ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU CHI BẰNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (471.68 KB, 22 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ BÍCH NGỌC
TÓM TẮT ĐỀ TÀI:
ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU CHI
BẰNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Mã số chuyên ngành: 62423001
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIỄN SĨ SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT
Tp. Hồ Chí Minh năm 2014
1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ BÍCH NGỌC
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
1. XÁC NHẬN CỦA CBHD: (CBHD ký tên và ghi họ tên)
2
MỤC LỤC
Mục
lục
............................................................................................................................................
1
1.
Tính
cấp
thiết,
ý
nghĩa
khoa
học
và
thực
tiễn
của
đề
tài
............................................
2
2.Tổng
quan
về
các
kết
quả
nghiên
cứu
trong
và
ngoài
nước
đã
có
đến
nay
về
vấn
đề
khoa
học
mà
đề
tài
đề
cập
đến
.........................................................................................
3
2.1.
Nguồn
tế
bào
........................................................................................................................
3
2.2.
Liệu
pháp
tế
bào
trong
tắc
nghẽn
mạch
máuchi
......................................................
4
3.
Mục
đích
nghiên
cứu
...........................................................................................................
6
4.
Nội
dung
và
phạm
vi
của
vấn
đề
sẽ
đi
sâu
nghiên
cứu
.............................................
6
5.
Đối
tượng,
phương
pháp
nghiên
cứu
...........................................................................
9
5.1.
Cách
tiếp
cận
........................................................................................................................
9
5.2.
Đối
tượng
thí
nghiệm
và
cỡ
mẫu
cho
nghiên
cứu
...................................................
9
5.3.
Các
phương
pháp
nghiên
cứu
.....................................................................................
10
6.
Nơi
thực
hiện
đề
tài
nghiên
cứu
của
luận
văn
........................................................
15
7.
Tài
liệu
tham
khảo
...........................................................................................................
15
1
1. Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Thiếu máu cục bộ cấp tính (TMCBCT) là một biểu hiện của bệnh động mạch ngoại
biên (BĐMNB). Bệnh nhân có tổn thương da, loét hay hoại tử mô do thiếu máu cục bộ.
Mục tiêu chính để điều trị bệnh nhân TMCBCT là giảm đau do thiếu máu cục bộ, chữa
lành vết loét, ngăn ngừa mất chi, cải thiện chức năng và chất lượng cuộc sống của bệnh
nhân và kéo dài sự sống.
Tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân được xác định là nguồn tế bào có tiềm năng điều trị
mới có tác dụng kích thích sự tạo mạch máu. Liệu pháp cấy ghép tự thân tế bào gốc hoặc tế
bào tiền thân cho các bệnh thiếu máu cục bộ ngoại vi dường như trở thành một công cụ mới
cho điều trị chứng thiếu máu cục bộ chi nghiêm trọng. Các bằng chứng sơ bộ đã cho thấy
tính khả thi, an toàn và hiệu quả trong một số điểm mấu chốt quan trọng nhằm phục hồi tổn
thương do thiếu máu cục bộ.
Tại Việt Nam, tắc nghẽn động mạch ngoại vi vẫn còn là căn bệnh khó điều trị, không
chỉ ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống của người bệnh và gia đình mà còn ảnh hưởng đến
toàn xã hội, chi phí điều trị tốn kém cũng là một gánh nặng lớn cho những người liên quan.
Các ứng dụng dùng tế bào gốc mới chỉ tiến hành trong điều trị bệnh lý về máu. Một số khác
đang được tiến hành cho các bệnh nhân tổn thương da, bỏng mắt, bệnh lý về xương. Tuy
nhiên, các ứng dụng này còn hạn chế ở quy mô nhỏ. Đối với điều trị tắc nghẽn mạch máu
bằng liệu pháp tế bào gốc, chưa có cơ sở nào trong nước có công trình công bố về hiệu quả
điều trị.
Nghiên cứu này tiến hành cấy ghép đồng loại tế bào gốc nhằm đánh giá khả năng tác
động của tế bào ghép lên sự phục hồi các mô tổn thương như mô mạch máu, mô cơ tại vùng
tắc nghẽn mạch máu.
Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện các liệu pháp điều trị
bệnh, từ đó tìm ra những phác đồ trị liệu tiền lâm sàng, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu
hơn để điều trị căn bệnh này và là cơ sở để mở rộng phạm vi thử nghiệm ở mức độ lâm
sàng. Nghiên cứu cũng tạo ra một số mô hình và phương pháp cấy ghép có tác động phục
hồi các mô tổn thương.
2
2. Tổng quan về các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã có đến nay về
vấn đề khoa học mà đề tài đề cập đến
2.1. Nguồn tế bào
TBTT nội mô, TBG tạo máu và TBG trung mô được đặc trưng bởi khả năng sự tạo
mạch máu mới và sửa chữa mô. Cả ba loại tế bào này đều được phân lập từ tủy xương.
Ngoài ra TBTT nội mô còn có thể được thu nhận từ máu ngoại vi cũng như lách, TBG trung
mô có thể được phân lập từ mô mỡ ngoại vi (Pittenger 2004) và thành mạch (Abedin 2004).
Đặc tính kiểu hình của cả hai loại tế bào này đều có thể được xác định nhờ hóa mô miễn
dịch và phân tích chọn lọc tế bào biểu hiện phân tử bề mặt sử dụng phương pháp phân tách
dòng chảy (flowcytometry). Tuy nhiên, sự thiếu các marker đặc trưng cho hai loại tế bào
này khiến chúng trở nên khó xác định đặc tính. Nhiều marker bề mặt của TBTT nội mô và
TBG trung mô đều có trên TBG tạo máu
TBTT nội mô là một nhóm tế bào có nguồn gốc từ các cơ chất đa tiềm năng trong tủy
xương. Khi biệt hóa, chúng biểu hiện các chức năng chuyên biệt khác nhau trong hệ tuần
hoàn (Dzau V.J. 2005, Urbich M.F, 2004). Ở trạng thái biệt hóa, TBTT nội mô biểu hiện
các marker của dòng nội mô như VE-cadherin, PECAM-1 (CD31) và eNOS (Urbich M.F,
2004). Ở người, sự biểu hiện của CD133 được tin là marker sớm của nguyên bào tạo mạch,
việc mất marker này có sự trùng khớp với sự biệt hóa của TBTT nội mô thành tế bào chức
năng có đặc tính của tế bào nội mô trưởng thành (Dimmerler S. 2005, Dzau V.J. 2005).
TBTT nội mô được chứng minh có khả năng làm giảm nhiều biến chứng của các bệnh tim
mạch (Dzau V.J. 2005, Khakoo A.Y. 2005).
TBG trung mô là một quần thể tế bào giống nguyên bào sợi, có nguồn gốc từ chất nền
tủy xương, chiếm khoảng 0,001%-0,01% trong tổng số tế bào có nhân tủy xương. TBG
trung mô ở trạng thái chưa biệt hóa biểu hiện CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106
và Sca-1, không biểu hiện các marker thông thường cho tế bào tạo máu và tế bào nội mô
như CD14, CD31, CD34 và CD45 (Pittenger M.F. 2004, Sally A. Boxall và Elena Jones.
2012).
Sự tái sinh mô nhờ tế bào gốc hoặc TBTT được coi như là sự duy trì hay hồi phục lại
hệ thống của nhiều cơ quan trong cơ thể trưởng thành. Với những nghiên cứu và thành tựu
thu nhận được về tiềm năng tái sinh mô, các TBG hoặc TBTT này được coi là một nguồn
3
quan trọng trong các ứng dụng điều trị mô tổn thương (Hideki Iwaguro và Takayuki
Asahara).
Cấy ghép tế bào trở thành một phương pháp điều trị mới với việc sử dụng tế bào tiền
thân nội mô bổ sung cho tế bào nội mô nội tại trong các mạch máu ở người trưởng thành.
Các mạch máu bị tổn thương do các trạng thái bệnh lý như tiểu đường, tăng cholesterol
máu, hyperhomocysteinemia hay do tuổi tác có thể được sửa chữa nhờ chức năng của TBTT
nội mô. Các tế bào này có thể được huy động từ tủy xương, đưa vào trung tâm của mạch để
tham gia quá trình hàn gắn tổn thương. Sự tạo mạch được hình thành bởi sự hoạt hóa của
các tế bào nội mô tại chỗ và các tế bào tiền thân nội mô in situ hay TBTT nội mô được huy
động từ tủy xương.
Với những đặc điểm như đã đề cập, TBTT nội mô và TBG trung mô hứa hẹn một tiềm
năng khả quan cho liệu pháp điều trị bệnh tắc nghẽn động mạch ngoại vi nói riêng và các
bệnh lý tổn thương mô nói chung.
2.2. Liệu pháp tế bào trong tắc nghẽn mạch máuchi
Nhiều thí nghiệm trên động vật như chuột nhắt và chuột cống cũng như các động
vật lớn khác được chứng minh là mô hình hiệu quả và khả thi cho liệu pháp tế bào nhằm
phục hồi lại lưu lượng máu trong chi tắc nghẽn mạch. Các thí nghiệm này đã cho thấy
TBTT nội mô tuần hoàn tăng cao khi đáp ứng với chứng thiếu máu cục bộ (Shintani 2001,
Takahashi 1999). Các tế bào này di cư, định vị trong các mao mạch và động mạch kẽ trong
mô hình thiếu máu cấp tính chi (Takahashi 1999, Asahara 1999). Chúng cũng có thể tác
động theo con đường cận tiết nhờ sự tiết các nhân tố tạo mạch và cytokine (Kamihata 2001).
Những kết quả thu được từ liệu pháp này cho thấy các TBTT nội mô phát triển ex vivo khi
được cấy ghép vào chuột (bị phá tuyến ức) thiếu máu chi cục bộ có khả năng khôi phục lại
lưu lượng máu và làm tăng mật độ mạch nhánh. Hiệu quả cấy ghép cho thấy có khoảng 60%
chi được cứu sống, trong khi đó ở các lô thí nghiệm chỉ có 7% (Kalka 2000). Một số nghiên
cứu trên động vật thí nghiêm được tổng hợp trong Bảng 1:
Bảng 1: Tổng hợp các thí nhiệm trên mô hình động vật thiếu máu cục bộ sử dụng liệu
pháp tế bào.
Năm Tác giả
Loại tế bào
Đối tượng
1997 Asahara
TBTT nội mô Chuột nhắt
Kết quả
Cải thiện lưu lượng máu,
4
người
2002 Iba
tăng mật độ mao mạch
Tế bào có nhân Chuột cống Tạo mạch phụ
máu ngoại vi
2004 Ziegelhoeffer
Tế
bào
tủy Chuột nhắt
Phát triển mạch phụ
xương
2004 Kinnaird
TBG trung mô
Chuột nhắt
Tăng dòng máu qua mạch
phụ, cải thiện chức năng
chi, giảm teo cơ
2004 Niagara
2005 Napoli
Nguyên bào cơ Chuột nhắt
Tạo tế bào bao quanh mạch,
xương
tăng mức b-FGF, VEGF
Tế
bào
tủy Chuột nhắt
xương
2005 Takagi
Tế
bào
Cải thiện dòng máu, tăng
mật độ mao mạch
tủy Chuột cống Tạo mạch máu mới
xương
2005 Iwase
TBG trung mô, Chuột cống Cải thiện dòng máu
tế bào có nhân
2006 Awad
TBTT nội mô
Chuột nhắt
Hàn gắn và tăng trưởng
mạch máu
2006 Li
Tế bào có nhân Chuột
Tăng mật độ mao mạch,
máu ngoại vi
giảm hoại tử chi, có sự tạo
(nude)
tế bào bao quanh mạch
2007
Jeon
Tế
bào
tủy Chuột nhắt
xương
2008
Zhang
Tế
bào
xương
Tăng mật độ vi mạch, mức
b-FGF và VEGF
tủy Chuột nhắt
Tăng lưu lượng máu, tăng
mật độ mao mạch
Tuy nhiên, một hạn chế chính trong các nghiên cứu điều trị thiếu máu cục bộ chi là
mới chỉ thực hiện được trên mô hình thiếu máu cấp tính nhờ thắt mạch máu hoặc làm đông
máu ở động mạch đùi, chưa thực hiện được trên mô hình thiếu máu mãn tính. Một đòi hỏi
cấp thiết cho tới nay là phải tìm được một mô hình động vật đặc trưng, thực sự mắc chứng
5
xơ vữa động mạch, có như vậy mới tiếp cận nhanh được phương cách điều trị trên các bệnh
động mạch ngoại vi ở người.
Các nghiên cứu ngẫu nhiên với cỡ mẫu lớn, các kiểm soát giả dược là cần thiết và hiện
vẫn đang được tiến hành. Các nghiên cứu khác liên quan tới nhiều loại tế bào khác nhau,
liều lượng tối ưu, phương pháp phân lập tế bào, vai trò của các yếu tố kích khích tạo cụm tế
bào (colony stimulating factor), hướng hoạt động và sự hỗ trợ của các tế bào làm giảm sự
tiến triển của bệnh động mạch ngoại biên vẫn đang được tiến hành.
Tại Việt Nam, năm 1995, bệnh viện Truyền máu - Huyết học thành phố Hồ Chí Minh
đã bắt đầu tiến hành ghép ca ghép TBG từ tủy xương đầu tiên để điều trị cho bệnh nhân bị
bệnh về máu. Năm 2002, bệnh viện tiến hành ghép TBG tạo máu có nguồn gốc từ máu dây
rốn. Đến nay, riêng bệnh viện đã tiến hành ghép được trên 80 ca TBG các loại. Trên cả nước
đã có nhiều cơ sở y tế triển khai nghiên cứu ứng dụng ghép TBG trong trị liệu như bệnh
viện trung ương Huế, Bệnh viện nhi Trung ương, Bệnh viện Quân đội Trung Ương ...
Tuy nhiên, đối với điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu ngoại vi sử dụng tế bào gốc cho
tới nay, tại Việt Nam vẫn còn là một vấn đề mới.
3. Mục đích nghiên cứu
- Xây dựng và đánh giá mô hình chuột tắc nghẽn mạch máu chi.
-
Phân lập và định danh tế bào tiền thân nội mô, tế bào gốc trung mô tủy xương
chuột cho đồng ghép
-
Đánh gia hiệu quả điều trị chuột tắc nghẽn mạch máu chi bằng liệu pháp ghép tế
bào gốc từ tuỷ xương
4. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng và đánh giá mô hình chuột tắc nghẽn mạch
máu chi
Xây dựng mô hình chuột tắc nghẽn mạch máu chi
Mô hình chuột thiếu máu chi được xây dựng theo quy trình được biến đổi từ quy trình
của Robert S. Crawford và cộng sự (2007). Chuột tắc nghẽn mạch máu được tạo bằng cách
thắt động mạch cung cấp máu nuôi chi, sử dụng kỹ thuật thắt dây thun
Đánh giá hiệu quả xây dựng mô hình chuột bệnh thiếu máu chi cục bộ
Chuột sau khi gây mô hình được đánh giá dựa trên các tiêu chí được đề xuất bởi
Robert S. Crawford và cộng sự (2007).
6
Đánh giá các chỉ tiêu sinh lí
o
Đo lưu lượng máu bằng phương pháp chụp Doppler
o
Đánh giá sự thay đổi hình thái, màu sắc chi
o
Đánh giá sự phù nề chi bằng cách đo tỉ lệ khối lượng mô khô/ướt
o
Mức độ sống sót của mô bằng phương pháp MTT
Đánh giá sự thay đổi ở mô và tế bào
o
Nhuộm mô mô bằng Masson trichrome nhằm đánh giá mức độ tổn thương sợi cơ
dựa trên kiểu hình của từng sợi cơ.
Kết quả: Mô hình thiếu máu chi sau thắt động mạch đùi trên chuột nhắt trắng đạt
yêu cầu cho nghiên cứu.
Nội dung 2: Thu nhận, tăng sinh và đánh giá 2 nguồn tế bào : tế bào gốc trung mô
và tế bào tiền thân nội mô từ tủy xương chuột
Tủy xương chứa nhiều loại tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân gồm TBG tạo máu
(<2,5%), nguyên bào tạo mạch/TBTT nội mô và TBG trung mô (<0,0001%).
Quần thể tế bào tiền thân nội mô có khả năng tái tạo mạch máu mới và quần thể TBG
trung mô có khả năng sửa chữa mô hư hại được phân lập và xác định đặc tính như sau:
Phân lập tế bào tiền thân nội mô từ tủy xương chuột
Tế bào tiền thân nội mô từ tủy xương chuột được thu nhận và đánh giá đặc tính theo
các phương pháp được biến đổi từ phương pháp của Odongua Sangidor (2010) và Burnt
(2007).
Tế bào đơn nhân tủy xương sau khi thu nhận được nuôi trong môi trường đặc biệt cho
sự phát triển của tế bào tiền thân nội mô. Các TBTT nội mô ứng viên được cấy chuyền 3-5
lần được khẳng định đặc tính thông qua các chỉ tiêu
- Khả năng tạo bào lạc (colony)
- Khả năng tạo cấu trúc hình ống : Sự tạo cấu trúc hình ống sử dụng Matrigel thường
được sử dụng để chứng minh hoạt động tạo mạch của các tế bào nội mô mạch in vitro
- Kiểu hình miễn dịch của tế bào : Quần thể TBTT nội mô dương tính với
CD34/CD133 và âm tính với CD19/CD45.
Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột
7
Tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột được tiến hành thu nhận theo các phương
pháp được biến đổi từ phương pháp của Gnecchi và Mel (2007). Các TBG trung mô ứng
viên được cấy chuyền 3-5 lần được khẳng định đặc tính thông qua các chỉ tiêu:
- Khả năng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi
- Khả năng biệt hóa của tế bào: các TBG trung mô được xác nhận dựa trên khả năng
biệt hóa in vitro thành tế bào tạo xương, nguyên bào tạo mỡ, tế bào tạo sụn hoặc một số
dòng tế bào khác.
- Kiểu hình miễn dịch: TBG trung mô dương tính với CD73, CD44, CD105, CD90 và
âm tính với CD14, CD34, CD45
Kết quả: Quy trình thu nhận và nuôi cấy tăng sinh TBTT nội mô và quần thể TBG
trung mô đạt độ tinh sạch từ 90% trở lên.
Nội dung 3: Nghiên cứu điều trị tắc nghẽn mạch máu chi bằng liệu pháp tế bào
gốc
Đánh dấu tế bào ghép bằng chuyển gfp.
Quy trình chuyển nhiễm virus mang gen gfp vào tế bào được thực hiện theo quy trình
được đề xuất bởi Burnt và cộng sự (2011).
Sự biểu hiện của GFP trong tế bào EPC được kiểm định bằng flowcytometry.
Ghép tế bào vào chi tắc nghẽn mạch máu chuột.
-
Để đánh giá hiệu quả điều trị tắc nghẽn mạch máu chi, các thí nghiệm được tiến
hành như sau:
o
Thí nghiệm 1: Cấy ghép tế bào tiền thân nội mô tủy xương chuột vào chi tắc nghẽn
mạch máu
o
Thí nghiệm 2: Cấy ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột vào chi tắc nghẽn
mạch máu
o
Thí nghiệm 3: Cấy ghép kết hợp hai loại tế bào : tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và
tế bào gốc tủy xương chuột vào chi tắc nghẽn mạch máu
o
Thí nghiệm 4 (nghiệm thức đối chứng): tiêm PBS vào chi tắc nghẽn mạch máu của
chuột
-
Vị trí cấy ghép: tiêm trực tiếp vào mô
-
Mật độ tế bào ghép: 105 -106 tế bào/ con
-
Vị trí cấy ghép: tiêm trực tiếp vào vị trí thắt mạch máu
8
-
Cỡ mẫu cho mỗi lô thí nghiệm ít nhất là 15 con, lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý
bằng phần mềm thống kê với độ tin cậy trên 95%.
Đánh giá sự tác động của tế bào lên sự phục hồi chi tắc nghẽn mạch máu
Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm:
o
Đánh giá sự lưu thông và lưu lượng máu bằng chụp Doppler
o
Đánh giá sự hình thành mạch máu mới
o
Đánh giá sự thay đổi cấu trúc mô bằng phương pháp nhuộm hóa mô và hóa mô
miễn dịch
o
Chứng minh vai trò của tế bào ghép vào sự hồi phục mô
ü Đánh
giá sự tồn tại của tế bào ghép bằng phương pháp tách tế bào lưu dấu sử
dụng hệ thống FACS calibur
ü Kiểm
tra sự biệt hóa của tế bào ghép theo hướng tạo các tế bào thuộc cấu trúc
mạch máu sử dụng hệ thống FACS calibur, trong đó các marker theo hướng
tạo mạch (PECAM_CD31) và tạo cơ (Alpha-smooth muscle actin-ASMA)
được biểu hiện đồng thời với GFP
5. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu
5.1. Cách tiếp cận
-
Tổng kết các kết quả nghiên cứu về khả năng sửa chữa các mô tổn thương của tế
bào có nhân tủy xương trên thế giới, các phương pháp tạo mô hình chuột bệnh lý để đưa ra
giả thuyết khoa học cho nghiên cứu.
-
Triển khai thực nghiệm các mô hình nghiên cứu và đánh giá kết quả.
5.2. Đối tượng thí nghiệm và cỡ mẫu cho nghiên cứu
Đối tượng
+ Tế bào gốc trung mô tủy xương chuột
+ Tế bào tiền thân nội mô tủy xương chuột
+ Chuột bệnh tắc nghẽn mạch máu chi
Cỡ mẫu
+ Số lượng động vật cho 1 lần khảo sát tối thiểu là 15 con, số lần lặp lại tối thiểu là 3
lần.
+ Tất cả các số liệu thu nhận được được xử lí loại bỏ giá trị bất thường và xử lí thống
kê với độ tin cậy trên 95%.
9
5.3. Các phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chung
Các phương pháp thực hiện chính:
Phương pháp 1: Tạo mô hình chuột thiếu máu chi
Mô hình chuột thiếu máu chi được tạo theo quy trình được biến đổi từ quy trình của
Couffinhal và cs (1998). Chuột trên 6 tháng tuổi được gây mê bằng thuốc gây mê zoletil 1,5
-2,1 mg/kg. Động mạch chi được thắt và cắt ở hai vị trí: phía trên ngã ba động mạch chi
(thắt sát ổ bụng) và nút thắt phía dưới có thể trên hoặc dưới ngã ba động mạch kheo. Việc
kiểm tra hiệu quả thắt mạch máu được đánh giá thông qua sự bắt màu dung dịch trypan blue
ở phía sau vùng thắt. Nếu việc thắt chi thành công, dung dịch màu xanh sẽ không lưu thông
qua được phần mạch máu phía sau vùng thắt, do đó chi sau không bắt màu xanh. Ngược lại,
chi sau sẽ bắt màu xanh.
Phương pháp 2 : Đánh giá sự phù nề chi bằng cách đo tỉ lệ khối lượng mô khô/ướt
10
Tỉ lệ khối lượng mô ướt/khô thể hiện mức độ phù nề chi được đề xuất bởi Takako
Goto (2006) trở thành một trong những chỉ tiêu đánh giá mức độ phù nề ở chuột thiếu máu
chi cấp tính.
Quy trình tiến hành: Chuột được đánh giá sự phù nề chi tại thời điểm 3 ngày sau khi
thắt động mạch. Mô cơ đùi với khối lượng khoảng 0,1 – 0,5 mg được thu nằm ở bên dưới
mối cắt động mạch, sau đó chuyển vào tủ sấy ở nhiệt độ 55oC cho tới khi khối lượng không
đổi (khoảng 36-48 giờ).
Đánh giá kết quả: Tỷ lệ khối lượng mô trước khi sấy so với sau khi sấy (mô tươi/mô
khô) giữa chuột bình thường và các chuột bị thắt mạch máu phản ánh mức độ phù nề của
chuột. Sự khác biệt được đánh giá bằng phần mềm thống kê (p=<0,05).
Phương pháp 3: Đánh giá sự tắc nghẽn mạch máu bằng phương pháp chụp mạch
máu
Sự tắc nghẽn mạch máu làm giảm lượng máu chảy phía hạ nguồn, dẫn đến sự hủy hoại
moo và mạch máu ở khu vực phía sau vị trí tắc nghẽn. Sử dụng hệ thống chụp mạch máu có
thể xác định được cấu trúc mạch ở chuột mô hình bệnh lý so với chuột bình thường.
Phương pháp 4 : Thu nhận tế bào có nhân từ tủy xương chuột
Thu nhận xương chi trên và xương chi dưới của chuột nhắt trắng
Chuột được giết bằng cách kéo dãn đốt sống cổ và đặt lên khay nhôm, lột hết da phủ
hai chân chuột, cắt và thu nhận đùi chuột, đặt vào cốc chứa PBS. Toàn bộ phần cơ, gân, mỡ
đùi chuột được loại bỏ, thu nhận xương đùi và xương cẳng chân. Cuối cùng toàn bộ tế bào
tủy xương chuột được thu nhận.
Thu nhận tế bào có nhân từ tủy xương chuột
Tủy xương chuột được pha loãng với PBSA với tỉ lệ 1:1 và 0,5 ml Ficoll-Hypaque
được vào ống li tâm 1,5 ml. 1 ml hỗn hợp PBSA và tủy xương chuột được đặt nhẹ nhàng lên
trên lớp Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml), tiến hành ly tâm ở 450 g trong 20-30 phút ở nhiệt độ
phòng. Sau khi li tâm, một lớp tế bào đơn nhân nằm tại lớp giữa, ngay trên lớp mặt của
Ficoll-Hypaque được chuyển vào ống li tâm mới và rửa với PBSA. Cuối cùng, cụm tế bào
sau ly tâm được tái huyền phù trong một thể tích môi trường phù hợp.
Phương pháp 5 : Phân lập tế bào gốc trung mô và tế bào tiền thân nội mô tủy
xương
11
Quy trình tiến hành: Tế bào đơn nhân tủy xương được thu từ xương đùi và xương
cẳng chân ở chuột 4 tuần tuổi và được làm giàu nhờ phương pháp li tâm đẳng tỉ trọng trên
gradient Ficoll (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). Các tế bào đơn nhân được nuôi cấy chọn
trong môi trường EGM- 2 (cho phân lập TBTT nội mô) và nuôi trong môi trường
DMEM/F12, 20%FBS, 1% antibiotic-antimycotic 100X (Cho phân lập tế bào gốc trung
mô), thay môi trường sau mỗi 48 giờ.
Phương pháp 6: Đánh giá tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc ứng viên
Biệt hóa thành nguyên bào xương
Sự biệt hóa thành xương được xác định là trạng thái biệt hóa cuối cùng của các dòng
TBG trung mô. Một vài cocktail được sử dụng cảm ứng tế bào TBG trung mô thành các
nguyên bào xương. Sự tiếp xúc một thời gian dài của TBG trung mô với công thức
dexamethasone, AsAP và beta-glycerolphosphate cho kết quả là sự tích tụ calcium trong
chất nền và sự biểu hiện các marker tạo xương như sialoprotein xương osteocalcin và
osteonectic.
Hiệu quả biệt hóa của TBG trung mô thành nguyên bào xương được xác định nhờ sự
bắt màu với thuốc nhuộm Alizarin red. Alizarin (1,2-dihydroxyanthraquinone) là một loại
thuốc nhuộm có nguồn gốc thực vật. Trong rễ cây thiên thảo (Rubia tinctorum), chúng tồn
tại ở dạng glycoside. Alizarin còn bao gồm một nhóm các thuốc nhuộm tổng hợp từ các dẫn
xuất nhựa than đá. Alizarin red là dẫn xuất của Alizarin, được sử dụng để phát hiện ra ion
calci có trong các mẫu mô hay tế bào. Sự kết hợp giữa ion calci và Alizarin red tạo ra một
phức hợp Alizarin Red S-calci có màu đỏ cam.
Biệt hóa thành tế bào mỡ
Sự biệt hóa tạo mỡ của TBG trung mô có một số điểm quan trọng. Sự biệt hóa của
TBG trung mô thành tế bào xương và mỡ được điều hòa tế nhị và cân bằng. Với việc bổ
sung dexamethasone, indomethacin và ascorbate, TBG trung mô trong nuôi cấy lớp đơn sẽ
đi vào sự biệt hóa tạo mỡ.
Hiệu quả biệt hóa của TBG trung mô thành tế bào mỡ được xác xác định nhờ sự bắt
màu với thuốc nhuộm Oil red. Oil red là thuốc nhuộm có màu đỏ, hòa tan trong lipid. Khi
nhuộm mẫu tế bào cố định, bất kì nơi nào có chứa các giọt mỡ, Oil red sẽ hòa tan vào trong
đó làm chúng có màu đỏ.
12
Phương pháp 7: Đánh giá khả năng tự làm mới của tế bào gốc ứng viên bằng colony
assay
Các tế bào đơn nhân được pha loãng và trải trên đĩa 6 giếng ở mật độ 5x106 tế bào. Sau
2 ngày, thu các tế bào nổi và trải ở mật độ 106 tế bào/giếng trong đĩa 24 giếng có tráng
fibronectin. Khoảng giữa 3 tới 15 ngày, đếm số lượng bào lạc và bào lạc TBTT nội mô tăng
trưởng nhanh.
Phương pháp 8: Phân tích sự hình thành cấu trúc hình ống
TBTT nội mô ứng viên được thu nhận và trải trên đĩa nuôi 96 giếng ở mật độ 1-2 x 104
tế bào/giếng, có tráng Matrigel. Sau 24 giờ ủ ở 370C (ủ qua đêm), mỗi giếng được kiểm tra
trực tiếp dưới kính hiển vi. Các ống hình thành trong mỗi vùng được ghi nhận và tính trung
bình số cấu trúc ống trong 3-5 vùng ngẫu nhiên.
Phương pháp 9: Đánh giá tỉ lệ sống chết
Quy trình tiến hành: Quần thể tế bào đơn nhân được thu nhận và tái huyền phù trong
Staining Solution với mật độ 1-5 x 106 tế bào/ml. Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng từ 10-15 phút,
chắn sáng, quần thể tế bào được ly tâm 400 g trong 5 phút, thu cặn tế bào và tái huyền phù
thành tế bào đơn trong 0,5 ml Assay Buffer. Một thể tích dung dịch 7-ADD Assay
Fixative/Actinomycin D tương đương được thêm vào huyền phù tế bào và ủ ở nhiệt độ
phòng 15-30 phút. Cặn tế bào được thu nhận bằng cách ly tâm ở 400 g trong 5 phút, và rửa
lại 2 lần với 0,5 -1 ml Assay buffer. Các tế bào được phân tích ở kênh FL3 với hệ thống
flowcytometry, bước sóng kích thích 488 nm. Các tế bào chết bắt màu với thuốc nhuộm
được nhận diện nhờ ánh sáng kích thích và tỷ lệ tế bào chết được định lượng nhờ hệ thống
phân tích. Tỷ lệ tế bào sống được tính bằng 100% trừ tỷ lệ tế bào chết.
Phương pháp 10: Định danh tế bào gốc ứng viên bằng kỹ thuật Flow cytometry
Trong nghiên cứu này, việc đánh giá marker của TBG trung mô và TBTT nội mô sau
nuôi cấy được tiến hành dựa theo quy trình này và các tế bào ở lần cấy chuyền 3-5 được
chọn để phân tích marker đặc trưng cho TBG trung mô và TBTT nội mô.
Các TBTT nội mô sớm (nuôi ít hơn 2 tuần kể từ khi thu nhận) ứng viên sau khi tăng
sinh được xác định sự biểu hiện của các marker bề mặt CD34, CD117, CD133. TBTT nội
mô muộn biểu hiện marker bề mặt CD31, CD144, CD202b CD309. Cả hai loại tế bào đều
không biểu hiện với CD19/CD45.
Các TBG trung mô ứng viên sau khi tăng sinh được xác định sự biểu hiện của các
13
marker bề mặt CD29, CD44, CD105, CD90 ; không biểu hiện CD14, CD34, CD45
Từng loại tế bào sau khi phát triển phủ kín khoảng 70% bề mặt bình nuôi được xử lí
với trypsin/EDTA 0,25% và thu nhận tế bào đơn.
Cứ mỗi 106 tế bào được sử dụng để nhuộm với kháng thể trong 30 phút, trong tối, ở
40C.
Sau đó, tế bào được rửa 2 lần bằng FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa và tái huyền
phù tế bào trong 500 µl FACSflow.
Mẫu được phân tích bằng máy FacsCalibur (BD Bioscience). Tất cả các dữ liệu được
phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro ở 30.000 tế bào.
Phương pháp 11: Đánh dấu tế bào bằng phương pháp chuyển nhiễm virus mang
gen gfp
TBTT nội mô và TBG trung mô được nuôi trong môi trường chuyên biệt ở mật độ 2 x
104 tế bào/cm2 được chuyển nhiễm virus. Sau 24 giờ, hiệu quả chuyển nhiễm virus được
kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang và phân tích flow cytometry.
Phương pháp 12: Ghép tế bào
Tế bào mang gen gpf được tách khỏi bề mặt đĩa nuôi sử dụng trypsin/EDTA.
Lô thí nghiệm chuột thiếu máu chi được điều trị bằng ghép 106 tế bào gốc trung mô
trộn với 106 tế bào tiền thân nội mô trong 100µl PBS cho mỗi con, ghép tại vùng cơ vân
quanh vị trí mạch máu bị thắt, tại thời điểm trước 6 giờ tính từ khi thắt và cắt mạch máu đùi.
Ở nghiệm thức đối chứng, chuột được tiêm 100 µl PBS.
Số lượng chuột cho mỗi lô thí nghiệm là 15 con.
Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa, tế bào học, mô học được đánh giá trong khoảng thời
gian 15 đến 20 ngày kể từ ngày ghép tế bào.
Phương pháp 13: Nhuộm hóa mô
Cơ đùi được thu nhận và đông lạnh nhanh trong isopentane trong nitơ lỏng. Lát cát 5
µm được thực hiện trong thiết bị cắt siêu hàn.
Việc nhuộm H&E và Masson trichrome nhằm đánh giá cấu trúc và mức độ tổn thương
sợi cơ dựa trên kiểu hình của từng sợi cơ.
Đồng thời nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể kháng alpha-actin để đếm mật
độ động mạch.
Hình dạng và mật độ tế bào được đánh giá khi quan sát trên KHV điện tử.
14
Phương pháp 14: Đánh giá tồn tại của tế bào ghép bằng kĩ thuật FACS
Các tế bào được thu nhận và mô được tách thành tế bào đơn. Quần thể tế bào đơn lưu
dấu được nhận diện bằng kĩ thuật flow cytometry.
Quần thể tế bào lưu dấu nếu tồn tại với lượng 5% quần thể có thể được tách ra khỏi
quần thể bằng hệ thống tách tube catcher based cell sorter gắn trên máy flowcytometer.
Lượng tế bào này được sử dụng cho phân tích sự biệt hóa của tế bào theo hướng tạo mạch
và cơ mới (phương pháp 15)
Phương pháp 15: Kiểm tra sự biệt hóa của tế bào ghép theo hướng tạo các tế bào
thuộc cấu trúc mạch máu và tạo cơ
Các tế bào lưu dấu được phân tách từ phương pháp 14 được nhuộm với
PECAM_CD31 (marker đặc trưng cho sự biệt hóa của tế bào theo hướng tạo mạch) và
ASMA (Alpha-smooth muscle actin- marker đặc trưng cho sự biệt hóa theo hướng tạo cơ).
Sự biểu hiện của các marker này trong quần thể tế bào được phân tách từ phương pháp 14
chứng minh sự biểu hiện của các protein theo hướng tạo mạch được hình thành từ các tế bào
có nhân từ tủy xương chuột đực
6. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn
Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng tế bào gốc , trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc Gia Tp.HCM, 227 Nguyễn Văn Cừ, P4, Q5, Tp.HCM
7. Tài liệu tham khảo
• Phạm Mạnh Hùng (2005), Chuyên đề dành cho bệnh nhân: Các yếu tố nguy cơ của
bệnh tim mạch, tạp chí tim mạch học Việt Nam, số 40, Tr.100-107
• Đinh Thị Thu Hương, Nguyễn Tuấn Hải, Văn Tần, Phạm Minh Thông, Phạm Thắng,
Cao Văn Thịnh, Lê Nữ Hòa Hiệp, Đoàn Quốc Hưng, Nguyễn Văn Mão; Dương Đức
Hùng (2010), chuyên đề đào tạo liên tục: khuyến Cáo 2010 Của Hội Tim Mạch Học
Quốc Gia Việt Nam Về Chẩn Đoán Và Điều Trị Bệnh Động Mạch Chi Dưới (phần
I), tạp chí sinh học, số 58: 74-85
• Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc và CS, (2008) “Thu nhận tế bào gốc trung mô đa
năng từ máu cuống rốn người”, Tạp chí Y dược học quân sự, 2:119-124.
• Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009) Công nghệ tế bào gốc, NXB
Giáo dục.
15
• Trương Hải Nhung, Dương Thanh Thủy, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc, cấy ghép
tủy xương khác gen đồng loài điều trị bệnh suy tủy trên mô hình chuột, tạp chí phát
triển KH&CN, 13:5-10.
• Nguyễn Ngọc Quang, Wong Philip, Phạm Mạnh Hùng (2005), Chuyên đề tim mạch
can thiệp: Ứng dụng của tế bào gốc trong ngành tim mạch, Tạp chí tim mạch học Việt
Nam, 40:45-63
• Trần Quốc Tuấn, Huỳnh Nghĩa, Nguyễn Tấn Bỉnh và CS (2006), “Ghép TBGMNV
giữ đông lạnh -1960C tại BV.TMHH TP.HCM”, Y học thực hành, 545:230-233.
•
Abedin M., Tintut Y., and Demer L.L. (2004), Mesenchymal stem cells and the
artery wall, Circulation Research, 95: 671–676.
•
Asahara T., Murohara T., Sullivan A., et al. (1997), Isolation of putative
progenitor endothelial cells for angiogenesis, Science, 275: 964–967.
•
Asahara T., Masuda H., Takahashi T., et al. (1999), Bone marrow origin of
endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological
and pathological neovascularization, Circulation Research, 85: 221–228.
•
Awad O., Dedkov E.I., Jiao C., et al. (2006), Differential healing activities of
CD34+ and CD14+ endothelial cell progenitors, Arteriosclerosis, Thrombosis, and
Vascular Biology, 26: 758–764.
•
Dimmeler S., Zeiher A.M., and Schneider M.D. (2005), Unchain my heart: the
scientific foundations of cardiac repair, J. Clin. Invest., 115, 572–883.
•
Dzau V.J., Gnecchi M., Pachori A.S., Morello F., and Melo L.G. (2005)
Therapeutic potential of endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases,
Hypertension 46, 7–18.
•
E. Minar (2009), Critical limb ischaemia, Hämostaseologie, 29(1):102-109
•
Iwaguro H., Asahara T. (2004), Endothelial Progenitor Cell Culture and Gene
Transfer, Molecular Cardiology : Methods and Protocols, 112:239-247
•
Iba O, Matsubara H, Nozawa Y, et al. (2002), Angiogenesis by implantation of
peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs, Circulation,
106: 2019–2025.
•
Iwase T., Nagaya N., Fujii T., et al. (2005), Comparison of angiogenic potency
between mesenchymal stem cells and mononuclear cells in a rat model of hindlimb
16
ischemia, Cardiovascular Research, 66: 543–551
•
Li S., Zhou B., Han Z.C. (2006), Therapeutic neovascularization by
transplantation of mobilized peripheral blood mononuclear cells for limb ischemia. A
comparison between CD34+ and CD34- mononuclear cells, Journal of Thrombosis
Haemostasis, 95: 301–311.
•
Jeon O., Song S.J., Bhang S.H., et al. (2007), Additive effect of endothelial
progenitor cell mobilization and bone marrow mononuclear cell transplantation on
angiogenesis in mouse ischemic limbs, Journal of Biomedcical Science, 14: 323–330.
•
Kamihata H., Matsubara H., Nishiue T., et al. (2001), Implantation of bone
marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion
and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and
cytokines, Circulation, 104: 1046–1052.
•
Kalka C., Masuda H., Takahashi T., et al. (2000), Transplantation of ex vivo
expanded
endothelial
progenitor
cells
for
therapeutic
neovascularization,
Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 97: 3422–3427.
•
Khakoo A.Y., and Finkel T. (2005), Endothelial progenitor cells, Annual Review
of Medicine, 56:79–10
•
Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., et al. (2004), Local delivery of marrowderived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms.
Circulation, 109: 1543–1549.
•
Lawall H., Bramlage P., Amann B. (2010), Stem cell and progenitor cell therapy
in peripheral artery disease. A critical appraisal, Journal of Thrombosis Haemostasis,
103(4):696-709.
•
Gnecchi M. and Melo L.G. (2007), Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem
Cells: Isolation, Expansion, Characterization, Viral Transduction, and Production of
Conditioned Medium, Stem Cells in Regenerative Medicine: Methods and Protocols,
48:281-294
•
Niagara M.I., Haider H.K., Ye L., et al. (2004), Autologous skeletal myoblasts
transduced with a new adenoviral bicistronic vector for treatment of hind limb
ischemia. Journal of Vascular Surgerry, 40: 774–785.
•
Napoli C., Williams-Ignarro S., de Nigris F., et al. (2005), Beneficial effects of
17
concurrent autologous bone marrow cell therapy and metabolic intervention in
ischemiainduced angiogenesis in the mouse hindlimb, Proceedings of the National
Academy of Sciences of USA, 102:17202–17206.
Pittenger M.F., and Martin B.J. (2004), Mesenchymal stem cells and their
•
potential as cardiac therapeutics, Circulation Research, 95, 9–20.
Ralph A. Francescone III, Michael Faibish, Rong Shao (2011), Video Article: A
•
Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of
Tumor Cells, Journal of Visualized Experiments.
Sally A. Boxall and Elena Jones, Review Article: Markers for Characterization
•
of Bone MarrowMultipotential Stromal Cells, Stem Cells International, 1-12
Shao R. & Guo X. (2004), Human microvascular endothelial cells immortalized
•
with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro
angiogenesis, Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-94.
Shintani S., Murohara T., Ikeda H., et al. (2001), Mobilization of endothelial
•
progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation, 103:2776–
2779.
Iwase T., Nagaya N.T., Fujii T., Itoh T., Murakami S., Matsumoto T., Kangawa
•
K., Kitamura S. (2005), Comparison of angiogenic potency between mesenchymal
stem cells and mononuclear cells in a rat model of hindlimb ischemia,
Cardiovascular Research, 66:543 – 55.
Takahashi T., Kalka C., Masuda H., et al. (1999), Ischemia- and cytokine-
•
induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for
neovascularization, Nature Medicine, 5: 434–438.
Takagi Y., Omura T., Yoshiyama M., et al. (2005), Granulocyte-colony
•
stimulating factor augments neovascularization induced by bone marrow
transplantation in rat hindlimb ischemia, Journal Pharmacological Sciences; 99: 45–
51.
•
Takako G., Naoto F., Akira A., Kazuo K., Koji K., Hiroyuki T., Etsuro T.,
Noriaki W., Hidezo M. and Hiroshi I. (2006), Search for appropriate experimental
methods to create stable hind-limb ischemia in mouse, Tokai Jourcal Experimental
Clinical Medicine, Vol. 31, No. 3, pp. 118-122
18
•
Tsou S.Y., Croft C.L., Charo K. (2010), CCR2 mediates hematopoietic stem and
progenitor cell trafficking to sites of inflammation in mice, Journal Clinical
Investigation, 120:1192-203.
•
Urbich
C.,
and
Dimmeler
S.
(2004)
Endothelial
progenitor
cells.
Characterization and role in vascular biology, Circulation Research, 95, 343–353
•
Ziegelhoeffer T., Fernandez B., Kostin S., et al (2004), Bone marrow-derived
cells do not incorporate into the adult growing vasculature. Circulation Research, 94:
230–238.
•
Zhang H., Zhang N., Li M., et al. (2008), Therapeutic angiogenesis of bone
marrow mononuclear cells (MNCs) and peripheral blood MNCs: transplantation for
ischemic hindlimb, Annals of Vascular Surgery, 22: 238–247.
19
