Bacillus cereus và các loài bacillus khác

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM

MÔN: VI

SINH THỰC PHẨM

BACILLUS CEREUS VÀ CÁC LOÀI
BACILLUS KHÁC

Lớp: DHTP7A
GVHD: Ths. Đào Hồng Hà
TP HCM, 26 tháng 5 năm 2013.

Danh sách nhóm

1


Bảng phân chia công việc

Bacillus cereus

Giới thiệu hình thái, đặc tính + bệnh
do vsv gây ra
Phân lập, nhận dạng + quan hệ với
thực phẩm + tổng kết
Giới thiệu hình thái, đặc tính + bệnh
do vsv gây ra
Phân lập, nhận dạng + quan hệ với

thực phẩm + tổng kết
Giới thiệu hình thái, đặc tính + bệnh
do vsv gây ra
Phân lập, nhận dạng + quan hệ với
thực phẩm + tổng kết
Giới thiệu hình thái, đặc tính + bệnh
do vsv gây ra
Phân lập, nhận dạng + quan hệ với
thực phẩm + tổng kết
Giới thiệu hình thái, đặc tính + bệnh
do vsv gây ra
Phân lập, nhận dạng + quan hệ với
thực phẩm + tổng kết

Bacillus subtilis

Bacillus thuringiensis

Bacillus pumilis

Bacillus mensentericus

Phần 1: BACILLUS CEREUS
1. Giới thiệu
2


Một báo cáo trước đây về vụ ngộ độc thực phẩm với vi khuẩn Bacillus spp. đã được thực
hiện vào năm 1906 khi Lubenau mô tả một đợt bùng phát trong một viện điều dưỡng nơi 300
bệnh nhân và nhân viên mắc các triệu chứng của bệnh tiêu chảy, đau bụng và nôn mửa. Xuất

hiện bào tử vi khuẩn trong bữa ăn sau khi tiến hành phân lập món thịt viên. Mặc dù Lubenau
đặt tên là sinh vật này là Bacillus peptonificans, nhưng các đặc tính ông mô tả giống với chủng
B. cereus. Sau đó, bào tử hiếu khí này đã tiếp tục liên quan đến một số dịch bệnh ở châu Âu
vào giữa năm 1936 và 1943, chúng đã bị nghi ngờ gây ra 117 trong 367 trường hợp điều tra của
Ủy BanY tế Stockholm
Bacillus cereus vẫn không được kết luận chắn chắn như là một nguyên nhân gây ngộ độc
thực phẩm cho đến năm 1950, sau khi nguyên tắc phân loại của các giống đã được làm
rõ.Hauge mô tả bốn dịch bệnh ở Na Uy liên quan đến 600 người. Các xe thực phẩm chứa nước
sốt vani được chuẩn bị trước một ngày và bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi ăn. Mẫu của
nước sốt sau khi kiểm tra chứa từ 2,5* 10^7 đến 11*10^8 B. cereus ml. Báo cáo này và rất
nhiều những người đầu tiên châu Âu mô tả căn bệnh này, trong đó nổi bật là triệu chứng tiêu
chảy. Bây giờ nó đã được xác định ,B. cereus là nguyên nhân gây ra hai loại bệnh của bệnh
thực phẩm: một loại tương đối khởi phát muộn, "hội chứng tiêu chảy “và một khởi phát nhanh,
"hội chứng nôn” được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 ở Anh
Từ năm 1975 một số loài vi khuẩn Bacillus khác có liên quan với bệnh từ thực phẩm. Trong
các giai đoạn này, các phép kiểm tra đã không tìm thấy được mầm nhưng thực phẩm thừa và /
hoặc các mẫu lâm sàng đã phát hiện một số lượng lớn vi khuẩn Bacillus spp. Ít phổ biến hơn so
với sự bùng phát loài đặc trưng B. cereus,chúng thường liên quan rất chặt chẽ đến các loài như
B. licheniformis và B. pumilis hoặc B. subtilis. B. thuringiensis cũng được báo cáo là nguyên
nhân gây ra một đợt bùng phát ở Canada.
Nhìn chung, báo cáo phần lớn các trường hợp bệnh thực phẩm đều do Bacillus spp. Ở Anh
thì thấp hơn nhiều so với vi khuẩn Salmonella. Kể từ năm 1992 đã có tới 10 dịch bệnh mỗi năm
liên quan đến tổng số 67 trường hợp. Số liệu thống kê cho thấy mặc dù có thể đánh giá thấp
hơn mức độ thực sự so với vi khuẩn Salmonella từ các dữ liệu chỉ đến từ các ổ dịch mà không
có ước tính các trường hợp lẻ tẻ. Trong một số khu vực các nước Bắc Âu các sinh vật dường
như có tầm quan trọng lớn hơn nhiều.Nó chiếm 33% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn
ở Na Uy từ năm 1988 đến năm 1993, 47% ở Iceland (1985-1992), 22% ở Phần Lan (1992) và
8,5% ở Hà Lan (1991). Tại Đan Mạch, Anh và xứ Wales, Nhật Bản, Hoa Kỳ và Canada con số
này dao động trong khoảng 0,7 và 5,0%.

2. Hình thái và đặc tính

Các Bacillus là vi khuẩn
_Gram dương

3


Hình 1: Hình ảnh nhuộm gramvi khuẩn Bacillus cereus
_ Trực khuẩn
_Hiếu khí
_Bào tử dạng ovan và có khả năng sinh nha bào
_Có thể di chuyển bằng lông roi
Mặc dù vậy, có vài trường hợp lại là Gram âm hoặc có những biến đổi đa dạng . Phân loại
chúng khá phức tạp và đã được sửa đổi nhiều lần trong những năm gần đây.Chúng chứa
khoảng 80 loài, những loại gây ra ngộ độc thực phẩm thường là vi khuẩn Bacillus cereus, và
một số loài có liên quan khá chặt chẽ với B. cereus và Bacillus subtilis
Bacillus cereus là loài kị khí tùy tiện với các tế bào thực vật lớn,thường là chuỗi từ1,0 mm
bằng 3,0-5,0 mm. Nó phát triển ở nhiệt độ trong khoảng từ 8-55 C, tối ưu là khoảng 28-35 C,
và không có khả năng chịu đựng rõ rệt ở độ pH thấp (tối thiểu 5,0-6,0, tùy thuộc vào acidulant)
hoặc hoạt độ nước (tối thiểu ~0.95).
Bào tử là trung tâm, hình dạng elip và không gây ra sưng túi bào tử.Vì là một bào tử, B.
cereus có khả năng phân bố rộng rãi trong các môi trường và có thể được phân lập từ đất, nước
và thực vật. Sự phổ biến này nghĩa là nó cũng là một thành phần phổ biến của hệ sinh vật tạm
thời trong ruột ở người. Các bào tử cho thấy một khả năng chịu sự biến đổi nhiệt; ghi nhận giá
trị D tại 95 C trong khoảng bộ đệm phosphate từ 1 phút đến
36 phút.Sức chịu đựng dường như thay đổi theo chủng huyết thanh.
Tại Anh, một giản đồ các kiểu huyết thanh dựa trên kháng nguyên(H) các roi
đã được đưa ra, dựa trên một tập hợp của 29 dính kết kháng huyết thanh tăng lên chống lại các
chủng bùng phát và không có dịch bệnh nào được phân lập từ thực phẩm. Trong khoảng 90%

dịch bệnh có thể type huyết thanh sinh vật gây bệnh mặc dù môi trường phân lập được phân
loại chỉ khoảng một nửa của môi trường. Chúng không có khả năng liên kết giữa hai loài khác
nhau như B.cereus gây ngộ độc thực phẩm và trong huyết thanh. Một số được liên kết với cả
hai triệu chứng, nhưng trong một nghiên cứu từ 200 ổ dịch bệnh thì triệu chứng gây nôn mửa từ
khắp nơi trên thế giới, huyết thanh loại 1 có khả năng chịu nhiệt cao so với các loại huyết thanh
khác, chúng được phân lập từ những thực phẩm liên quan, mẫu phân lập hoặc từ mẫu chất nôn
ra ở 63,5% trường hợp.

4


B. cereus hình thành bào tử khi các chất dinh dưỡng đang khan hiếm trong môi trường và khi
có sẵn chúng nảy mầm thành các tế bào thực vật. Bào tử có một vỏ ngoài bền chắc được làm
bởi keratin.

3. Các triệu

Bào tử của B.cereus

chứng và bệnh lâm sàn:

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm
hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Độc tố:
vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
• Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rauquả,
gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêuchảy có thể
nguy hiểm đến tính mạng.
• Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậucác
loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và

dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây
chếtngười. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần
chosự phát triển của vi khuẩn
3.1 Triệu chứng nôn mửa:

Tính chất/ hoạt động

Mô tả
105-108 tb/g thực phẩm

Liều nhiễm độc Số lượng tế bào B.cereus:
Khối lượng độc tố

12-32µg/kg

Nhiệt độ thích hợp

25-30oC

Thời gian ủ bệnh

30 phút – 5 tiếng
5


Khoảng thời gian mang bệnh

6-24h

Loại thực phẩm thường gặp

Cơm, mì ống, phở, đậu …

Tên độc tố

Cereulide

3.2 Triệu chứng tiêu chảy:

Tính chất/ hoạt động

Mô tả

Liều nhiễm độc

105 tb/g hoặc / ml

Độc tố được sản sinh ra

Trong ruột non

Loại độc tố

Amin

Thời gian ủ bệnh

8-16 tiếng

Khoảng thời gian mang bệnh

12-24h

Triệu chứng thường gặp

Đau bụng dải dẳng, thỉnh thoảng buồn nôn

4. Phân lập và nhận dạng
4.1 Truyền thống: Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật

trên các môitrường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi
sinh vật khác nhau.
Ưu điểm:
Thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền.
Nhược điểm:
- Độ nhạy không cao.
- Yêu cầu kĩ năng thao tác cao.
-Tốn nhiều nhân công.
- Thời gian phân tích thường kéo dài.
4.1.1

Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
6


-Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 300C
-MYP: do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc
B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo
thành.

-MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng.
-Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng địnhB.cereus.
Các phản ứng khẳng định:
Nhuộm Gram: Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống
thạch dinh dưỡng ủ ở 30oC/ 24h  nhuộm Gram  quan sát dưới kính hiển vi tế bào
nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.
Các bước nhuộm Gram:
-Chọn phiến kính sạch, vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm  ở vị trí tương ứng với vòng
tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn  chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc
vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng  khuấy nhẹ bằng đầu que cấy để dungdịch huyền
phù đồng nhất  bôi đều trong khu vực của vòng tròn  để yên cho vệt bôi khô  đưa phiến
kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi (tránh để
vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa).
-Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dưới kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+) có
màu xanh tía, tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng. B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+),
thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có dạng bào tử nang.
-Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh
dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau.
4.1.2

Định lượng B.cereus bằng phương pháp MPN
10g mẫu vô trùng đồng nhất với 90ml
dd đệm phosphat bằng máy dập mẫu

DD mẫu pha loãng 10-1

Pha loãng mẫu 10-2, 10-3, 10-4

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp

Hút 0.1ml dịch pha loãng cho
vào mỗi đĩa MYP
7
( mỗi nồng độ hai đĩa)


Ủ 300C trong 24-48 giờ

Chọn và đếm các đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc đặc trưng
của Bacillus areus (dẹt, đường kính 2-3 mm, bờ hình
răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục)

Chuyển 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên
môi trường phục hồi TSA

Ủ ở 300C qua đêm

Tiến hành thử nghiệm sinh hóa

Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như: MannitoEgg-YolkPolymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb MannitolBromothym
ol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môi trường này.

.
Khuẩn lạc B.cereus trên MYPKhuẩn lạc B.cereus trên Bacara
8

Khuẩn lạc B.Cereus trên PEMBA


B. cereus trên thạch MYP

Phản ứng sinh hóa:
•

Thử nghiệm lên men glucose:

Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth ủ ở 35 0C/ 24h, kị khí  lắc mạnh
ống nghiệm,quan sát độ đục (sự phát triển). Nếu môi trường từ đỏ sang vàng thì chứng tỏ có sự
sinh acid glucose trong điều kiện kị khí.

Kết quả thử nghiệm lên men glucose
•

Thử nghiệm khả năng khử nitrate:

Cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth ủ 35 0C/24h, bổ sung vài giọt thuốc thử
nitrate, có màu cam xuất hiện trong 10 phút thì chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit.

9


Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống B cho kết quả
dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tínhvới nitrite.
•

Thử nghiệm VP:

Cấy vi khuần trong môi trường MR-VP ủ 48h, nhiệt độ 370C bổ sung thuốc thử (α-Napthol)
vào môi trường, lắc nhẹ.
Có 2 loại thuốc thử VP thích hợp trong trường hợp này là:
•Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40%

KOH hoặc NaOH.
•Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là 0.3%
creatine, 40% KOH hoặc NaOH.
Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đónhỏ 2
giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa
acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4h Tạo phức hồng là (+).

•

Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine:

Cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine, ủ 35 0C/48h  xuất hiện khoảng trống xung
quanh khuẩn lạc (chứng tỏ tyrosine bị phân hủy).
•

Thử nghiệm kháng Lysozyme:

Cấy vi khuẩn vào môi trường Nutrient Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với
môi trường không chứa lysozyme, ủ ở 350C/24h  kiểm tra sự tăng trưởng trong 2 môi trường.
Những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h  kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không.
Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không.
Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I:
10


Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây
bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides,
B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử
nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử
nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP, thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001%

lysozyme, được trình bày trong bảng sau:

Đặc tính

Bacillus
cereus
+(a)
+
+/-(b)

Bacillus
thuringiensis
+
+
+/-

Loài
Bacillus
mtcoides
+
+
-(c)

Bacillus
anthracis
+
+
-

Bacillus

megaterium
+
+
+/-(d)

+

+/-

-(d)

+/-

+

+

+

-

+

+

+

-

+

+

+

-

Gram
Catalase
Di động
Khử nitrate
Phân hủy
+
tyrosine
Kháng
+
lysozyme
Phản ứng với
lòng đỏ
+
trứng
Lên men
+
glucose
Phản ứng VP
Sinh acid từ
manitol
Tan máu (cừu)
+
a +:90 - 100% các chủng dương tính;

b +/-: 50% các chủng dương tính;
c - : 90 – 100% các chủng âm tính;
d - : Hầu hết các chủng âm tính.
•

-

-

-

+

+

+

-(d)

-

Thử nghiệm tính di động:

Phương pháp 1: Dùng que cấy vòng cấy dịch 24 giờ nuôi cấy thẳng vào giữa môi trường
kiểm tra di động cho B.cereus. Ủ ở 30 0C,từ 18-24h và kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc dọc theo
đường cấy. Kết quả: loài di động mọc khuyếch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy,
loài không di động mọc trong và dọc theo đường cấy.
Phương pháp 2: Bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng
Nutrient Agar. Cấy huyền phù vi khuẩn vào. Ủ thạch nghiêng trong 6-8h ở 30 0C. Nhỏ nước vô
trùng lên phiến kính và đặt sinh khối vi khuẩn vào. Quan sát dưới kính hiển vi kiểm tra sự di

đông. Hầu hết các chủng B.cereus, B.thuringiensis là di động, B.anthracis và B.mycoides
không di động
11


•

Thử nghiệm làm tan máu:

Cấy chuẩn lên môi trường thạch máu Tripticase Soy. Ủ ở 25 0C trong 24h. B.cereus làm
tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn (β) 2-4mm xung quanh vùng phát triền.
B.thuringiensis và B.mycodes cũng làm tan máu β. B.anthracis thường không tan trong máu sau
24h.

B.anthracis không làm tan máu
•

B.cereus làm tan máu

Thử nghiệm hình thành rễ giả:

Chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa Nutrient agar, ủ ở 30 oC/4872h. Sau đó kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo
nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides (cấu trúc giống như rễ
hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy).

12


B.cereus không có rễ giả

B.Mycoides có rễ giả
•

Sự tạo độc tố protein dạng tinh thế:

Cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêngnutrient agar, ủ 300C/ 24h để yên ở nhiệt độ
phòng /2-3ngày. Sau đó nhuộm bằng phẩm màu fuchsin, quan sát dưới kính hiển vi. Tinh thể
độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy, phát hiện được bằng kỹ thuật
nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương được nhuộm màu
tối, nhỏ hơn bào tử). Do đó nếu không quan sát được bào tử tự do cần để thêm vài ngày rồi
kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không tinh thể độc.
Cách tính kết quả:
•Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha lõang và hiệu chỉnh bằng tỉ
lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus).Ví dụ: số khuẩn lạc đếm được ở
13


độ pha lõang 10-4 là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B.cereus (được kiểm tra
bằng các phản ứng sinh hóa).
•Số tế bào B.cereus/1g thực phẩm = 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 5200000 (nhân 10 vì có 0.1ml
mẫu được trải dĩa)
4.2 Hiện đại
4.2.1 Phương pháp ELISA

Nguyên tắc: kỹ thuật ELISA là sừ dụng kháng thể đơn dòng phủ lên những đĩa giếng. Nếu có
sự có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại trên bề
mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sừ dụng kháng thể thứ cấp có
gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung 1 cơ chất
đặc hiệu của enzyme vào giếng, xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có
màu hay phát sang. Bằng cánh theo dỏi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng lượng

kháng nguyên.
4.2.1.1 Phương pháp Elisa trực tiếp (Direct Elisa)

Trong trường hợp này, kháng nguyên nằm trộn lẫn trong dung dịch đệm sẽ được cho vào
đáy giếng. Kháng nguyên sẽ liên kết cố định vào bề mặt của đáy giếng. Ủ một thời gian ngắn,
sau đó tiến hành rửa trôi. Những kháng nguyên nào không liên kết sẽ được đưa ra ngoài.
Thêm dung dịch chứa kháng thể có gắn enzyme vào giếng, kháng thể sẽ liên kết với
kháng nguyên tạo phức hợp gắn chặt vào giếng. Ủ một thời gian để phức hợp ổn định, sau đó
tiến hành rửa trôi. Những kháng thể nào không liên kết với kháng nguyên sẽ được rửa trôi.
Thêm dung dịch cơ chất có hệ đệm vào giếng. Nếu có sự tồn tại của phức hợp kháng
thể_Enzym_kháng nguyên thì cơ chất dưới tác dung của E sẽ tạo màu cho dung dịch. Dựa vào
sự xuất hiện màu và cường độ màu trong dung dịch sẽ định tính và định lượng được kháng
nguyên.

14


4.2.1.2 Phương pháp Elisa gián tiếp (Indirect Elisa)

Kháng nguyên sẽ được cho vào đáy giếng. Kháng nguyên sẽ liên kết cố định vào bề mặt
của đáy giếng. Ủ một thời gian ngắn, sau đó tiến hành rửa trôi. Những kháng nguyên nào không
liên kết sẽ được đưa ra ngoài.
Đưa kháng thể mục tiêu đặc hiệu vào giếng, ủ một thời gian và tiến hành rửa trôi, chỉ
những kháng thể đặc hiệu mới được giữ lại cùng kháng nguyên trên bề mặt đáy giếng.
Đưa tiếp dung dịch đệm chứa kháng thể thứ cấp có gắn emzyme vào, kháng thể này sẽ
liên kết với kháng thể mục tiêu. Tạo phức hợp kháng nguyên_kháng thể mục tiêu_kháng thể
thứ cấp_E. Cũng tiến hành ủ và rửa trôi.
Khi cho dung dịch chứa cơ chất vào giếng, cơ chất dưới xúc tác của E sẽ có phản ứng tạo
màu.
Phương pháp này chỉ khác với dạng trực tiếp là phải sử dụng kháng thể thứ cấp để gắn E

do kháng thể mục tiêu không thể gắn với E.

15


4.2.1.3 Phương pháp Elisa Sandwich:

Trực tiếp
Mẫu cần phân tích được cho vô trong đĩa giếng được phủ kháng thể chuyên biệt. Kháng
nguyên trong mẫu sẽ kết hợp với kháng thể trong đĩa giếng và trở nên bất động. Đĩa giếng này
tiếp tục được rửa để loại bỏ những kháng nguyên không kết hợp được với kháng thể. Sau đó,
phức hợp kháng thể - enzym (gồm kháng thể liên kết với enzym qua liên kết cộng hóa trị) được
thêm vô. Kháng thể của phức hợp này sẽ kết hợp với kháng nguyên bất động trong đĩa giếng
còn lại sau khi rửa để hình thành 1 “bánh sandwich” gồm: kháng thể – kháng nguyên – kháng
thể/enzyme trong đĩa giếng.
Sau khi loại bỏ kháng nguyên hoặc kháng thể, các cộng hợp tự do, cơ chất và chất phát
màu tương ứng với enzyme sẽ được cho vô và màu sẽ xuất hiện trong các giếng thử. Việc định
lượng kháng thể hoặc kháng nguyên được thực hiện bằng cách đo mật độ quang giữa mẫu
và chất chuẩn nhờ máy đọc ELISA.

16


17


Gián tiếp:

Xác Định Bacillus Cereus Bằng Phương Pháp Elisa
Hai loại độc tố gây ra trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus sinh ra là Emetic Toxin

(độc tố gây nôn) và Diarrhoeal Enterotoxin (độc tố gây tiêu chảy). Phương pháp xác định
Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin (BDE) bằng kĩ thuật phân tích Elisa được Terca International
Pty đưa ra qua bộ Kit Tecra® Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay.
4.2.2

Phương pháp PCR

Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis (Nobel 1993) phát minh, là
một kỹ thuật hiện phổ biến trong sinh học phân tử, dựa trên phản ứng khuyếch đại gene. Trong
đó môt đoạn DNA được nhân lên rất nhiều lần một cách nhân tạo bởi enzyme DNA Polymerase
mà không cần sử dụng vi sinh vật sống.

18


Trong tự nhiên, enzyme DNA Polymerase có trong nội bào sinh vật chuyên thực hiện
chức năng xúc tác cho các phân ứng nhân đôi sợi DNA theo nguyên tắc bổ sung. Phản ứng này
xảy ra trong giai đoạn phân chia tế bào.
Tuy nhiên quá trình này cũng có khả năng thực hiện ở trong điều kiện ống nghiệm
(Invitro). Ở đó, sợi DNA cũng được tách đôi thành hai sợi đơn bởi nhiệt độ cao (95 oC). Với xúc
tác Enzyme DNA Polymerase, mỗi sợi DNA đơn được bổ sung thêm tạo sợi kép. Tuy nhiên vơí
nhiệt độ cao như thế này thì E rất dễ bị phân hủy và mất đi hoạt tính.
Hiện nay, người ta đã tìm ra được những loại E chịu nhiệt độ rất cao, được tách từ loài
vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophilic) như vi khuẩn Thermus aquaticus, những E này gọi là Tag,
Flu. Nhiệt độ 110oC Tag và Flu vẫn không bị biến tính.
Về cơ bản, để thực hiện được kĩ thuật PCR cần một số các phần sau :
• Đoạn DNA mẫu (Template) chứa đoạn DNA cần khuếch đại
• Đoạn mồi (Primer) xác định điểm bắt đầu và điểm kết thúc
• Enzyme DNA Polymerase nhân đôi đoạn DNA
• Nucleotide là nguyên liệu cho phản ứng nhân đôi DNA

• Dung dịch đệm
Ngoài ra, do PCR thực hiện trong chu trình nhiệt (khoảng 20-30 lần) nên cần có máy
đun nóng và làm nguội môi trường phản ứng trong các ống nghiệm. Thiết bị điện di cần thiết để
xác định kích thước DNA (thực tế là trọng lượng đoạn DNA đã được khuếch đại).

Máy PCR
Nguyên lý của sự khuyếch đại PCR có thể tóm tắt như sau :
Một chu trình phản ứng gồm 3 bước, trong máy PCR tổng số chu trình lặp lại là 30 lần với thời
gian rất nhanh.
19


• Bước 1 : Duỗi xoắn DNA ở nhiệt độ 94 oC trong thời gian 1 phút. Chuỗi DNA kép được tháo
xoắn tạo 2 sợi đơn.
• Bước 2 : Gắn mồi ở 54 oC trong khoảng 45 giây. Primer sẽ bắt dính trên đoạn DNA đơn cần
nhân đôi một cách đặc hiệu
• Bước 3 : Kéo dài ở 72 oC trong 2 phút. Enzyme sẽ xúc tác phản ứng kéo dài mạch DNA bổ
sung cho tới khi gặp điểm kết thúc.

20


Hỗn hợp sau khi chạy PCR sẽ được nhuộm màu và phân tích bằng điện di trên bản gel
Agarose. Lượng DNA sau khi khuyếch đại sẽ có cùng trong lựơng phân tử và tập trung ở cùng
một vi trí trên bản gel. Kết quả điện di sẽ đem so sánh với thang DNA chuẩn để biết trong
lượng phân tử của đoạn DNA khuếch đại, cũng chính là mảnh DNA lúc ban đầu.
Xác định B.cereus bằng PCR:
Như đã trình bày ở phần mở đầu, Bacillus cereus là loài vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm
với hai triệu chứng : Nôn mửa (Emetic) và tiêu chảy (Diarrheic). Trong đó
độc tố gây môn mửa (Emetic toxin) là loại bền nhiệt do một loại gene có tên

Cereulide Synthetic (CRS) của vi khuẩn tổng hợp.
Kết quả sau khi điện di thể hiện sự có mặt của các đoạn gene như sau:
21






Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp
Lecithinase (LE) gene: 227bp
Internal Control (I.C.): 106 bp

Kết quả điện di
•

Hình ảnh điện di A có nghĩa là có Bacillus cereus hoặc các loài bacillus khác trong
mẫu thử có số lượng ít hơn giới hạn dưới của phép thử, hoặc cũng có thể do nhiễm
loài vi sinh vật khác loài bacillus.
• Hình ảnh B có nghĩa là trong mẫu có chứa Bacillus cereus gây độc tố Cereulide
(CRS).
•
Hình ảnh C chứng tỏ mẫu thử chứa Bacillus cereus không gây độc tố Cereulide (CRS),
hoặc chứa các loài cùng chi bacillus khác (Bacillus thuringensis, bacillus antharcis).
Mẫu phản ứng âm Nagative control reaction ( mẫu phân tích là nước tiệt trùng) sẽ cho
kết quả điện di trên hình A.
Nếu mẫu phản ứng âm cho kết quả điện di như hình B,C thì đã xảy ra quá trình nhiễm
khuẩn lạ khác trong suốt quá trình thực hiện phép phân tích. Lúc này cần phải rà soát lại quá
trình để đảm bảo sự vô trùng trong phân tích và tiến hành thử lại.
Nếu mẫu âm không cho kết quả điện di thì phản ứng PCR chạy không đúng kĩ thuật, hoặc

cũng có thể có các yếu tố khác ảnh hưởng đến như: hóa chất lạ, bộ kit bị hư hỏng…
Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất nhuộm khácnhau, nhờ
thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một phản ứng PCR. Tuy nhiên phương
pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau cho các trình tự
nhận biết khác nhau.[10]
Các phương pháp định lượng bằng Real time PCR
•Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green:
Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn vớisợi DNA
kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao tạo ra càng nhiều thì tínhiệu phát ra
22


của chất mầu sẽ tăng lên theo tỉ lệ thuận. Ưu điểm của phương pháp này là SYBR sẽ
đính vào bất cứ chuỗi DNA kép nào có mặt.
•Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan:
Kỹ thuật này sử dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các mẫu dò là một oligonucleotit
trong đó một đầu được gắn với chất nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầukia được gắn với
chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò sẽ
gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5’. Ở trạng thái này không có hiện tượng
phát huỳnh quang.Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của enzyme taqpolymerasemồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính
5’nuclease của taq-DNA polymerase. Sự phân giải mẫu dò sẽ làm giải phóng chất nhuộm
mầucó khả năng phát huỳnh quang khỏi ảnh hưởng kìm hãm của chất nhuộm có vai trò làm
tắtsự phát huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết được.
•Phương pháp đầu dò lai:
Trong kỹ thuật này một đầu dò được gắn với một chất cho huỳnh quang ở đầu 3’ vàmột đầu
dò thứ hai gắn với một chất nhuộm huỳnh quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần
nhau, cách nhau khoảng 1-5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ
kích thích chất nhận huỳnh quang và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang.

23

Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR
Ưu điểm: Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau:
• Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR
• Có thể định lượng chính xác sản phẩm PCR
• Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn
• Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng lúc trong cùng một ống nghiệm
nêngiảm khả năng nhiễm mẫu
4.2.3 Kĩ thuật latex agglutination (LA)
Sử dụng các hạt cao su có mầu có đính kháng thể đặc hiệu để định tính nhanh các chủngvi
khuẩn đã được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương ứng, quá trình kết tụ (agglutination)
sẽ diễn ra và có thể quan sát trực tiếp bắng mắt thường (tạo ra hạt hoặcdải có màu). Kĩ
thuật này có thể sử dụng để xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong môi trường
thuần sau khi phân lập từ thực phẩm.

4.2.4

Kĩ thuật lai phân tử( DNA- hybridization):
24


Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính chính xác vàđộ nhạy
cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc
với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiếtkế các mẫu dò và
sử dụng vật liệu phóng xạ.
5. Quan hệ với thực phẩm

B.cereus gây ngộ độc thực phẩm tại Hungary, nơi mà từ năm 1960 đến 1968 đó là lần thứ ba
gây ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất, thống kê khoảng 15,2% người bị ảnh hưởng. Số liệu gần

đây cho thấy tầm quan trọng của nó đã giảm đi phần nào, nhưng liệu điều này là do sự thay đổi
trong cách thức nấu ăn, cải thiện vệ sinh, giảm sự nhiễm bẩn của các loại gia vị hoặc các vật
phẩm.
B.cereus có khả năng sản xuất bào tử kháng các yếu tố như sấy khô và nhiệt làm cho trực
khuẩn gây ngộ độc thực phẩm được phân bố rộng trong thực phẩm. Tuy nhiên hầu hết các
trường hợp chúng chỉ là một lượng nhỏ trong tổng số và không đủ số lượng để gây bệnh.
Ttỷ lệ B.cereus trong sữa tiệt trùng (thường là 35-38% mẫu dương tính) cao hơn so với sữa tươi
(~9% mẫu dương tính). Trong hầu hết các trường hợp số lượng được phát hiện thấp hơn 10 3 ml.
Với sữa và kem bảo quản nhiệt độ không đủ lạnh, B.cereus có thể phát triển gây hiện tượng hư
hỏng như “đóng ván” (sweet curdling) hay “nổi bọt” (bitty cream)
Các hội chứng nôn mửa chủ yếu liên quan tới các sản phẩm tinh bột như các món ăn từ
gạo và mì ống. Bào tử, thường là các huyết thanh kháng nhiệt này, tồn tại trước lúc nấu đến nảy
mầm, phát triển và sản xuất các chất độc trong thời gian lưu trữ. Điều này có thể được ngăn
ngừa bằng cách làm lạnh xuống dưới 8 0C, nhưng tỉ lệ làm mát và ngay cả khi lưu trữ lạnh cũng
chỉ có thể làm chậm sự phát triển và sản xuất độc tố của các bào tử vi sinh vật. Hâm nóng cơm
trước khi ăn sẽ không làm bất hoạt những độc tố và không làm cho thực phẩm có tính an toàn.
Một số lượng lớn thực phẩm liên quan đến triệu chứng tiêu chảy bao gồm các sản phẩm từ
thịt, súp, rau, bánh tráng miệng và nước sốt. Các loại thảo mộc và gia vị khô được sử dụng
trong chế biến thực phẩm có thể là một nguồn quan trọng của B.cereus.

25