Sơ đồ bể biogas xử lý chất thải có hàm lượng hữu cơ cao

41

1.14

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của bể UASB

42

1.15

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của tầng lọc kỵ khí

42

2.1

Rong biển (Ulva sp.) sử dụng trong thí nghiệm phân hủy kỵ khí
sinh methane

48

2.2

Các bước phân lập chủng thuần khiết VSVSMT bằng phương
pháp ống thạch bán lỏng

50

2.3

Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí
sinh ra từ bể phân hủy kỵ khí

61

2.4

Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng methane trên thiết bị sắc ký khí

62

2.5

Mô hình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ sinh methane và hệ thống
đo tổng lượng khí sinh ra bằng phương pháp cột nước

63

7


2.6

Sơ đồ các bước nghiên cứu

64

3.1

Khí tạo thành trong các mẫu làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển
Nha Trang và Cát Bà trong môi trường nước lợ bằng các cơ chất
khác nhau

66

3.2

Khí tạo thành trong các mẫu làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển
Nha Trang và Cát Bà trong môi trường nước mặn bằng các cơ
chất khác nhau

68

3.3

Gel điện di biến tính DGGE phân tích 16S rDNA của VSVSMT
trong các mẫu làm giàu từ trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà

70

3.4

Gel điện di biến tính DGGE phân tích 16S rDNA của VSVSMT
trong các mẫu làm giàu từ trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà
bằng rong biển Ulva sp.

72

3.5

Cấu trúc quần xã VSVSMT của mẫu làm giàu NTLRE3 dựa trên
phân tích thư viện gen mcrA

74

3.6

Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gen mcrA của 44
dòng tế bào so sánh với các loài VSVSMT gần gũi

76

3.7

Gel điện di biến tính DGGE đoạn 16S rDNA của 10 chủng

VSVSMT phân lập

80

3.8

Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn 16S rDNA của
các chủng VSVSMT đại diện và các băng điện di biến tính

82

3.9

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng sinh CH4 của hai
chủng M7 và M37

87

3.10

Hình thái tế bào và cây phát sinh chủng loại của chủng M37

89

3.11

Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến mức tăng
trưởng và sinh methane ở chủng M37

90

3.12

Sinh trưởng và sinh methane ở chủng M37 trên các nguồn cơ chất
khác nhau

92

3.13

Khả năng sinh methane của chủng M37 so với mẫu làm giàu
NTLRE3 tại cùng một điều kiện nuôi cấy

94

3.14

Tỷ lệ methane được sinh ra bởi VSVSMT trong môi trường
khoáng bổ sung cám gạo lên men trong điều kiện nước lợ, nước
mặn

96

3.15

Bình nuôi giống khởi động VSVSMT từ mẫu làm giàu NTLRE3
và chủng M37 với cám gạo lên men trong môi trường nước biển

97

8


sau 15 ngày
3.16

Quy trình bảo quản VSVSMT trong điều kiện phòng thí nghiệm

99

3.17

Sự biến động COD (A) và tỷ lệ khí methane (B) trong các mô
hình thí nghiệm phân hủy kỵ khí

102

3.18

Gel điện di biến tính đoạn 16S rDNA của cổ khuẩn có mặt trong
các mô hình thí nghiệm

105

9


MỞ ĐẦU
Biogas (khí sinh học) là sản phẩm khí được sinh ra khi phân hủy chất
thải hữu cơ trong điều kiện kỵ khí. Thành phần chủ yếu của khí sinh học là

methane (chiếm 60-70% tổng thể tích khí biogas). Phân hủy kỵ khí được áp
dụng trong thực tiễn dưới nhiều hình thức công nghệ khác nhau như bể tự
hoại, bể biogas, bể FA, bể UASB... để phân hủy các chất thải hữu cơ, góp
phần giải quyết các vấn đề có tính chiến lược như xử lý chất thải hữu cơ trong
quá trình phát triển đô thị, trong sản xuất công nghiệp và chăn nuôi và tận thu
năng lượng từ chất thải.
Ở Việt Nam, dự án “Chương trình Khí sinh học cho Ngành Chăn nuôi
Việt Nam” do Cục Chăn nuôi, thuộc Bộ NN & PTNT và Tổ chức hợp tác phát
triển Hà Lan thực hiện là dự án lớn nhất về khí sinh học. Công nghệ phân hủy
chất thải hữu hữu cơ tạo khí sinh học có thể giúp quản lý vệ sinh chuồng trại,
xử lý chất thải và tận thu năng lượng tái tạo từ quá trình xử lý. Tuy nhiên các
mô hình công nghệ đã triển khai ở dự án mới chỉ áp dụng trong điều kiện môi
trường nước ngọt còn môi trường nước lợ hoặc nước mặn thì dự án lại chưa
thực hiện thành công.
Hiện nay tại các đơn vị quân đội, chất thải hữu cơ từ hoạt động sinh
hoạt và chăn nuôi tăng gia chủ yếu được xử lý thông qua cách thu gom và
chôn lấp hoặc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật để thúc đẩy quá trình phân
hủy hiếu khí. Các biện pháp đang sử dụng mới chỉ giải quyết được một phần
nhỏ chất thải là rác hữu cơ, còn lại một lượng lớn chất thải dạng lỏng từ hệ
thống nhà tiêu và các hoạt động chăn nuôi gia súc gia cầm vẫn chưa được xử
lý tới kết quả mong muốn vì thiếu công nghệ phù hợp và quá trình phân hủy
sinh học ở điều kiện môi trường có nồng độ muối cao bị ức chế thường diễn
ra với tốc độ chậm (Nguyễn Thị Nhung, 2009).

10


Việc phát triển công nghệ xử lý chất thải hữu cơ theo nguyên lý kỵ khí
hứa hẹn một giải pháp hữu hiệu góp phần xử lý các nguồn chất thải sinh hoạt
và chăn nuôi một cách hiệu quả, ngăn chặn ảnh hưởng của chất thải (mùi,

mầm bệnh) tới môi trường sống, đồng thời có thể tận thu năng lượng từ chất
thải dưới dạng khí sinh học, đặc biệt có ý nghĩa đối với những khu vực địa lý
cách biệt như hải đảo. Để có thể đưa công nghệ này vào hoạt động tại các khu
vực ven biển và hải đảo, vi sinh vật sinh methane (VSVSMT) – nhóm vi sinh
vật giữ vị trí then chốt của công nghệ, cần được nghiên cứu và tiến tới tạo
nguồn VSVSMT có hoạt tính cao, thích nghi tốt với môi trường nước lợ và
nước mặn, chủ động hỗ trợ quá trình vận hành công nghệ.
Đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật sinh methane ứng dụng cho sản xuất
biogas trong điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn” nhằm mục đích
nghiên cứu tập hợp vi sinh vật sinh methane có hoạt tính sinh học cao, thích
nghi tốt với điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn để chủ động hỗ trợ
cho các công nghệ xử lý kỵ khí, áp dụng cho nhiều dạng chất thải hữu cơ hiện
đang đe dọa môi trường sống tại các vùng dân cư, các khu du lịch cũng như
nơi bộ đội đóng quân ở ven biển, hải đảo.
Nội dung nghiên cứu gồm: (1) Làm giàu quần thể VSVSMT sinh trưởng
trong môi trường nước lợ và nước mặn từ các mẫu trầm tích biển với nhiều
loại cơ chất khác nhau; (2) Nghiên cứu cấu trúc quần thể VSVSMT dựa trên
gen mã hóa 16S rRNA và gen mcrA; (3) Phân lập một số chủng VSVSMT,
nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phân loại của chúng. Bảo quản
các chủng đơn và mẫu quần thể trong điều kiện đảm bảo hoạt tính ổn định; (4)
Đánh giá hoạt tính tạo khí sinh học của các quần thể làm giàu trong các điều
kiện môi trường khác nhau (nồng độ muối, nhiệt độ, pH) và với các chất thải
là bùn đầm nuôi tôm, rong biển có bổ sung nước biển.

11


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. XỬ LÝ CHẤT THẢI HỮU CƠ THEO CÔNG NGHỆ PHÂN HỦY KỴ
KHÍ SINH METHANE TRONG ĐIỀU KIỆN NHIỄM MẶN

1.1.1. Ô nhiễm chất thải hữu cơ trong môi trường nhiễm mặn
Ở các khu vực ven biển, nguồn ô nhiễm chất hữu cơ dễ phân hủy bao
gồm chất thải sinh hoạt từ các khu dân cư, các hoạt động nuôi trồng và chế
biến thủy hải sản, chất thải của các khu vực chăn nuôi gia súc, gia cầm và các
sản phẩm phụ nông nghiệp… Sự ô nhiễm chất thải hữu cơ này sẽ gây ảnh
hưởng lớn đến môi trường sinh thái nếu chất thải không được xử lý triệt để.
Tại nhiều nước có ngành công nghiệp đánh bắt và chế biến hải sản lớn
trên thế giới như Úc, Na Uy, Canada, Nhật Bản..., dạng nguồn thải hữu cơ
quan trọng thường gặp ở các vùng ven biển là chất thải từ các hoạt động đánh
bắt và chế biến hải sản có hàm lượng muối cao tương đương nước biển
(Jenning và Kaiser, 1998; Kennish, 2002). Do quá trình phân hủy sinh học ở
môi trường có nồng độ muối cao diễn ra với tốc độ chậm, việc tìm kiếm công
nghệ phù hợp để xử lý loại chất thải này một cách hiệu quả được nhiều nhà
khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Lefebvre và cộng sự (2007) đã
chỉ ra vai trò của các VSVSMT chịu mặn và ưa mặn (thuộc các chi
Methanosaeta và Methanobacterium) trong bể lên men kỵ khí, cho phép bể có
thể vận hành một cách hiệu quả ở môi trường có nồng độ NaCl từ 10 – 60 g/L
(Lefebvre et al., 2007). Các VSVSMT này có thể được tạo ra trong quá trình
thích nghi bùn kỵ khí thông thường ở điều kiện muối cao trong thời gian dài.
Trong nghiên cứu khác, Ferreira (2012) cho thấy bùn nạo vét từ các đầm nuôi
hải sản có hàm lượng muối cao (10 – 20 g/L) có thể được sử dụng làm cơ chất
cho quá trình lên men kỵ khí sinh methane để thu năng lượng một cách hiệu

12


quả nếu có bổ sung các VSVSMT đã thích nghi trước đó với nồng độ muối
cao và cân bằng dinh dưỡng (C:N:P) trong bể lên men được kiểm soát.
Ở Việt Nam, chất thải sinh hoạt của nhiều vùng dân cư ven biển và hải
đảo hiện đang là một trong trong những vấn nạn môi trường. Rác thải, chất

thải hữu cơ từ các hoạt động sản xuất và sinh hoạt không được xử lý mà thải
thẳng ra biển sẽ gây ô nhiễm nghiêm trọng (Hình 1.1A). Do quá trình phân
hủy sinh học trong môi trường biển chậm nên lượng chất thải này ngày càng
tích lũy và gây ảnh hưởng không nhỏ cho các cơ quan quản lý cũng như hoạt
động kinh doanh trên biển.
Hoạt động nuôi trồng thủy sản cũng tạo ra một phần không nhỏ lượng
chất thải bao gồm thức ăn dư thừa, xác chết và phân của vật nuôi. Đồng bằng
sông Cửu Long - một trong những vùng nuôi thủy hải sản trọng điểm của Việt
Nam hiện đang đối mặt với hiện trạng suy giảm chất lượng nước và ô nhiễm
môi trường do bùng phát việc nuôi thâm canh thủy sản mà chất thải tích tụ tại
những lớp bùn lớn dưới đáy ao nuôi là một trong những nguyên nhân chính
(Hình 1.1B).
A

B

Hình 1.1. Một số nguồn chất thải hữu cơ tại các vùng ven biển Việt Nam

Theo số liệu thống kê của Viện khoa học thủy lợi Việt Nam, năm 2000
diện tích nuôi tôm ở đồng bằng sông Cửu Long chỉ là 250.000 ha, đến năm

13


2011 diện nuôi tôm của 8 tỉnh ven biển thuộc đồng bằng sông Cửu Long đã
lên trên 580.000 ha, chiếm trên 80% diện tích nuôi tôm của cả nước
(www.vawr.org.vn). Riêng trong việc nuôi cá tra và tôm sú ở đồng bằng sông
Cửu Long mỗi năm có đến hàng triệu tấn thức ăn không được tiêu hóa hết.
Ngoài ra, lượng chất thải hữu cơ giàu protein, lipit và các phụ phẩm khác của
thủy sản mực, tôm, cá…cũng rất lớn. Nước thải trong sản xuất chế biến

(chiếm 85 - 90% tổng lượng nước thải) từ hoạt động rửa nguyên liệu, chế
biến, vệ sinh dụng cụ thiết bị cũng là nguồn thải nhiễm hữu cơ nặng cần được
xử lý (www.fistenet.gov.vn).
1.1.2. Xử lý ô nhiễm chất hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí
Bản chất của phương pháp sinh học trong xử lý chất thải hữu cơ là dựa
vào hoạt động sống của vi sinh vật (các loài bản địa cũng như các loài có hoạt
tính cao được bổ sung vào hệ thống xử lý) mà các chất hữu cơ ô nhiễm được
khoáng hóa tạo thành khí CO2, CH4 và nước.
CO2
40-50%

COD
100%

Biogas 70-90%

COD
100%

Hiếu khí

Kỵ khí
Dòng
chảy
5-10%

Dòng chảy

Bùn 5- 15%

10-30%

Bùn 50- 60%

A

B

Hình 1.2. Chuyển hóa cacbon hữu cơ trong phân hủy hiếu khí (A) và kỵ khí (B)
(Lettinga, 1995)

Biện pháp sinh học trong xử lý chất thải hữu cơ được chia thành hai
dạng chính: (i) phương pháp hiếu khí dựa trên hoạt động của các vi sinh vật
hiếu khí với oxy là chất nhận điện tử cần được cung cấp liên tục để đảm bảo
14


hoạt động sống của vi sinh vật và (ii) phương pháp kỵ khí dựa trên hoạt động
của các vi sinh vật không có nhu cầu về oxy trong quá trình sinh trưởng. So
với quá trình phân hủy hiếu khí, quá trình kỵ khí (Hình 1.2) có nhiều ưu điểm
như sau (Lettinga, 1995; Bitton, 1999):
- Phân hủy kỵ khí sử dụng CO2 sẵn có trong môi trường làm chất nhận
điện tử, không có nhu cầu về oxy từ bên ngoài, do vậy làm giảm giá thành xử
lý nước/chất thải một cách đáng kể.
- Lượng bùn tạo ra trong phân hủy kỵ khí thấp hơn nhiều so với phân hủy
hiếu khí (3 ÷ 20 lần) do sinh khối tạo ra ít (hiệu suất sinh năng lượng từ vi
khuẩn kỵ khí thấp). Nếu như trong hô hấp hiếu khí, 50% cacbon hữu cơ được
chuyển thành sinh khối thì trong hô hấp kỵ khí chỉ có 5%, theo đó với 1 tấn
COD bị phân hủy thì chỉ có 20 ÷ 100 kg sinh khối tế bào được tạo thành trong
phân hủy kỵ khí, so với 500 ÷ 600 kg tạo thành trong phân hủy hiếu khí

(Lettinga, 1995).
- Phân hủy kỵ khí tạo sản phẩm cuối cùng là biogas với thành phần chủ
yếu là khí methane (50 ÷ 70%), loại khí có nhiệt năng cao được sử dụng làm
nhiên liệu đốt hay chuyển thành điện năng. Chỉ có khoảng 3 ÷ 5% cơ chất bị
thất thoát dưới dạng nhiệt. Ngoài ra quá trình phân hủy kỵ khí còn sinh ra một
số sản phẩm khác như CO2 (25 ÷ 45%), H2S (0 ÷1%), CO (0 ÷ 2 %), N2 (0 ÷
2%), NH3 (0 ÷ 1%), O2 (0 ÷ 2%) (Graaf và Fendler, 2010). Các khí tạp này
cần phải được loại bỏ (thông qua các hệ thống lọc phù hợp) để biogas sau đó
có thể sử dụng làm nhiên liệu đốt hay phát điện.
- Phân hủy kỵ khí thích hợp với các nguồn chất thải có hàm lượng hữu
cơ rất cao và có thể vận hành với tải trọng hữu cơ lớn.

15


- Vi sinh vật kỵ khí trong hệ thống tồn tại theo tổ hợp ở dạng hạt bùn, có
độ bền cao về hoạt tính và về mức sống sót, kể cả khi hệ thống xử lý ngừng
hoạt động trong một thời gian dài.
- Bên cạnh đó, các quá trình phân hủy kỵ khí còn có thể loại được nhiều
chất độc khó phân hủy như các hydrocacbon mạch thẳng chứa clo (ví dụ
trichloroethylene, trihalomethane) và lignin.
Với những ưu điểm kể trên, các công nghệ xử lý chất thải hữu cơ theo
nguyên lý phân hủy kỵ khí ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Tuy nhiên, bên
cạnh những ưu thế này, phân hủy kỵ khí vẫn còn bộc lộ một số nhược điểm
như sau:
- Quy trình phân hủy kỵ khí diễn ra chậm hơn so với hiếu khí và thường
mẫn cảm với nhiều yếu tố độc hại trong môi trường như nhiệt độ, pH, axit
hữu cơ bay hơi (VFA), các kim loại nặng ...
- Bước khởi động của toàn bộ quá trình thường kéo dài, do vậy nguồn vi
sinh vật có hoạt tính cao (như bùn bể tự hoại, bùn hoạt tính hay chế phẩm vi

sinh) thường được sử dụng để rút ngắn lại quá trình này.
Ở các nước phát triển, biogas được sản xuất ở qui mô công nghiệp, sử
dụng các nguồn chất thải phong phú, đa dạng, bao gồm chất thải lỏng từ
ngành chăn nuôi, các nhà máy chế biến thực phẩm hay lò giết mổ, rác sinh
hoạt, bùn thải,... (Weiland et al., 2003). Lượng biogas thu hồi từ các nguồn
chất thải hữu cơ có thể đóng góp đáng kể vào quỹ năng lượng chung của
nhiều quốc gia, như Trung quốc - 1,2% (China biogas, 2008); Mỹ - 100 tỷ
kWH (Cuellar et al., 2008), Đức - 2,86% (Biopact, 2007).
Ở Việt Nam, dự án "Chương trình Khí sinh học cho Ngành chăn nuôi
Việt Nam" do Cục chăn nuôi, thuộc Bộ NN & PTNT và Tổ chức hợp tác phát
triển Hà Lan thực hiện đã giúp đưa công nghệ khí sinh học tới các vùng nông
16


thôn, góp phần quản lý phân chuồng, xử lý chất thải tại chỗ, đồng thời tạo ra
nguồn năng lượng tái tạo từ quá trình xử lý chất thải. Hiện nay trên cả nước
có khoảng 500 000 hầm phân hủy biogas có quy mô dưới 10 m3 của các hộ
gia đình nông dân. Tính đến năm 2011, chương trình Khí sinh học cho ngành
chăn nuôi Việt Nam đã xây được 15.678 hầm biogas, trong đó chỉ có khoảng
100 hầm biogas thương mại với dung tích 100-200 m3 tại các trang trại nuôi
lợn quy mô công nghiệp. Về công nghệ, hầu hết các hầm ủ là loại nhỏ có cấu
trúc hầm vòm cố định xây bằng gạch hoặc đúc sẵn bằng composite (Hình
1.3). Lượng biogas sinh ra mới chủ yếu được sử dụng làm nhiên liệu và
chuyển hóa thành điện sử dụng trực tiếp tại cơ sở chăn nuôi và hộ gia đình,
đến nay vẫn chưa có trạm sản xuất điện biogas nào được hòa lưới điện quốc
gia.

Hình 1.3. Hầm biogas loại nhỏ phổ biến ở các gia đình nông thôn Việt Nam

Với tiêu chí phát triển bền vững, chính phủ Việt Nam đã đặt mục tiêu

gia tăng sự đóng góp từ năng lượng tái tạo (gồm năng lượng gió, mặt trời,
sinh khối và biogas) cho phát điện từ 3,5% trong 2010 lên 4,5% trong 2020 và
tiến tới 6% trong 2030.
Bên cạnh việc chuyển hóa chất thải hữu cơ để tận thu năng lượng, quá
trình phân hủy kỵ khí tạo khí sinh học còn tạo ra bã thải là nguồn phân bón

17


hữu cơ sạch và giàu dinh dưỡng, giúp nâng cao năng suất, chất lượng cây
trồng và cải tạo đất…Nhiều nông hộ khi sử dụng bùn cặn sau biogas làm phân
bón cho cây ăn quả như bưởi da xanh, bưởi năm roi, măng tre Tàu đã tăng
năng suất 15 – 20% và tiết kiệm được chi phí cho phân bón và thuốc bảo vệ
thực vật.
Tuy nhiên, dự án Khí sinh học và các nghiên cứu trong nước mới chỉ
triển khai thành công ở quy mô nhỏ (hộ và nhóm hộ gia đình) tại các vùng
đồng bằng, trung du trong điều kiện vận hành các bể biogas bằng nước ngọt,
chưa triển khai ứng dụng tại các khu vực có điều kiện môi trường đặc biệt có
sử dụng nước nhiễm mặn ở các vùng ven biển và hải đảo.
1.1.3. Xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí trong điều kiện
nhiễm mặn
Như đã trình bày ở trên (Mục 1.1.1), chất thải hữu cơ từ hoạt động nuôi
trồng, khai thác và chế biến thủy sản, cũng như sinh hoạt của con người là
những nguồn ô nhiễm chính cho vùng ven biển. Ngoài các nguồn thải giàu
hữu cơ nói trên có tiềm năng phân hủy cao để tận thu năng lượng dưới dạng
khí methane, trong những năm gần đây rong tảo ở biển cũng được quan tâm
như một nguồn sinh khối mới phù hợp cho công nghệ phân hủy kỵ khí để sản
xuất methane. Rong biển dại như các loại rong Laminaria sp., Ulva sp. phổ
biến ở các vùng biển ôn đới được thu gom và đưa vào bể phản ứng sinh học
nhằm tạo khí methane (Chynoweth, 2002; Bruhn et al., 2011; Migliore et al.,

2012). Hàm lượng methane sinh ra từ quá trình xử lý kỵ khí rong biển có thể
đạt tới 50 ÷ 60% trong thành phần biogas, hiệu suất thu năng lượng ở mức
200 Nm3 CH4/tấn rong, tương ứng với lượng điện năng là 1,3 ÷ 1,4 GWh/năm
(Dự án năng lượng mới từ rong biển của Thụy Điển, 2009). Những thành
công bước đầu trong nghiên cứu đã mở ra hướng mới trong sản xuất năng

18


lượng sạch, theo đó lãnh hải rộng lớn được sử dụng để tạo nguồn sinh khối
rong tảo ở quy mô công nghiệp một cách chủ động, góp phần giải quyết tình
trạng khan hiếm đất trồng để tạo sinh khối thực vật hiện nay. Australia, Nhật
Bản, Trung Quốc là một số quốc gia có điều kiện biển thuận lợi để đi đầu
trong lĩnh vực này (Winberg et al., 2009).
So với các hệ thống xử lý kỵ khí trong môi trường nước ngọt, các hệ
thống hoạt động trong môi trường nước mặn (nước lợ và nước biển) có hiệu
quả thấp hơn nhiều do các quá trình phân hủy vật chất nói chung bị ức chế ở
môi trường có hàm lượng muối cao. So với môi trường nước ngọt thông
thường, phân hủy kỵ khí trong môi trường có hàm lượng muối cao như nước
nhiễm mặn (nồng độ NaCl > 7,9 g/L) hay nước có nồng độ muối cao (15,8 ÷
47,2 g NaCl/L) kém thuận lợi hơn do hoạt tính của vi sinh vật thấp hơn rất
nhiều. Theo Riffat và cộng sự đã nghiên cứu trong điều kiện nhiệt độ thuận
lợi (35C) VSVSMT ưa mặn có khả năng loại tới 80% COD trong chất thải
với hiệu suất 5 ÷ 6,2 kg COD/m3/ngày tại nồng độ muối 35 g/L, tuy nhiên ở
nồng độ muối cao hơn 37 g/L hiệu suất chỉ còn là 3 kg COD/m3/ngày (Riffat
và Krongthamchat, 2007).
Do vậy, để làm giảm ảnh hưởng của nồng độ muối cao tới hoạt động của
vi sinh vật trong quá trình phân hủy kỵ khí khi sử dụng các nguồn cơ chất có
hàm lượng muối cao như bùn thải đầm nuôi thủy sản hay rong biển, người ta
thường sử dụng nước ngọt để bổ sung vào hỗn hợp phản ứng để tạo môi

trường phù hợp (Liu, 2010; Nkemka và Murto, 2010).
Bên cạnh ảnh hưởng ức chế của hàm lượng muối cao, sự cạnh tranh của
vi khuẩn khử sulfate cũng là yếu tố quan trọng làm giảm hiệu suất của quá
trình phân hủy kỵ khí ở nước lợ và nước biển. Trong môi trường biển, sulfate
là chất nhận điện tử quan trọng thứ hai sau oxy (với hàm lượng 28 mM), vì

19


vậy vi khuẩn khử sulfate là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế ở đây (Rabus et al.,
2006). Về mặt nhiệt động học, quá trình khử sulfate tích lũy được năng lượng
lớn hơn so với quá trình sinh methane đối với nguồn điện tử từ cùng một cơ
chất hữu cơ, vì thế vi khuẩn khử sulfate là đối thủ cạnh tranh ưu thế đối với
VSVSMT trong môi trường kỵ khí (Choi và Rim, 1991; Rabus et al., 2006).
Khử sulfate: SO42 + 10H+ + 8e  H2S + 4H2O (G0’= 5,9 KJ/mol)
Khử CO2: CO2 + 8H+ + 8e  CH4 + 2H2O

(G0’ = 5,6 KJ/mol)

Ngoài ra, sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn khử sulfate là S2 có tác
dụng độc hại tới các loài vi sinh vật nói chung, trong đó có VSVSMT. Do
vậy, việc vận hành các hệ thống xử lý kỵ khí sinh methane trong điều kiện
nước biển thường vận hành gặp trở ngại bởi sự có mặt của vi khuẩn khử
sulfate là một yếu tố ức chế VSVSMT (Bitton, 1999).
Yếu tố bất lợi thứ ba của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane ở điều
kiện nước mặn là thiếu nguồn VSVSMT tự nhiên để bổ sung vào hệ thống,
nhằm hỗ trợ quá trình khởi động. Nếu như phân trâu bò, bùn cống và bùn hoạt
tính từ các hệ thống xử lý nước thải có thể được sử dụng làm nguồn
VSVSMT bổ sung ban đầu vào các hệ thống xử lý kỵ khí ở môi trường nước
ngọt thì trong môi trường nước mặn lại chưa có các nguồn vi sinh vật tương

ứng như vậy.
Trên thế giới, VSVSMT từ nước biển và nước lợ đã được nghiên cứu
khá nhiều trong vài thập kỷ gần đây, nhiều loài mới đã được phát hiện
(Mikucki et al., 2003; Singh et al., 2005), tuy nhiên việc nghiên cứu tạo
nguồn VSVSMT ưa mặn chủ động nhằm hỗ trợ cho xử lý chất thải hữu cơ
bằng phương pháp kỵ khí sinh methane trong điều kiện nước nhiễm mặn lại
chưa được quan tâm.

20