Tìm hiểu và thực tập quy trình định danh vi khuẩn staphylococcus aureus, heamophilus influnenae và klebsiall peneumoniae trên bệnh phẩm đàm tại bệnh viện nhân dân Gia Định

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
TÌM HIỂU VÀ THỰC TẬP QUI TRÌNH ĐỊNH ĐANH VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS
AUREUS, HEAMOPHILUS INFLUNENAE VÀ KLEBSIALL PENEUMONIAE TRÊN
BỆNH PHẨM ĐÀM TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH
CBHD: Ths.BS. NGUYỄN SỬ ÁNH TUYẾT
KS. NGUYỄN THÙY TRANG
GVHD: Th.S LƯU HUYỀN TRANG
SVTT: 1. DƯƠNG NGỌC THẢO - 10066551
2. NGUYỄN THỊ THÙY
3. PHẠM TRỌNG
4. PHAN HÙNG VƯƠNG
5. NGUYỄN NGỌC YẾN – 10271641
Lớp: CDSH12
Niên khóa: 2010 – 2013
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2013


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp và bài báo cáo thực tập này. Bên cạnh sự nổ lực của
bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập
những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được sự quan tâm cũng
như hướng dẩn tận tâm của Quý Thầy Cô , Cán Bộ và các Anh ( Chị ) tại bệnh viện, cùng với
những lời động viên và khích lệ từ phí gia đình và bạn bè trong lúc em gặp khó khăn.
Chúng em xin được gởi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công
Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, Quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm đã tận

tình dạy dỗ, trang bị cho chúng em những kiến thức, những kinh nghiệm quí báo, để chúng em có
được kiến thức thực hành trong thực tiển và vận dụng trong cuộc sống.
Chúng em xin cảm ơn chân thành đến Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết và KS Nguyễn Thùy Trang
đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em thực tập và tận tình giúp đỡ, hướng dẩn trong suốt quá
trình thực tập khoa vi sinh của bệnh viện.
Chúng em xin gởi lời cảm ơn Th.S Lưu Huyền Trang , Cô đã tận tình hướng dẩn, cung cấp kiến
thức và giúp đỡ nhóm chúng em để hoàn thành bài báo cáo thực tập này.
Chúng em cũng xin cảm ơn các Anh (chị) tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định đã chỉ dạy, quan
tâm và giúp đỡ chúng em trong quá trình thực tập tại Bệnh Viện.
Đồng thời chúng em xin cảm ơn đến gia đình và tập thể lớp CDSH12 trường Đại Học Công
Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã động viên, giúp đỡ trong những năm học vừa qua và trong
quá trình thực tập.
Nhóm chúng em xin chân thành cảm!
T.p Hồ Chí Minh tháng 5 năm 2013

Trang 2


NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định
CBHD: Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết
KS Nguyễn Thùy Trang
Nhận xét:
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................

................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
T.p Hồ Chí Minh, ngày…..tháng…. năm 2013
Cán bộ hướng dẫn:

Trang 3


NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định
GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang
Nhận xét:
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
T.p Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2013
Giảng viên hướng dẫn:

Trang 4


MỤC LỤC
1.

GIỚI THIỆU .......................................................................................................................... 7

1.1

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 7

1.2

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................................. 8

1.3

MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ ..................................................................................................... 8

1.4

PHẠM VI ĐỀ TÀI ................................................................................................................ 9

2.

TỔNG QUAN ........................................................................................................................ 9

2.1.

GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH ................................................. 9

2.1.1.

Lịch sử hình thành và phát triển ........................................................................................... 9

2.1.2.

Cơ cấu tổ chức. .................................................................................................................... 11

2.2.

KHOA VI SINH .................................................................................................................. 13

2.2.1.

Giới thiệu khoa .................................................................................................................... 13

2.2.2.

Chức năng và nhiệm vụ....................................................................................................... 13

2.2.3.

Thành tích đạt được ............................................................................................................. 14

2.2.4.

Hướng phát triển trong tương lai ........................................................................................ 15

2.3.
CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY
BỆNH 15
2.3.1.

Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm ...................................................................................... 15

2.3.2.

Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................................. 15

2.3.3.

Phương pháp định danh sinh hóa........................................................................................ 16

2.3.4.

Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY ..................................................... 25

Trang 5


2.3.5.

Chuẩn bị môi trường. .......................................................................................................... 25

2.4.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................................ 27

2.4.1.

Haemophilus influenzae ...................................................................................................... 27

2.4.2.

Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae........................................................................................ 37

a.

Đặc điểm phân loại .............................................................................................................. 37

2.4.3.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ......................................................................................... 40

3.

NỘI DUNG THỰC TẬP .................................................................................................... 49

3.1.

DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .................................................................................................. 49

3.1.1.

Dụng cụ ................................................................................................................................ 49

3.2.

PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU BỆNH PHẨM ................................................................... 50

3.2.1.

Chỉ định ................................................................................................................................ 50

3.2.2.

Thời điểm lấy mẫu............................................................................................................... 51

3.2.3.

Cách lấy mẫu đàm ............................................................................................................... 51

3.3.

ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHẨM ĐÀM ........................................................................... 52

3.3.1.

Khảo sát đại thể mẫu đàm ................................................................................................... 52

3.3.2.

Khảo sát vi thể ..................................................................................................................... 53

3.4.

TIẾN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN ................................................................ 53

3.4.1.

Quy trình định danh H. influenzae. .................................................................................... 53

3.4.2.

giải thích quy trình .............................................................................................................. 54

3.4.3.

Phương pháp định danh Klebsiella pneumoniae ............................................................... 56

MỤC LỤC BẢNG+HÌNH

Trang 6


MỤC LỤC CÁC CHỬ VIẾT TẮT(NẾU CÓ)

1. GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẩn đường hô hấp không chỉ là gánh nặng bệnh tật mà còn là bệnh lý có tỷ lệ tử vong
đứng đầu trong số 10 bệnh lý nhiễm trùng ở các nước có thu nhập thấp Yếu tố rất quyết định để
góp phần chống đở được gánh nặng này là vấn đề tìm ra tác nhân đích gây bệnh và tìm ra loại
kháng sinh phù hợp trong điều trị kinh nghiệm khi đứng trước một bệnh nhân nhiễm khuẩn hô
hấp. Chính vì vậy sự hiểu biết về các tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn hô hấp cũng như
các thách thức phải quan tâm hiện nay trong đề kháng các kháng sinh của các vi khuần này là
những vấn đề gì.
Các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp bao gồm viêm xoang , viêm tai giữa , viêm amydale là các
bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên, và viêm phổi, viêm phế quản – phổi là các

bệnh lý viêm nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới. Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây các bệnh lý
nhiễm khuẩn hô hấp cấp là Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae và Moraxella
catarrhalis. Riêng đối với bệnh lý viêm amydale thì mặc dù tác nhân siêu vi được xem là
nguyên nhân của gần 50% các trường hợp, nhưng Streptococcus pyogenes là tác nhân vi khuẩn
hàng đầu phải được các nhà lâm sàng nghĩ đến. Ngoài các tác nhân vi khuẩn trên thì các tác nhân
vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella
pneumophila cũng là những tác nhân vi khẩn cần phải được quan tâm.
Đó là vấn đề chung trong tình hình bệnh hô hấp hiện nay.Vì vậy quy trình tìm khuẩn gây bệnh
đường hô hấp là rất quan trọng trước hết là lấy bệnh phẩm rồi đánh giá có tồn tại sự có mặt của
khuẩn hay không. Theo xét nghiệm thường quy thì bệnh phẩm có liên quan đến bệnh đường hô
hấp nhiều nhất được lấy từ mẫu đàm. Vì trong bệnh phẩm đàm có chứa rất nhiều vi khuẩn liên
quan đến bệnh lý theo khảo sát tại nhiều bệnh viện trong nước.

Trang 7


Đàm tươi thường chứa nhiều lao khuẩn ẩn trú dịch phế quản và vùng họng. vì vậy đánh giá mẫu
đàm là đánh giá khá chính xác nguyên căn bệnh về đường hô hấp.các vi khuẩn thường chứa
trong mẫu đàm gồm Staphylococci,Streptococci,Haemophilus influenza ,Klebsiella pneumoniae,
M. catarrhalis và bacillus Koch…Sự có mặt của các vi khuẩn này theo khảo sát có ảnh hưởng
quan trọng đến bệnh lý đường hô hấp.
Vi khuẩn là tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp phổ biến nhất. Vi khuẩn hiếu khí chiếm ít nhất
73% và nấm chiếm 4% các vi sinh vật phân lập được từ đàm và dịch hút phế quản ở bệnh nhân
Vi khuẩn thường là nhiễm khuẩn đa tác nhân và trực khuẩn Gram âm là các thường gặp. Tuy
nhiên, MRSA và các cầu khuẩn Gram dương khác kể cả phế cầu (Streptococcus pneumoniae)
ngày càng xuất hiện phổ biến. Tại các bệnh viện thì các chủng Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens và Proteus sp.
chiếm 50% các tác nhân phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp.Trong đó Escherichia coli
(29,7%), Klebsiella spp. (26%), Pseudomonas aeruginosa (13,7%), Staphylococcus aureus (6%),
Acinetobacter spp. (5%), Haemophilus influenza,(tháng 8/2008, khoa vi sinh bệnh viện nhân dân

Gia Định).
Trong tất cả các tác nhân gây bệnh kể trên thì ba tác nhân: Staphylococcus aureus, Haemophilus
influenza,Klebsiella pneumoniaelà những vi khuẩn thường có mặt trong mẫu bệnh đàm đáng
được quan tâm. Chính vì lẽ đó, nhóm chúng tôi đã thực hiện quá trình tìm hiểu..., quy trình
định danh và phương pháp thực hiện kháng sinh đồ đối với ba loại vi khuẩn này.

1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Là những mẫu bệnh phẩm đàm của các bệnh nhân từ khoa lâm sàng gửi tới khoa vi sinh tại bệnh
viên nhân dân Gia định có chỉ định cấy vi khuẩn, định danh và làm kháng sinh đồ.

1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ
 Mục đích

Trang 8


Tìm hiểu, theo dõi và thực hành thao tác phân lập và định danh,kháng sinh đồ với các chủng
Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh
phẩm đàm.
 Nhiệm vụ
Hiểu được nguyên lý, nắm vững các thao tác về lấy mẫu bệnh phẫm, các thao tác trong quy trình
định danh, làm kháng sinh đồ với chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,
Klebsiella pneumoniae trong mẫu bệnh phẩm đàm.

1.4 PHẠM VI ĐỀ TÀI
Đề tài được thực hiện trên tất cả các bệnh phẩm đàm thu nhận được tại khoa vi sinh bệnh viện
nhân dân Gia định. Các thao tác, quy trình định danh vi khuẩn dùng để báo cáo là những thao
tác, quy trình đang được áp dụng tại bệnh viện Nhân Dân Gia Định.
 Thời gian
Từ 1/03/2013 đến 31/05/2013

 Địa điểm
Khoa Vi sinh Bệnh viên nhân dân Gia Định Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh,
Thành Phố Hồ Chí Minh

2. TỔNG QUAN
2.1.

GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH

Vị trí địa lý: Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh

2.1.1. Lịch sử hình thành và phát triển

Trang 9


Bệnh viện Nhân Dân Gia Định sơ khai do người Pháp xây dựng với bảng hiệu là Hospital de
Gia Định, trong những thập niên đầu của thế kỷ XX.

-Năm 1945, Hôpital de Gia Định được đổi tên thành bệnh viện Nguyễn Văn Học.
- Đến năm 1968 bệnh viện được phá đi và xây dựng mới với mô hình 4 tầng để tiếp nhận điều trị
khoảng 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và đổi tên thành Trung tâm thực tập y khoa Gia Định.
- Từ sau năm 1975, bệnh viện Nguyễn Văn Học được đổi tên thành bệnh viện Nhân Dân Gia
Định
- Đến năm 1996, bệnh viện được phân hạng là bệnh viện loại I (quyết định số 4630/QĐ-UB-NC)
với nhiệm vụ khám chữa bệnh và là cơ sở thực hành của trường Đại học Y – Dược TP. Hồ Chí
Minh.
- Từ bệnh viện ban đầu được xây dựng với quy mô cho 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và khoảng
1.000 lượt người đến khám chữa bệnh ngoại trú, hiện nay số lượng người đến khám chữa bệnh
ngoại trú trung bình khoảng 3.000 lượt/ngày và bệnh nhân điều trị nội trú trên 1.000 bệnh

Trang
10


nhân/ngày. Trước tình hình qúa tải trầm trọng cả khu vực nội trú và ngoại trú, bệnh viện đã được
xây dựng mới khu khám bệnh – cấp cứu 4 tầng với tổng diện tích 10.100 m2 , đã đưa vào sử dụng
vào tháng 7/2007.
- Hiện tại, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định là bệnh viện đa khoa loại 1 trực thuộc Sở Y tế TP. Hồ
Chí Minh với quy mô 1.200 giường, khám chữa bệnh cho nhân dân sinh sống trên địa bàn TP.
Hồ Chí Minh (các quận trong tuyến: Bình Thạnh, Gò Vấp, Phú Nhuận, một phần Quận I và các
quận ngoài tuyến: Thủ Đức, Quận 2, 12, 9 . . ), ngoài ra bệnh viện còn tiếp nhận bệnh nhân đến
từ các tỉnh thành lân cận như Đồng Nai, Bình Dương, Vũng Tàu và một số tỉnh miền Trung.
Bệnh viện có đủ các chuyên khoa lớn, với nhiều phân khoa sâu, bệnh viện được trang bị khá đầy
đủ trang thiết bị y tế nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán, điều trị và chăm sóc bệnh nhân, đáp
ứng được nhu cầu khám chữa bệnh ngày càng cao của nhân dân.
- Bệnh viện còn là cơ sở thực hành của 2 trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh và Đại học Y
khoa Phạm Ngọc Thạch. Trung bình mỗi năm bệnh viện tiếp nhận khoảng 1500 học viên đến
thực tập thuộc hệ trung học, hệ đại học và sau đại học.

2.1.2. Cơ cấu tổ chức.
Ban giám đốc:

 Phòng chức năng

Trang
11


 Phòng chỉ đạo tuyến

 Khoa ngoại lồng ngực – mạch máu

 Phòng hành chính quản trị

 Khối sản:

 Phòng kế hoạch tổng hợp

 Khoa sản bệnh

 Phòng điều dưỡng

 Khoa sản phụ

 Phòng tài chính kế toán

 Khoa sản trường

 Phòng vật tư – thiết bị

 Khoa sanh

 Phòng cán bộ

 Khoa bệnh lý sơ sinh

 Khoa lâm sàng:

 Khoa nhi

 Khối nội:

 Chuyên khoa:

 Nội tiêu hóa

 Khoa tai mũi họng

 Hồi sức tích cực – chống độc

 Khoa răng hàm mặt

 Khoa lão học

 Khoa mắt

 Khoa nội hô hấp – cơ xương khớp

 Các khoa khác:

 Khoa nội tiết – thận – niệu

 Khoa cấp cứu

 Khoa nội thần kinh – huyết học – y

 Khoa khám bệnh
 Khoa cận lâm sàng:

học cổ truyền
 Khoa nội tim mạch

 Khoa dược

 Khối ngoại:

 Khoa dinh dưỡng

 Khoa phẩu thuật – gây mê – hồi sức

 Khoa sinh hóa huyết học

 Khoa chấn thương chỉnh hình

 Khoa vi sinh

 Khoa tổng hợp

 Khoa chuẩn đoán hình ảnh

 Khoa ngoại thần kinh

 Khoa nội soi - thăm dò chức năng

 Khoa ngoại tiêu hóa

 Khoa giải phẩu bệnh lý

 Khoa ngoại thận – tiết niệu

 Khoa chống nhiễm khuẩn


Trong nhiều năm qua bệnh viện đã có nhiều thành tích đáng ghi nhận trong việc cứu chữa bệnh
và nghiên cứu khoa học chẳng hạn như có thể mổ ghép thận, phẩu thuật vi mạch điều trị co giật
nửa mặt,…và nhiều nghiên cứu khoa học khác

Trang
12


Với nhiều trang thiết bị ngày càng tiên tiến cùng với đội ngũ y bác sĩ giàu kinh nghiệm,bệnh viện
sẽ có nhiều hướng phát triển hơn nữa trong tương lai.

2.2.

KHOA VI SINH

2.2.1. Giới thiệu khoa
Năm 1978, từ khoa xét nghiệm bao gồm sinh hoá - huyết học – vi trùng, bộ phận vi trùng học
tách ra để lập khoa riêng với tên gọi KHOA VI TRÙNG hoạt động độc lập với khoa Sinh hoá Huyết học.
Năm 1998, khoa được đổi tên thành KHOA VI SINH cho đến nay.
Khoa gồm có 17 công nhân viên chức
Phó trưởng khoa: Ths.Bs Nguyễn Sử Minh Tuyết
Cán bộ trên đại học: 01 (thạc sỹ vi sinh y học)
Cán bộ đại học: 04 (02 bác sĩ, 02 kỹ sư)
Cán bộ trung cấp (kỹ thuật viên xét nghiệm): 11
Hộ lý: 01

2.2.2. Chức năng và nhiệm vụ
a. Chức năng
Khoa Vi sinh là nơi thực hiện các kỹ thuật về vi khuẩn học, ký sinh trùng học, miễn dịch học
nhằm đáp ứng yêu cầu khám chữa bệnh của bệnh nhân.
b. Nhiệm vụ
• Xét nghiệm tìm ký sinh trùng đường ruột.

Trang
13


• Thực hiện các xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho bệnh nhân nội trú và ngoại trú tại bệnh viện.
Bên cạnh đó, chúng tôi còn thực hiện nuôi cấy vi khuẩn cho các đơn vị bạn: bệnh viện Ung
Bướu, Bình Thạnh, Quận 1, bệnh viện quốc tế Vũ Anh ...
• Thực hiện các xét nghiệm miễn dịch học bao gồm: HIV, viêm gan siêu vi A, B, C, sốt xuất
huyết Dengue, Helicobacter pylori; xét nghiệm sàng lọc một số bệnh bẩm sinh (Toxoplasmosis,
Rubella, Cytomegalovirus). Các phản ứng huyết thanh học như: Widal, ASO, RF; thử phản ứng
lao tố (IDR), test thử thai ...
• Thực hiện nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm; thẩm định kết quả xét nghiệm trước khi trả cho
các khoa lâm sàng.
• Thực hiện công tác kiểm tra vô khuẩn chung trong toàn bệnh viện và một số bệnh viện tuyến
dưới (bệnh viện Bình Thạnh, bệnh viện Quận 1).
• Theo dõi sự đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được.
• Nghiên cứu khoa học các đề tài thuộc lãnh vực vi sinh y học.
• Phối hợp với các khoa lâm sàng giải quyết các vấn đề liên quan về chuyên môn, hội chẩn các
trường hợp nhiễm trùng đa kháng thuốc.

2.2.3. Thành tích đạt được
Nuôi cấy các loại bệnh phẩm như máu, mủ, đàm, nước tiểu, phân, các loại dịch (mật, não tuỷ,
màng phổi ...); phân lập và định danh các loại vi khuẩn thông thường; tiến hành làm kháng sinh

đồ; theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn mỗi 6 tháng – 1 năm.
• Kiểm tra vô khuẩn định kỳ các khoa trong bệnh viện, lưu ý các khoa trọng điểm như Hồi sức
tích cực - chống độc, Hồi sức ngoại, Phòng mổ, Bệnh lý sơ sinh. Thực hiện cấy không khí, nước,
tay phẫu thuật viên, y dụng cụ ...

Trang
14


• Các xét nghiệm miễn dịch học: HIV (Determine, Vironostika, Murex), viêm gan siêu vi
(HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, antiHBc-IgM/IgG, antiHCV, antiHAV-IgM/IgG),
Toxoplasma gondii (IgM, IgG), Rubella (IgM, IgG), Cytomegalovirus (IgM, IgG).
• Tham gia công tác ngoại kiểm tra chất lượng của Trung tâm Kiểm chuẩn TP.HCM với đánh giá
“Kết quả hoàn toàn phù hợp”.
• Hướng dẫn sinh viên các trường Đại học đến thực tập và làm Luận văn tốt nghiệp.
• Tham dự và báo cáo trong các hội nghị Khoa học kỹ thuật, lao động sáng tạo – sáng kiến cải
tiến trong và ngoài bệnh viện

2.2.4. Hướng phát triển trong tương lai
Triển khai nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí, huyết thanh chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng, các xét
nghiệm sinh học phân tử đáp ứng nhu cầu cung cấp các dịch vụ xét nghiệm chẩn đoán toàn diện.

2.3.

CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY

BỆNH

2.3.1. Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm
2.3.2. Phương pháp nhuộm Gram

Mục đích: xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước định danh tiếp theo.
Nguyên tắc: khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu tím gentian và một chất gắn màu Iodine như
Lugol nếu ta tẩy màu bằng aceton, vi khuẩn Gram dương có lớp peptidolycan dày ăn màu tím
của gentian, ngược lại vi khuẩn Gram âm bị tẩy mất màu tím. Khi nhuộm lại với safranin 0,5%,
nhóm Gram dương vẫn giữ màu tím còn nhóm Gram âm sẽ bắt màu đỏ.
Tiến hành
- Phết nhuộm được cố định trên lame.

Trang
15


- Phủ tím Genatin lên phết nhuộm trong 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính đểcho ráo.
- Phủ Lugol lên phết nhuộm trong 2 phút.Rửa nước và nghiêng kính cho ráo.
- Rửa acetol lên phết nhuộm, tẩy giọt cuối cùng còn phết tím. Rửa bằng nước và nghiêng kính
cho ráo.
- phủ lại với dung dịch Safranin trong 30 giây. Rửa nước và thấm khô vết nhuộm.
- Quan sát ở vật kính dầu.
Đọc kết quả: vi khuẩn Gram dương giữ màu tím của tím gentian, vi khuẩn
Gram âm giữ màu hồng đỏ của Safranin.

2.3.3. Phương pháp định danh sinh hóa
Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên các loại môi trường khác nhau như MC,
BA,… Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh
Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh
• Thử nghiệm khả năng lên men
Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác
nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2,…Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo
thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
• Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ
tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và Nnapthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng.
• Thử nghiệm ONPG

Trang
16


Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả2 loại men
lactose permease và β-galactosidase. Một số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men
lactose chậm chỉ sản xuất được β-galactosidase. Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa
một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG).Sự thủy phân của cơ chất
đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng.
• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi sinh
vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối
ammonium làm nguồn đạm duy nhất.Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm
trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị
bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
• Thử nghiệm Urease
Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm
môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường thửnghiệm làm môi trường
chuyển sang màu đỏ.
• Phenylalanine deaminase (PAD)
Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản
xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết
hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây.
• Thử nghiệm bile esculine
Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong
esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ

phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen.
• Thử nghiệm khả năng sinh indol

Trang
17


Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong
môi trường canh trypton. Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với
Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl
ammonium màu đỏ.
• Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao
đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành
diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ.
• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy
nhất trong môi trường. Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sửdụng chu trình glyoxylic acid
để biến dưỡng năng lượng. Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một
chất diệt khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng
ammonium là nguồn đạm duy nhất. Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự
phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH.
• Thử nghiệm KIA
Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S
và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1%. Sau khi nuôi
cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:
+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH
kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải thích do visinh vật sau khi sử dụng
hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi
trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi

trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH
của môi trường.Nếu trong môi trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có
màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng.
Trang
18


+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi
sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng.
+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến
dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton
chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của
bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ.Trong khi đó, phần môi trường sâu
trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.

Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ
các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch. Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả
năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate
có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng
tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thịammonium citrate hiện diện trong môi
trường.
•Thử nghiệm tính di động
Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế
bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium
chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất
này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.
• Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được
các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ
được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu.Phản ứng tạo

CO2 trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự
đổi màu của chỉ thị pH.

Trang
19


Thử nghiệm MR
Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong qusa trình taaoj và duy trì các
sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạp và duy trì sản phẩm
acid, làm đổi màu thuốc thử. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến thành các sản phẩm trung tính,
không làm đổi màu thuốc thử
-chất chỉ thị màu Ph môi trường là methyl red đỏ
-môi trường thử nghiệm: môi trương VP-MR
-Sau thử nghiệm: môi trường chuyển sang đỏ :+
Môi trường không đổi màu: Thử nghiệm catalase
Dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí. Vi sinh vật hiếu khí có enzyme
catalase, có khả năng phân giải H2O2 thành H2O và O 2
Hóa chất : H2 O2 30% được giữ lạnh
Nhỏ một giọt sinh khối lên H2O2: Nếu sủi bọt : +
Nếu không sủi bọt :-

(BỔ SUNG THỬ NGHIỆM VÀ HÌNH ẢNH)
Cách tiến hành

Bộ hóa chất bao gồm:
• Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase
- Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.

Trang

20


- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và
đặt lên lame.
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase.
- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiệnmàu tím đen; âm
tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen.
• Thử nghiệm trên ống nghiệm đã có chứa các môi tường thử nghiệm tương ứng
- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng đểlàm thành
huyền dịch có độ đục McFarland 2,0.
- Dung que cấy vòng lấy dịch từ ống pha nước muối sinh lý có chứa vi sinh vật cấy vào các ống
chưa các thử nghiệm tượng ứng.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
-Đọc kết quả theo bảng 2.1
Tương tự cho thử nghiệm sinh hóa đối với bộ API trên 10 giếng thử nghiệm
-cách dùng: dùng Micropipetcho vào mỗi giếng 200 µl huyền dịch, đậy nắp.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
-Đọc kết quả theo bảng 2.1
Bộ thử nghiệm API

Trang
21


Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả phản ứng sinh hóa
Thuốc
Giếng

Ký

Thử nghiệm

thử thêm

số

hiệu

sinh hóa

vào

1

GLU

Lên men

Kết quả thử nghiệm

(+)

(-)

Vàng

tím

Đỏ/hồn/xuất hiện vòng 3

Càng

thành nitite

phút

nhạt

Thủy giải

Vàng nhạt

glucose
2

3

NIT

ONPG

Khử nitrat

Tìm nitite

ONPG
4

URE

Đỏ cánh sen

Sinh urease

Càng/đỏ
nhạt

5

6

7

8

PAD

CIT

ESC

H2S

Phenyl alanine

FeCl3

Xánh lá (xuất hienj khi bỏ

Vàng

deaminase

thuốc thử)

nhạt

Sử dụng citrate

Xanh biển (có ánh xnah

Xanh lá/

biển)

vàng

Thủy giải

Đen( có màu từ đen nhạt

Không

Esculine

qua đen đậm)

đen

Sinh H2S

Đen (xuát hienj dưới đáy

Không

Trang
22


giếng, mất màu khi nhỏ

đen

kovac)
IND

Sinh indol

Kovac

Đỏ bề mặt (đọc sau 1 phút)

vàng bề
mặt

9

10

VP

MLO

Voges-

KOH+napthto

prokauer

l

Đỏ(xuất hiện 5 phút)

Vàng
nhạt

Sử dụng

Xanh biển

malonate

Xanh
lá/vàng

Đọc kết quả định danh
hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hình 2.1
3.Phương pháp cấy mẫu đàm (PHẦN NÀY CHƯA NẮM RÕ CẦN TÌM HIỂU KỸ)
Trước hết làm tan đàm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC

(SPUTAPREP-QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đàm. Tiến hành như sau:

- Trong một tube 15 ml vô trùng (loại Falcon) đã chứa 10 ml nước muối sinh lý vô trùng (NS),
cho thêm vào 50 mg NALC (N-Acetyl-L-Cystein), tức là toàn bộ bột NACL chứa trong một
tube Eppendorf. Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn. Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và
đủ cho 2 – 3 mẫu. Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 4 o C .
- Lấy một thể tích đàm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt. Thêm vào một thể
tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha. Lắc nhẹ cho đến khi đàm tan trong dung dịch
này. Như vậy chúng ta đã có đàm pha loãng 1/2 . Sau khi đàm tan hoàn toàn, pha loãng tiếp mẫu
đàm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng. Như vậy chúng ta đã có mẫu đàm pha
loãng 1/20.
- Tiến hành cấy định lượng mẫu đàm đã pha loãng 1/2 trên các hộp thạch máu cừu ( BA ), thạch
nâu máu ngựa có Bacitracin (CAHI) và thạch MC bằng khuyên cấy định lượng 10 µl (0,01 ml)

Trang
23


và 1 µl (0,001 ml) hay dùng micropipett để hút 10 µl và 1 µl cấy lên mặt thạch. Với mẫu đàm
pha loãng 1/20, dùng khuên cấy 1 µl hay dùng micropipet để hút 1 µl cấy lên mặt thạch và cũng
như trên 3 loại hộp thạch như trên. Phương pháp cấy định lượng trên mặt thạch được thực hiện
như cấy định lượng nước tiểu. Sau khi cấy, các hộp thạch BA và CAHI được ủ trong khí trường
CO2 còn các hộp thạch MC được ủ trong khí trường bình thường, nhiệt độ ủ là 35 – 37 o C, thời
gian ủ qua đêm hay tối đa 24 giờ. Đọc kết quả và định lượng các vi khuẩn mọc trên các hộp
thạch như trong bảng trình bày sau:

Bảng 1 : Cách đọc kết quả định lượng các loại vi khuẩn trong mẫu đàm dựa trên số lượng các
loại khóm vi khuẩn mọc trên các hộp thạch.
Hộp thạch

Mẫu đàm pha

Vòng cấy định

Thể tích đàm

Số vi khuẩn được

loãng

lượng

được cấy

định lượng

1

1/2

10 µl

5 µl

2N x 10 2 / ml

2

1/2

1 µl

0,5 µl

2N x 10 3/ ml

3

1/20

1 µl

0,05 µl

2N x 10 4/ ml

Trang
24


Sơ đồ cấy định lượng mẫu đàm trên các hộp thạch

N là số khóm của một loại vi khuẩn đếm được trên các hộp thạch. Để có con số định
lượng của một loại vi khuẩn thì chúng ta nên lấy số trung bình của các kết quả. Ví dụ: ứng với
các khóm nghi ngờ K. pneumoniae, kết quả trên hộp thạch MC1 là 200 khóm, lượng vi khuẩn K.
pneumoniae trong 1 ml đàm là 40000 CFU/ml (2 x200 x 10 2); trên hộp thạch MC2 là 15, lượng
vi khuẩn / ml đàm là 30000 CFU/ml (2 x 15 x 103); và trên hộp thạch MC3 là 3, lượng vi khuẩn
là 60000 CFU/ml (2 x 3 x10 4). Như vậy kết quả cuối cùng lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong
mẫu đàm sẽ được tính là (40000 + 30000 + 60000)/3 = 43333 CFU/ml. Nếu các hộp thạch 1 và 2
có vi khuẩn quá nhiều (> 200 khóm 2), chúng ta chỉ nên đếm số khóm trên hộp thạch 3.

Bàn luận và kết quả
- Các vi khuẩn có lượng ≥ 1000 CFU/ml thì phải định danh và làm kháng sinh đồ. Có nghĩa là
tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ bất cứ khóm vi khuẩn nào mọc được trên hộp thạch 2
và 3 hay có số lượng ≥ 5 trên hộp thạch 1. Trả lời lâm sàng cả kết quả định lượng là bao nhiêu vi
khuẩn đã định danh và làm kháng sinh đồ để lâm sàng có thể tùy nghi sử dụng.(theo TS.Phạm
Hùng Vân)
-Tuy vậy, tùy từng Labo xét nghiệm chọn các vi khuẩn có lượng từ 103 – 107 CFU/ml để tiến
hành làm kháng sinh đồ.

2.3.4. Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY
2.3.5. Chuẩn bị môi trường.
Môi trường được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất: bằng cách cân chính
xác lượng thạch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nuớc cất trung tính, kiểm tra pH trước
khi hấp tiệt khuẩn. Trong khi hấp, tránh để môi trường ở nhiệt độ cao và thời gian dài hơn sự cần
thiết, vì điều đó sẽ làm giảm khả năng đệm và thay đổi pH của môi trường. Sau khi để nguội môi
Trang
25