Luận văn Hoàn thiện quy trình nuôi cấy invitro và nghiên cứu ảnh hưởng đèn led đến sự sinh trưởng của cây lan kim tuyến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRẦN THỊ HỒNG THÚY

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO
VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐÈN LED ĐẾN SỰ
SINH TRƯỞNG CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM BÍCH NGỌC

HÀ NỘI, 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn trân thành đến cô –
TS. Phạm Bích Ngọc. Cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô đã luôn tạo điều kiện cho tôi được
học tập và nghiên cứu. Tôi thật sự rất biết ơn cô đã truyền cho tôi những định
hướng khoa học cùng lòng say mê nghiên cứu khoa học, luôn động viên,
khích lệ tôi, giúp tôi biết cách vượt qua những khó khăn của công tác nghiên
cứu, biết được niềm vui và hạnh phúc khi nghiên cứu thành công.
Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học Trường Đại
học Sư phạm Hà nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại
Trường. Cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh - Trường Đại học Sư phạm Hà
nội 2 đã tận tình dạy dỗ chúng tôi, nhờ vậy chúng tôi mới có được những tri

thức quí giá như ngày hôm nay.
Xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Thầy
Chu Hoàng Hà và Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công
nghệ - Trường Đại học Sư phạm Hà nội 2 đã tạo điều kiện cho tôi tiến hành
thí nghiệm và làm luận văn tại đây.
Cảm ơn anh chị em phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ
sinh học, Cảm ơn các bạn La Việt Hồng, Đỗ thị gấm, Nguyễn Khắc Hưng,
Nguyễn Đình Trọng, Hồ Hoài Thương. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Cảm ơn Ban giám hiệu Trường THPT Xuân Hòa cùng các đồng nghiệp
đã tạo điều kiện cho tôi tiếp tục học nâng cao kiến thức.
Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và lớp Sinh học
thực nghiệm K16 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt chặng đường vừa


qua. Được học tập và làm việc cùng các bạn là niềm hạnh phúc và may mắn
của tôi.
Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình cùng
những người bạn thân của tôi. Gia đình đã tiếp cho tôi nghị lực, cho tôi sự
bình yên trong tâm hồn, luôn bên tôi những lúc khó khăn. Những người bạn
thân luôn bên tôi, ủng hộ, khích lệ và động viên. Tình cảm của các bạn luôn
làm tôi cảm động và trân trọng.
Xuân Hòa, ngày 11 tháng 12 năm 2014
Tác giả

Trần Thị Hồng Thúy


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro và

nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kim
tuyến” là công trình nghiên cứu của tôi. Những số liệu và kết quả nghiên cứu
trong luận văn này là trung thực chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức
nào và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi
sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin
trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc.
Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này.
Tác giả

Trần Thị Hồng Thúy


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ..........................................................................................................
Lời cam đoan .......................................................................................................
Mục lục ................................................................................................................
Danh mục chữ viết tắt .........................................................................................
Danh mục bảng....................................................................................................
Danh mục biểu đồ và sơ đồ ................................................................................
Danh mục hình ảnh ............................................................................................
MỞ ĐẦU
1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI .................................................................................. 1
2. MỤC ĐÍCH VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU ............................................. 3
2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 3
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 4
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................... 4
3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ....................................................................... 4
3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài........................................................................ 5
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .............................................. 5
4.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 5

4.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 5
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN KIM TUYẾN ........................................... 6
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây lan kim tuyến .............................................. 6
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và nhu cầu ánh sáng của cây lan kim tuyến......... 6
1.1.1.2. Phân bố ............................................................................................... 7
1.1.2. Vai trò của cây lan kim tuyến trong y học ............................................. 8


1.1.3. Những nghiên cứu về nhân giống lan kim tuyến bằng kĩ thuật in
vitro .................................................................................................................. 8
1.2. TỔNG QUAN VỀ ÁNH SÁNG ĐỐI VỚI THỰC VẬT ........................ 11
1.2.1. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật .............. 11
1.2.2. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật ..................................................................................................... 12
1.2.2.1. Cường độ ánh sáng ........................................................................... 13
1.2.2.2. Quang phổ ánh sáng ......................................................................... 13
1.2.2.3. Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực
vật…………………………………………………………………… …………15
1.2.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro thực vật ...................... 16
1.2.4. Đèn LED ............................................................................................... 19
1.2.4.1. Giới thiệu đèn LED ............................................................................ 19
1.2.4.2. Ưu, nhược điểm của đèn LED ............................................................ 19
1.2.4.3. Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng
LED trong nuôi cấy in vitro…………………………………………

…21

1.2.4.4. Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở

Việt Nam……………………………………………………………………

…..24

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI .............................. 26
2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài ...................................................................... 26
2.1.2. Thời gian tiến hành đề tài...................................................................... 26
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ..................................................................... 26
2.2.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 26
2.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy ........................................................ 26
2.2.2.1. Môi trường nuôi cấy cơ bản............................................................... 26
2.2.2.2. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................. 27


2.2.2.3. Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27
2.2.3. Hệ thống ánh sáng ................................................................................. 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 28
2.3.1. Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống loài lan kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) thông qua cảm ứng tạo protocorm like bodies (PLBs)........ 28
2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh
trưởng đến sự hình thành protocom like bodies (PLBs) ................................ 28
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi
từ cụm PLBs ................................................................................................... 30
2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp cho sự
sinh trưởng và tạo rễ của chồi nuôi cấy từ PLBs .......................................... 31
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy lan kim
tuyến in vitro ........................................................................................ 32
2.3.2.1. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến giai
đoạn nhân đa chồi lan kim tuyến .................................................................... 32

2.3.2.2. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến giai
đoạn sinh trưởng và tạo rễ của chồi lan kim tuyến in vitro dưới đèn
LED ................................................................................................................ 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG LOÀI LAN KIM
TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THÔNG QUA CẢM ỨNG
TẠO PROTOCORM LIKE BODIES (PLBs) ............................................... 35
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự
hình thành protocom like bodies .................................................................... 35
3.1.2. Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi từ cụm PLBs ........ 42
3.1.3. Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng và
tạo rễ của chồi lan kim tuyến nuôi cấy từ PLBs ............................................. 45


3.2. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG LED ĐẾN NUÔI CẤY
LAN KIM TUYẾN IN VITRO ................................................................................... 52
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến giai đoạn nhân đa
chồi của cây lan kim tuyến .............................................................................. 53
3.2.1.1. Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng khác nhau đến tỉ lệ hình
thành chồi và hình thái chồi của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro ............ 53
3.2.1.2. Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng đến hệ số nhân của cây
lan kim tuyến nuôi cấy in vitro sau 8 tuần nuôi cấy ...................................... 53
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến giai đoạn sinh trưởng
và tạo rễ của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro ........................................... 55
3.2.2.1. Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng khác nhau đến tỉ lệ hình
thành rễ, số lượng rễ/cây và chiều dài rễ trung bình của cây lan kim
tuyến nuôi cấy in vitro ..................................................................................... 55
3.2.2.2. Đánh giá quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan kim
tuyến nuôi cấy in vitro thông qua một số chỉ tiêu về hình thái và hóa sinh ... 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN ................................................................................................. 63
2. KIẾN NGHỊ VỀ CÁC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
PHỤ LỤC


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Nội dung chữ viết tắt

1

AS

Ánh sáng

2

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

3

BAP

6 - Benzyl Amino Purin

4

ĐC

Đối chứng

5

GA3

Axit gibberellic

6

HLDL

Hàm lượng diệp lục

7

KH&CN

Khoa học và công nghệ

8

LED

Đi–ốt phát quang (Light-Emitting Diode)

9

MS

Môi trường nuôi cấy Murashige và Skoog (1962)

10

NAA

Axit α-naphtaleneacetic

11

PLBs

Protocorm like bodies

12

TB

Trung bình

13

STT

Số thứ tự

14

IR

cường độ ánh sáng đỏ

15

IFR

cường độ ánh sáng đỏ xa


DANH MỤC HÌNH ẢNH
STT Tên hình ảnh
1

Hình 1.1

Nội dung hình ảnh

Trang

Hình thái cây và hoa lan kim tuyến
(Anoectochilus setaceus) [6].

7
7

2

Hình 1.2.

Phân bố lan kim tuyến ở Việt Nam [2].

3

Hình 1.3

Các bước sóng ánh sáng và sự hấp thu các
bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và

4

Hình 3.1

cường độ quang hợp của Anacharis sp [11].

11

Hình ảnh các PLBs lan kim tuyến trong các

39

môi trường cảm ứng khác nhau.
5

Hình 3.2

Một số dạng protocorm like bodies ở lan kim
tuyến.

6

Hình 3.3

Hình ảnh sinh trưởng của PLBs trong môi
trường Pr4.

7

Hình 3.4
Hình 3.5

41

PLBs lan kim tuyến trong môi trường tạo chồi
(K2).

8

39

44

Chồi chuyển từ K2 sang môi trường sinh
trưởng chồi và tạo rễ K1, S2 (sau 30 ngày nuôi
cấy).

48

9

Hình 3.6

Sinh trưởng của chồi ở nghiệm thức K2-K1.

49

10

Hình 3.7

Lan kim tuyến sinh trưởng trong vườn ươm.

51

11

Hình 3.8

Quy trình nhân giống lan kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume) thông qua
cảm ứng tạo PLBs.

12

Hình 3.9

Cây lan kim tuyến nhân đa chồi dưới ánh sáng
LED.

13

Hình 3.10

51

55

Cây giống lan kim tuyến nuôi cấy dưới đèn
huỳnh quang và đèn LED.

61


DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng
1

Bảng 1.1.

Nội dung bảng

Trang

Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác
nhau lên thực vật

14

2

Bảng 2.1

Môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo PLBs

29

3

Bảng 2.2

Môi trường nuôi cấy tạo chồi từ cụm PLBs

30

4

Bảng 2.3

Môi trường sinh trưởng chồi và tạo rễ chồi lan
kim tuyến

31
33

5

Bảng 2.4

Bố trí các nguồn ánh sáng trong thí nghiệm 4

6

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
đến sự hình thành protocom like bodies

7

Bảng 3.2

Quá trình sinh trưởng của PLBs trong môi
trường Pr4

40
43

8

Bảng 3.3.

Tạo chồi từ PLBs (sau 30 ngày nuôi cấy)

9

Bảng 3.4

Khả năng tạo cây hoàn chỉnh và hiệu suất
nhân cây của toàn quy trình nuôi cấy.

10

Bảng 3.5

35

46

Tác động của các điều kiện chiếu sáng đến tỉ
lệ hình thành chồi và hình thái chồi lan kim
tuyến

11

Bảng 3.6

Tác động của các điều kiện chiếu sáng đến hệ
số nhân chồi lan kim tuyến

12

Bảng 3.7

Bảng 3.8

54

Tác động của các điều kiện chiếu sáng đến tỉ
lệ hình thành rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ

13

53

56

Một số chỉ tiêu về hình thái và hóa sinh của
cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro

57


DANH MỤC BIÊU ĐỒ

STT

Tên biểu đồ

Nội dung biểu đồ

1

Biểu đồ 3.1

Cảm ứng tạo PLBs

2

Biểu đồ 3.2

Qúa trình sinh trưởng của PLBs trong môi
trường Pr4

3

Biểu đồ 3.3
Biều đồ 3.4

38

40

Sinh trưởng và tạo rễ của chồi lan kim
tuyến

4

Trang

46

Ảnh hưởng của ánh sáng LED đến một số
chỉ tiêu quan trọng về hình thái và hóa sinh
của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro

60


1

MỞ ĐẦU
1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ phong lan
(Orchidaceae), Chi Anoectochilus, loài Anoectochilus setaceus. Hiện tại, ở
nước ta đã thống kê được 12 loài lan kim tuyến, trong đó lan kim tuyến
Anoectochilus setaceus Blume (tên đồng nghĩa là Anoectochilus roxburghii
Wall. Ex Lindl [1]) là loài thường gặp nhất và có giá trị thương mại cao nhất.
Lan kim tuyến được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà
bởi giá trị làm thuốc của nó. Lan kim tuyến là nguồn dược thảo quý, được thu
mua chủ yếu để xuất khẩu sang Trung Quốc với giá rất cao. Ở Việt Nam lan
kim tuyến phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể không nhiều, tái sinh chậm
và đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo. Hiện nay, nguồn nguyên liệu từ một số
cây thuốc mang các hoạt tính dược liệu quý, đặc hữu như lan kim tuyến ngoài
tự nhiên đang không đủ đáp ứng nhu cầu điều trị ngày càng tăng và việc khai
thác quá mức (với hình thức khai thác nhổ cả cây) dẫn đến nguy cơ tuyệt
chủng loại dược liệu quý hiếm này nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn.
Lan kim tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP,
nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại [3] và nhóm thực vật rừng
đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam [2].
Hiện nay, các loài lan kim tuyến không chỉ được nghiên cứu về hoạt
tính sinh học mà còn về các phương pháp nuôi cấy in vitro. Đã có nhiều công
trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây lan kim tuyến với mong muốn tạo ra
số lượng lớn cây lan kim tuyến để đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của thị
trường. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như: Chow và cộng
sự (1982), đã nhân giống in vitro thành công loài lan kim tuyến

Anoectochilus formosannus từ hạt [22]. Ket NV và cộng sự (2004) đưa ra
quy trình nhân nhanh lan kim tuyến loài Anoectochilus formosanus bằng


2

phương pháp tạo đa chồi với nguồn mẫu ban đầu là chồi đỉnh [34]. Phùng Văn
Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu thành công kĩ thuật nhân nhanh chồi in
vitro loài lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl, với nguyên liệu
là thể chồi [14].
Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Niệm (2012), đã thiết lập quy trình
nhân nhanh in vitro hoàn chỉnh loài lan kim tuyến Anoectochilus setaceus với
nguyên liệu là chồi và mắt đốt ngang thân [16]. Trương Thị Bích Phượng,
Phan Ngọc Khoa (2013) cũng đã nhân lan kim tuyến qua nuôi cấy cụm
protocorm (2,0 × 2,0 mm) được hình thành từ hạt [15]. Trước nhu cầu rất lớn
về lan kim tuyến dùng để làm thuốc, thực phẩm chức năng của các công ty
dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng nghiên
cứu nhân nhanh giống lan kim tuyến in vitro. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam
chưa có công bố khoa học nào về nhân giống cây lan kim tuyến in vitro thông
qua cảm ứng tạo protocorm like bodies nhằm tăng hệ số nhân chồi cũng như
hiệu suất nhân cây.
Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng,
cường độ và thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát
triển của thực vật. Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình
chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất
của cây. Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến trong nhân giống in vitro hiện
nay là đèn huỳnh quang. Mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự
tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại phải
tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này
gây ra. Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65%

dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát phòng
nuôi. Do đó, sự phát triển nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các


3

phòng nuôi cấy mô sẽ mang lại nguồn lợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất
trong vi nhân giống [35].
Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu
tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình
phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật mà chưa đi sâu
tìm hiểu vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro, đặc biệt là nguồn
chiếu sáng từ đèn LED (Light - Emitting Diode). Hiện nay, đèn LED là thiết
bị chiếu sáng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao khả năng
tăng trưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn và tuổi thọ
cao [20]. LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn sáng khác như: đèn
huỳnh quang, đèn sợi đốt, đèn natri cao áp. Bước sóng của nó phát ra rất đặc
biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử
dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng
hợp chlorophyll [44], quang hợp [43] và phát sinh hình thái [27].
Hiện nay chưa có công bố khoa học nào về nghiên cứu ảnh hưởng của
ánh sáng LED đến nhân giống in vitro lan kim tuyến ở Việt Nam. Viện Công
nghệ sinh học đang thực hiện chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước
“Nghiên cứu phát triển công nghệ chiếu sáng LED phục vụ nông nghiệp Tây
Nguyên” (mã số: TN3/C09 KH&CN) trong đó có nội dung “Nghiên cứu ảnh
hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro”.
Căn cứ vào những phân tích đã nêu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Hoàn
thiện quy trình nuôi cấy in vitro và nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến
sự sinh trưởng của cây lan kim tuyến”.
2. MỤC ĐÍCH VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

2.1. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro cây lan kim tuyến
thông qua cảm ứng tạo protocorm like bodies. Nhằm rút ngắn thời gian thu


4

các đợt cây giống, số lượng cây giống, giúp hạ giá thành cây giống, góp phần
bảo tồn nguồn gen lan kim tuyến. Cung cấp cây giống với số lượng không
giới hạn cho các nhà vườn trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức
năng.
Bước đầu nghiên cứu sử dụng đèn LED trong nuôi cấy in vitro lan kim
tuyến.
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống in vitro cây lan kim tuyến (thông
qua cảm ứng tạo protocorm like bodies)
Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình
thành protocom like bodies (PLBs).
Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi từ cụm PLBs.
Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo rễ
của chồi nuôi cấy từ cụm PLBs.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình phát sinh đa
chồi của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro
Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình nhân đa chồi của
cây lan kim tuyến: Tỉ lệ hình thành chồi và hệ số nhân chồi.
Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình tạo rễ và sinh
trưởng của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro: Sự tạo rễ và một số chỉ tiêu
hình thái và sinh lí của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro (chiều cao cây,
đường kính thân, số lá trên cây, diện tích lá trung bình, hàm lượng diệp lục).
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây lan kim tuyến sẽ cung cấp
những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống in vitro cây trồng nói chung


5

và cây lan kim tuyến nói riêng. Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn
gen lan kim tuyến là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay.
Nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kim
tuyến cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi
cấy in vitro lan kim tuyến. Góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp
theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy lan kim tuyến in vitro.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Xây dựng quy trình nhân nhanh lan kim tuyến thông qua cảm ứng tạo
PLBs nhằm nhân giống lan kim tuyến với số lượng lớn, hạ giá thành cây
giống, góp phần bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý.
Nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kim
tuyến là cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in
vitro cây trồng nói chung và lan kim tuyến nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh
sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong
nuôi cấy lan kim tuyến hiện nay, là cơ sở giúp hạ giá thành sản phẩm là cây
lan kim tuyến giống. Hoặc định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng
dụng của đèn LED đến cây lan kim tuyến.
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây lan kim tuyến in vitro do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài thực hiện nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan kim tuyến

và khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy in vitro lan kim
tuyến trong phạm vi phòng thí nghiệm tại Viện Công nghệ sinh học.


6

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN KIM TUYẾN
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây lan kim tuyến
Giới

: Thực vật (Plantae)

Nghành : Thực vật có hoa (Angiosperms )
Lớp

: Thực vật một lá mầm (Monocots)

Bộ

: Bộ măng tây (Asparagales)

Họ

: Phong lan (Orchidaceae)

Chi

: Anoectochilus

Loài

: Anoectochilus setaceus
BLUME, 1825 [53].

Danh pháp đồng nghĩa: Chrysobaphus roxburghii Wall. 1826;
Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall.ex Lindl 1840 [2].
Lan kim tuyến còn có các tên gọi khác là: Giải thùy tơ, Giải thùy
roxburgh, Kim tuyến đỏ, Sữa hồng [2].
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và nhu cầu ánh sáng của cây lan kim tuyến
Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) là cây thảo, mọc ở đất,
có thân rễ mọc dài. Thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 24 lá xòe sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn,
cỡ 3-4 × 2-3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục
sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu-đỏ với mạng gân màu vàng-lục
hay hồng); cuống lá dài 2-3 cm. Cụm hoa dài 10-15 cm, mang 4-10 hoa mọc
thưa. Lá bắc hình trứng, chóp thót nhọn đột ngột, dài 8-10 mm, màu hồng.
Hoa thường màu trắng, dài 2,5-3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm, môi


7

dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu,
hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [2].

Hình 1.1. Hình thái cây và hoa lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus)
[6]
Đặc điểm sinh học: Mùa hoa tháng 2-4, tái sinh bằng chồi từ thân rễ và
hạt [2].
Nhu cầu ánh sáng của cây lan kim tuyến: Lan kim tuyến sinh sống

trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm
ở độ cao 500-1.600 mét. Cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kị ánh sáng trực
tiếp [53].
1.1.1.2. Phân bố
Ở Việt Nam lan kim tuyến phân bố
rộng: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản
Bạ), Yên Bái, Vĩnh phúc (Tam Đảo), Hà
Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị
(Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy),
Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) [6].
Trên thế giới lan kim tuyến phân bố ở:
Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông),
Ấn Độ, Lào, Inđônêxia, Nêpan, Butan,

Hình 1.2. Phân bố lan kim
tuyến ở Việt Nam [2]


8

Mianma, Thái lan, Campuchia, Malaysia [6].
1.1.2. Vai trò của cây lan kim tuyến trong y học
Theo Đông y, lan kim tuyến vị ngọt, tính mát, tác dụng bổ âm nhuận
phế, tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, làm mát phổi, mát máu,
an thần. Cây thuốc có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm phế quản, viêm
gan mãn tính, chữa các chứng bệnh như ho khạc ra máu, thần kinh suy nhược,
gây mất ngủ, kém ăn, trị lao phổi, tiêu hóa kém, chán ăn, phổi kết hạch. Ngoài
ra, còn chữa tăng huyết áp, suy thận, di tinh, đau lưng, phong thấp, tiêu đờm,
giải độc, giải nhiệt [51].
Trong y học hiện đại, lan kim tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao

phổi, ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ
dày mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh; giúp
tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [6].
Trong nghiên cứu của He và Wang (2005) đã tìm thấy ở loài lan kim
tuyến (Anoectochilus roxburghii) các hoạt chất như hợp chất béo, các
flavanoit, glucoside và các steroid [26]. Huang và cộng sự (2007) đã thành
công trong việc phát hiện và định lượng hai hoạt chất quan trọng trong lan
kim tuyến là oleanolic acid và ursolic acid [29]. Năm 2008, Cai và Gong đã
nghiên cứu thành phần hóa học của lan kim tuyến và tìm thấy 10 hoạt chất
như beta-D-glucopyranosyl-(3R)-hydroxybutanilide, stearic acid, palmitic
acid, beta-sitosterol, succinic acid, p-hydroxy benzaldehyde, daucosterol,
methyl 4-beta-D-glucopyranosyl-hutanoate; p-hydroxy cinnamic acid và ohydroxy phenol [21].
1.1.3. Những nghiên cứu về nhân giống lan kim tuyến bằng kĩ thuật in vitro
Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi
nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các
kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác


9

nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong
các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.
Thuật ngữ protocorm dùng để mô tả những cấu trúc hình cầu nhỏ của
lan hình thành từ hạt. Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ mẫu cấy in
vitro không được gọi là protocorm.
Protocorm like bodies (PLBs) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu
trúc tương tự protocorm được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro.
Protocorm like bodies (PLBs) đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân
giống in vitro ở các loài lan nói chung. Theo các nghiên cứu trước đây cho
thấy bản chất của PLBs là các thể phôi soma [48].

Cây giống lan kim tuyến nuôi cấy in vitro có những ưu điểm sau:
- Cây giống có phẩm chất di truyền tốt, sinh trưởng nhanh, các hoạt
chất dược tính có hàm lượng cao, do cây giống được tạo ra bằng kĩ thuật nuôi
cấy mô tế bào nên vẫn giữ nguyên được phẩm chất di truyền giống cây mẹ.
- Cây giống có hình thái đồng đều, sạch bệnh, khả năng tái sinh tốt.
- Cây giống có thể được sản xuất ở quy mô lớn, không phụ thuộc vào
mùa vụ, thời tiết.
- Vận chuyển cây giống rất thuận lợi.
Như vậy, việc ứng dụng nghiên cứu khoa học vào nhân giống in vitro,
trồng và bảo tồn lan kim tuyến cần triển khai, phát triển, tạo nguồn nguyên
liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc và tạo thêm việc làm cho người dân.
Trên thế giới đã có các công trình nghiên cứu xây dựng quy trình nhân
nhanh in vitro các loài lan kim tuyến từ hạt hoặc chồi đỉnh lan kim tuyến.
Chow và cộng sự (1982), đã nghiên cứu thành công nhân giống loài lan kim
tuyến Anoectochilus từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2 MS +
0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân
nhanh chồi là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/L


10

BAP + 0,5 mg/L NAA [22].
Huang và Liu (2002) đã thành công trong việc tìm ra môi trường cảm
ứng sản sinh mầm rễ (protocorm) từ hạt của loài lan kim tuyến là môi trường
Knudson C bổ sung 0,5 mg/L 6-BA và 20% dịch chiết khoai tây [28].
Ket và cộng sự (2004) đưa ra quy trình nhân nhanh lan kim tuyến loài
Anoectochilus formosanus bằng phương pháp tạo đa chồi với nguồn mẫu ban
đầu là chồi đỉnh, hệ số nhân chồi đạt 11,1 chồi/mẫu và 100% mẫu chồi ra rễ
trên môi trường có bổ sung 0,5 g/L than hoạt tính [34].
Nguyễn Văn Kiệt (2004) cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro

thành công cho loài lan kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban
đầu là chồi đỉnh tại đại học Hungbuk, Hàn Quốc [45].
Ở Việt Nam nhân giống in vitro lan kim tuyến đã được các Viện nghiên
cứu và Trung tâm nhân giống cây trồng quan tâm thực hiện. Nguyễn Quang
Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu kĩ thuật nhân
giống loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn
dược liệu quý” với hệ số nhân chồi đạt 6,55 chồi/mẫu (từ đoạn thân 1-2 cm) [16]
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu thành công kĩ thuật
nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.)
Lindl. Với nguyên liệu là thể chồi cao 2-3 cm, hệ số nhân chồi 5,33 lần [14].
Viện Công nghệ sinh học (2012) đã thực hiện dự án “Nghiên cứu hoàn
thiện quy trình kỹ thuật sau nuôi cấy in vitro và trồng bảo tồn nguồn gen tại
trại thực nghiệm Tam Đảo với hệ số nhân chồi (từ đoạn thân 1,0-2,0 cm) là
5,3 chồi/mẫu [6].
Trương Thị Bích Phượng và Phan Ngọc Khoa (2013) đã thực hiện thí
nghiệm nhân giống in vitro cây lan kim tuyến từ đốt thân với hệ số nhân chồi
4,6 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi cấy, nhân từ cụm protocorm (nuôi cấy từ hạt)
đạt 5,62 chồi/cụm [15].


11

1.2. TỔNG QUAN VỀ ÁNH SÁNG ĐỐI VỚI THỰC VẬT
1.2.1. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật
Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời bởi ánh sáng là
điều kiện cho quá trình quang hợp xảy ra. Mọi sự sống trên trái đất không thể
tách rời quá trình này.
Ngày nay, chúng ta biết đến quang hợp là quá trình giúp thực vật dùng
năng lượng ánh sáng để tạo glucose và phóng thích oxy từ carbonic và nước.
Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp

thuộc vùng quang phổ có bước sóng từ 400 đến 700 nm với cực đại hấp thụ từ
660 đến 680 nm. Đơn vị đo cường độ ánh sáng trong các nghiên cứu về thực
vật hiện nay là dòng photon quang hợp (photosynthetic photon flux – PPF),
tính bằng μmol.m-2.s-1, nghĩa là số lượng photon tham gia vào quá trình quang
hợp của thực vật tính trong 1 giây trên một đơn vị diện tích 1m2.
Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ là một phần
nhỏ của toàn bộ quang phổ điện từ. Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh
điều khiển quá trình quang hợp hiệu quả nhất. Khả năng kích thích các
electron của ánh sáng liên quan đến bước sóng hơn là cường độ của chùm
sáng. Chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thực vật thực sự hấp thu.

Hình 1.3. Các bước sóng ánh sáng và sự hấp thu các bước sóng bởi các
loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp của Anacharis sp [11]


12

1.2.2. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật
Năng lượng bức xạ được thực vật sử dụng theo hai cách hoàn toàn
riêng biệt: như một nguồn năng lượng và như một nguồn thông tin. Ánh sáng
đặc biệt phù hợp với vai trò thứ hai. Ánh sáng có thể truyền thông tin qua
nhiều dạng khác nhau; trong đó, có tối thiểu 4 dạng đặc trưng: chất lượng,
lượng, hướng và quang kỳ.
Chất lượng: Dạng năng lượng bức xạ, màu, quang phổ, thành phần
bước sóng là tất cả những từ dùng diễn tả đặc trưng này của ánh sáng.
Lượng: Số lượng năng lượng bức xạ, cường độ, số photon, tốc độ dòng
xác định rõ đặc trưng thứ hai này.
Hướng: Có sự đa dạng rất lớn giữa các môi trường sống khác nhau theo
hướng chiếu sáng.

Quang kỳ: Mô tả sự khác nhau đều đặn do chu kì ngày đêm và sự thay
đổi độ dài ngày theo mùa.
Nhiều đặc tính về phát triển hình thái của thực vật ex vitro bị ảnh
hưởng bởi các điều kiện môi trường như ánh sáng (về chất lượng, cường độ,
thời gian và hướng chiếu sáng), nhiệt độ, thành phần khí (CO2, O2, H2O,
C2H4), thành phần môi trường [32].
Năng lượng bức xạ có những ảnh hưởng quan trọng lên hình thái và
hoạt động của thực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham gia
vào nhịp nội sinh và định hướng về không gian và thời gian.
Quang phát sinh hình thái là quá trình kiểm soát sự sinh trưởng, phát
triển và phát sinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng. Quá trình này được
điều khiển bởi ít nhất bốn con đường khác nhau của các quang thụ thể.
Trong điều kiện tối, cây phát triển theo một chương trình gọi là
“kotomorphogensis”, chẳng hạn như kéo dài chồi, có rất ít hay không có lá


13

mầm và lá thật, bị vàng hóa.
Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân,
vv.) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400-500 nm (xanh lục), 600-700 nm
(đỏ) và 700-800 nm (đỏ xa).
Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thực
vật thông qua các quang thụ thể. Thực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụ
thể (photoreceptor) có độ hấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khác
nhau, điều hòa sự phát sinh hình thái, đó là:
- Phytochrome (650 - 680 nm; ánh sáng đỏ/đỏ xa).
- Các thụ thể nhận ánh sáng xanh gồm cryptochrome (340-520 nm; ánh
sáng xanh UV-A), phototropin.
- Thụ thể hấp thu tia cực tím UV – B (290-350 nm) và UV-A.

Sự chiếu sáng có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của tế bào, mô thực vật
và sự sinh tổng hợp chất biến dưỡng sơ cấp và thứ cấp. Chúng tăng theo
cường độ chiếu sáng và hiện tượng bão hòa ánh sáng xuất hiện sau khi cường
độ chiếu sáng đạt đến điểm bão hòa ánh sáng, khác nhau từ loài này đến loài
khác [49].
1.2.2.1. Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng từ 1000-2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy
nhiều loại mô. Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm
lại. Theo Ammirato (1987), ánh sáng tham gia vào sự phát sinh và phát triển
của phôi soma [18]. Ánh sáng ở cường độ cao gây nên sự sinh trưởng của mô
sẹo, ở cường độ trung bình kích thích tạo chồi; ngoài ra, ở cường độ thấp sẽ
tăng chiều cao và lá có màu xanh đậm.
1.2.2.2. Quang phổ ánh sáng
Vấn đề quang phổ ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu như
Pierik (1987). Ảnh hưởng của ánh sáng ở các bước sóng khác nhau được trình
bày tóm tắt trong bảng 1.2 [40].