Ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong
hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện
thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân
gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli
được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng
của chúng. E. coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh
kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó
nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực
phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC,
EAEC...Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen
độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính
vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1,
stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC =
hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic
syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và
tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli )
mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen
st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên
người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae sản
sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy
truyền thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây
lan rồi thì mới có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường
ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E.
coli trong phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn

2

trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng.
Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước
cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người. PCR
là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát
hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học
Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân,
BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực
của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và
thịt bò”
1.2. Mục tiêu
- Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR
từ mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
1.3. Mục đích
- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và
người.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
2.1.1. Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi

khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập
và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885.
- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo
hệ thống phân loại của Bergey).
- E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước
khoảng 1,5 µ m x 0,5 µ m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh
Phong, 1996). E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người
và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn
cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh
đường ruột và ở các cơ quan khác.
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37 oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu
là 7,2 – 7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác
nhau trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường
được phân lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue
agar (EMB). Trên môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim;
trên môi trường thạch Mac Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta


4

có thể sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm
STEC không lên men đường sorbitol. Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho
khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E. coli lên men sorbitol
cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar),
sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn,
ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường,

càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt
môi trường.
- Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng
phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết
quả là + + - - (biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng
nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại
serotype của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K.
Theo Jay (2000), E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và
tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H.
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli:
- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC
- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC
- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc
hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5. Phân loại E. coli


5

Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên
màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch
tễ của bệnh), E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
 STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero
toxingenic E. coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
 EPEC (Enteropathogenic E. coli)
 EAEC (Enteroaggregative E. coli)

 ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp
khác nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này:
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli
(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm
này sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC
được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng
này gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng
huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga
like toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế
bào giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử
dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra
rằng nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù
vậy, không phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu


6

tố độc lực khác. Những dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện
trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này
thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và
ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và

Kaper, 1998).
b. Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của
STEC
* Shiga toxin
Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là
Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt).
Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1
và Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5
tiểu đơn vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA).
Cả hai gen stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào
trong nhiễm sắc thể (NST) của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1,
hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2. Ba dạng Stx2 được xác
định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Subtype Stx2e gây bệnh phù
thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người. Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng
có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994). Nhiều khi
người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1,
Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997). Hầu hết những phương
pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm
STEC (Cocolin và ctv, 2000).
* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của
STEC
Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có
thể là heat – stable enterotoxin (EAST1). Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60
– MDa mà plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện
ở các dòng STEC không phải O157. Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập


7

từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994). Tuy nhiên, việc sản sinh

Ehly như là một yếu tố độc lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác
giả này, E. coli có Stx âm tính và Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế
bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được
mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC. EAST1 trong
mầm bệnh của STEC thì không được biết, nhưng nó có thể liên quan đến một số
bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên được tìm thấy ở những người bị
nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị
ở tế bào ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97
kDa. Protein intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing).
Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing,
A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv,
1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một trong số
các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột locus of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của STEC chứa những gen mã
hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin là Tir (translocated
intimin receptor) và một số gen khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà
là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên, không phải tất
cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper,
1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài vi khuẩn
(protein intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vị
vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).
Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người
ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype
khác. Dấu hiệu sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể
lên men sorbitol hoặc không tạo ra β - glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia,
chẩn đoán STEC chỉ dựa vào việc phát hiện E. coli không lên men sorbitol.


8

O157:H7 và các serotype không phải O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người
gồm O26:H11, O103:H2, O111:HNM và O113:H21 (WHO, 1994).
c. Nguồn lây nhiễm
STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò,
cừu, dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa
(Chalmers và ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài
động vật quan trọng nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây
nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành
phần trong ruột và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996).
STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này
sang người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm,
đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là nguyên nhân
chủ yếu (Keskimaki, 2001).
2.1.5.2. Nhóm EPEC
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv
(1955) để chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
a. Đặc điểm
Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi
khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không
sản xuất độc tố Shiga.
b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E,
có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị
nhiễm và trong nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này
được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi
khuẩn và màng tế bào biểu mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do
ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V. cholerae bám theo kiểu không chặt,
không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là
gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC

9

(Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất
cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng
không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông
thường.
c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua
đường miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa
tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người
trưởng thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có
thể là do mất các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở
người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao.
2.1.5.3. Nhóm ETEC
a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)
 Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST)
và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT).
(1)

Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):

Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc
và chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio
cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid
amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và
kiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tế bào. LT có hai

serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt
miễn dịch.
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I
là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và
5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm


10

peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B
sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM 1 và liên kết
lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I
có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu
tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập từ người. Gen mã hóa
cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã
hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị
(colonization factor antigen – CFA).
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I
thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn
đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein
kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Điều này dẫn
đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng
tế bào biểu mô. Kết quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl - một cách
tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus).
Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998).
- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở
tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng
làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II
không liên quan đến bệnh trên người và thú.
(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)

Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur
của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai
nhóm là STa và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động.
Gen mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã
hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do
ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica
và V. cholerae không phải O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu
nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc


11

nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1.
Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử
khoảng 2 kDa. STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ
E. coli phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân
lập trên người. Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người.
Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GCC). STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng
cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl - và / hoặc
ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu
chảy.
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ
heo, vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Không như
STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất
tế bào nhung mao của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của
STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không
đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào. Không gây ra sự
tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-). STb không làm
tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ

ngoại bào. STb còn kích thích phóng thích PGE 2 và serotonin, từ đó người ta
cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi
độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992).
 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được
nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột
non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA Colonization factor antigens).
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính
gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc


12

mảnh mềm. Có ít nhất 20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã
hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT
(Gaastra và Svennerholm, 1996). Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn
dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh.
b. Dịch tễ
Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên
trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch
tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng
nhầy khác nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm
không có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân,
(3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên
tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ
em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở
tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dòng
ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh.
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là
những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm

ETEC, ở những vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và
ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người
trưởng thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên
nhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát
triển đến thăm những vùng có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60%
số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do
ETEC. Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên
đến thăm những nước đang phát triển. Tiêu chảy trên du khách thường là do
thức ăn và nước uống bị ô nhiễm.
c. Khía cạnh lâm sàng


13

Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn
(14 – 50 giờ). Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài
bệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và
tự bớt dần nhưng cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm
Vibrio cholerae.
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra
trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng
sinh nhạy cảm cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu
quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng
sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng
cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong
cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.
d. Phát hiện và chẩn đoán
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST.
Có nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…
2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1. Nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in
vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một
thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào).
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử
DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn
(trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP
(deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp. Các
primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse
primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu.


14

Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi. Sự tổng hợp này sẽ được
lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.
Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể
nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp
primer trong một phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi
Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online).
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm ba giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử
DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử,

thường là ở 94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer
bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60 0C
tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72 0C giúp DNA polymerase hoạt
động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide
triphosphate. Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi
DNA.
* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần
làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính
theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2n
Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa


15

* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì
DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá
hủy bởi chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác
định. Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng
hợp có chiều dài xác định. Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được
khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2
x : Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Số chu kỳ của phản ứng PCR

- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản
ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với
lượng mẫu ban đầu.
+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại
bắt cặp với nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban
đầu là 105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 10 2 – 103 thì số chu
kỳ phải là 35 – 40.
Giai đoạn biến tính
(denaturation)
Giai đoạn ủ bắt cặp
(anealing)
Giai đoạn kéo dài
(elongation hay
extension)


16

Nhiệt độ (0C)

Hình 2.1 Ngun lý của phản ứng PCR

Biến tính

Lặp lại n lần

94-950C

Kéo dài

Ủ bắt cặp

720C

40-700C

Thời gian (phút)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ
sung với trình thự base của hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp
DNA. Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer
được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các
trình tự lặp lại trên gen, khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer
ngược và cũng khơng có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong
cùng một primer. Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR
là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai primer
xi và ngược khơng q lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ
hơn 1kb.


17

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt,
được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA
polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến
cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg 2+. Taq DNA polymerase tổng
hợp DNA theo hướng 5’→3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C.
- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp
4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp
DNA.
- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại
enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp
hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme
polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ
Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl 2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến
hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl 2 có thể
ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành
dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg 2+
phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl 2
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh
Thùy Dương, 1998).
2.2.4. Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát
hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của
điện trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện
trường phụ thuộc vào khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ
các thành phần của gel và điện thế.

18

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA
trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide.
Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh
quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ =300 nm) thành vạch màu đỏ da
cam.
Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một
yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một
tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).
2.2.5. Những ứng dụng của PCR
2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ
PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho
phản ứng khuếch đại. Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào
gốc chỉ chứa một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này.
Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các
phân tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ với
một sợi tóc và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó
có thể lọt lưới pháp luật. PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương
của những nạn nhân bị giết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh của
họ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó không thể sử dụng
các phương pháp phân tích thông thường.
Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ
sinh vật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu
vết DNA hiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa
thạch. Phương pháp PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di
truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền
từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong các xác ướp.
2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng
Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một

cách nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa


19

trên các kết quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR. Khả năng nhận
biết đột biến một cách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm
sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền.
PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh. Ví dụ:
Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi
các triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều
tháng. Từ đó ta có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại.
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA
PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA
cũng được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp
(cDNA) nhờ enzyme reverse transcriptase.
Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của
một mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời
điểm khác nhau. Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về
khả năng hoạt động của gen cha mẹ. Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo
ra những thay đổi trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát.
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau
Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là
kỹ thuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan
đến sự tiến hóa và suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác. Hai sinh
vật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ
thân tộc kém (Brown, 1994).
2.2.6. Các hạn chế của phương pháp PCR
Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có
khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên,

ta không thể quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng
đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể ba
vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:


20

2.2.6.1. Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giới hạn
đầu tiên
Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được
với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ
dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho
phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.
2.2.6.2. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với
khả năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này
Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả
rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch
đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở
nắp các ống nghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín
trong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra
khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị
dung cụ…rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một
phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau:
- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và
phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách
xa nhau.
- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng
cho các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự
nhiễm vào đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản
ứng.

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch
đại trước.
- Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng
nhỏ, tính toán sao cho 1, 2 lần thao tác.
2.2.6.3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase


21

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10 -4, nghĩa là
cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không
nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản
phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự
nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ có
thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản
ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng
biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,…

Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1. Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005
3.1.2. Địa điểm
- Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai;
mẫu phân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ
An – Bình Dương.


22

- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm
nghiệm Thú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí
Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2. Nội dung
- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
- Nuôi cấy, phân lập E. coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.
- Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli / nhóm E. coli.
- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA
- Ly trích DNA của E. coli phân lập được.
- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E.
coli.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Lấy mẫu
- Mẫu phân tiêu chảy
Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyển
Carry Blair. Bảo quản ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được
giữ tối đa 24 giờ).
- Mẫu bề mặt thịt
Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào
chai có sẵn 50 ml nước peptone đệm. Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông
buộc kỹ. Bảo quản 4 - 80C, chuyển về phòng thí nghiệm.
- Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập
được vi khuẩn E. coli từ các mẫu đã lấy.
Bảng 3.1 Số lượng mẫu


23

STT
1
2
3
4
3.3.2.

Đối tượng mẫu
Phân bò
Phân tiêu
Phân bê
chảy
Phân heo
Thịt
Bò
Tổng cộng

Số lượng
8
10
9
9
36

Nuôi

cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), SorbitolSMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CTSMAC), hóa chất thử IMViC…
3.3.2.2. Nuôi cấy và phân lập

(1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC
để có những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37oC. Mẫu bề mặt thịt được làm
đồng đều trong 125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefixime
với nồng độ 0,0125 mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002). Ủ 24
giờ ở 37oC, cấy sang môi trường CT-SMAC. Vi khuẩn E. coli nhóm STEC phát
triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E. coli khác cho khuẩn lạc
hồng giống như trên môi trường MAC.
(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli
- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC,
CT-SMAC.
- Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E. coli của
mẫu khảo sát. Các nhóm khuẩn lạc như sau:
 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM).
 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS).
 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS).


24

 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT – SMAC (Ký hiệu TC).
(3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh
dưỡng (NA).
- Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA. Phần khuẩn lạc
còn lại của mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml
nước cất khử ion vô trùng để ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tổng).
(4) Thử sinh hóa
- Sau khi nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc rời rạc trên được thử phản ứng IMViC
để xác định E. coli.
3.2.2.3. Ly trích DNA khuẩn lạc
Sau khi đã thu nhóm khuẩn lạc trong ống eppendorf và giữ gốc từng

khuẩn lạc riêng lẻ. Mỗi gốc được cấy sang đĩa NA. Sau 24 giờ ở 37 oC, thu 6 –
10 khuẩn lạc cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H 2O cất khử ion vô trùng.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành ly trích DNA đại diện nhóm khuẩn lạc và từng
khuẩn lạc riêng lẻ.
Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ
E. coli của Cerna và ctv (2003) và Botteldoorn và ctv (2003) để tiến hành ly
trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau:
đun sôi 10 phút rồi chuyển vào tủ -70oC để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm
13000 vòng/phút trong 3 phút. Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu (DNA xét
nghiệm).
- Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli như sau:


25

Mẫu

Phân

Peptone (vancomycin, cefixime)
(37oC/24h)

Thịt

MAC
(37oC/24h)

SMAC
(37oC/24h)

Chọn 6-10 khuẩn
lạc đỏ hồng

CT - SMAC
(37oC/24h)

Chọn 6-10 khuẩn lạc
trắng và / hoặc đỏ hồng

Cấy từng khuẩn lạc
được chọn vào từng
ống NA nghiêng
(37oC/24h)

Chọn 6-10 khuẩn lạc
trắng và / hoặc đỏ hồng

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã
chọn để cấy qua ống NA theo từng nhóm riêng,
cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H2O cất
khử ion 2 lần

Thử IMViC(+/-;+;-;-)

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)
(-)

Multiplex - PCR

Loại bỏ các ống NA

đã giữ gốc

(+)

Ly trích DNA riêng theo từng ống NA

Cạo tất cả những khuẩn lạc đã chạm theo từng nhóm riêng:
Multiplex- PCR
(1) 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC
(2) 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC
(3) 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC
(4) 6 – 10 khuẩn lạc hồng CT – SMAC
(5) 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT - SMAC