Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua cơ chế KPC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN NHẬT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
ĐỀ KHÁNG CARBAPENEM QUA CƠ CHẾ KPC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2016


Công trình được hoàn thành tại: ............................................
................................................................................................

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. TRẦN LINH THƯỚC
TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

Phản biện 1: TS. Ngô Thị Hoa
Phản biện 2: TS. Nguyễn Đỗ Phúc
Phản biện 3: TS. Nguyễn Thị Bạch Huệ
Phản biện độc lập 1: TS. Ngô Thị Hoa
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Đỗ Phúc

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
................................................................................................
................................................................................................
vào lúc
giờ

ngày
tháng
năm
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên


Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không di
động, có nang polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được các tác nhân
gây hại cho tế bào. Vi khuẩn này có thể gây bệnh viêm phổi, áp xe phổi,
viêm màng phổi và những nhiễm khuẩn khác như viêm ruột, viêm màng não,
nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu. K. pneumoniae với khả
năng sinh enzyme -lactamase phổ rộng (ESBL) thường kháng đa kháng
sinh, và gen mã hóa cho sự đề kháng thường hiện diện trên plasmid.
K. pneumoniae đề kháng carbapenem hiện nay là một vấn đề thách
thức trong các đơn vị điều trị lâm sàng. Cơ chế đề kháng phổ biến nhất ở vi
khuẩn này là sinh enzyme carbapenemase được gọi là Klebsiella
pneumoniae Carbapenemase (KPC). Gen mã hóa KPC, một gen có khả năng
lan truyền rộng rãi tính kháng thuốc cho các vi khuẩn gây bệnh cùng hay
khác loài, hiện diện trên nhân tố di truyền di động là transposon Tn4401, một
cấu trúc có khả năng chuyển vị các bản sao với tần suất cao (4,4 x 10-6) các
trình tự gen mã hóa enzym này. Transposon Tn4401 được chứng minh có
khả năng chèn vào nhiều trình tự khác nhau, trên các plasmid có kích thước
khác nhau và trên những nhóm incompatible khác nhau nên ngoài tính
kháng mạnh, gen này đã được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới và gây
nên nhiều vụ dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao do các liệu pháp điều trị còn rất
hạn chế. Nói khác đi, một khi K. pneumoniae kháng carbapenem, chúng có
thể sẽ trở thành những vi khuẩn “bất trị”.
Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có sự gia tăng sự

đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae thông qua đánh giá mức độ kháng
thuốc dựa trên kết quả xác định MIC hay theo các phương pháp kháng sinh
đồ mà chưa nêu bật được các đặc điểm sinh học phân tử của sự đề kháng và
sự lan truyền tính kháng ở vi khuẩn này. Đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh
học phân tử của Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua cơ chế

1


KPC” được tiến hành trên các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem
với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Sàng lọc và thu nhận các chủng vi khuẩn K. pneumoniae đề kháng
carbapenem.
2. Xác định kiểu gen quy định kiểu hình kháng carbapenem và ESBL.
3. Khảo sát đặt tính sinh học phân tử của gen mã hóa KPC.
4. Tạo kháng thể xác nhận sự hiện diện của protein KPC. .
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Phát hiện vi khuẩn K. pneumoniae đề kháng carbapenem thông qua gen
mã hóa KPC-2 tại Việt Nam.
2. Chứng minh sự lan truyền gen mã hóa enzyme đề kháng carbapenem sang
E. coli trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3. Phân lập và tạo dòng gen mã hóa KPC-2 ở K. pneumoniae đề kháng
carbapenem và chứng minh hoạt tính kháng carbapenem của gen này.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 117 trang. Mở đầu 3 trang, Kết luận - Đề nghị 1 trang,
Những đóng góp mới của luận án, 1 trang. Luận án có 4 chương: Tổng quan
37 trang, Vật liệu - Phương pháp 20 trang, Kết quả 23 trang, Bàn luận 11
trang. Luận án có 25 bảng, 37 hình, 7 phụ lục và 133 tài liệu tham khảo với
22 tài liệu tiếng Việt, 109 tài liệu tiếng Anh và 2 tài liệu là website.
TỔNG QUAN

1.1. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
K. pneumoniae, thuộc họ vi khuẩn đường ruột – Enterobacteriaceae, là
tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng đồng. Yếu tố nguy cơ lây
nhiễm các chủng này ở bệnh nhân là thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn
dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những
thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản… Nhiễm khuẩn

2


bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ yếu do gia tăng việc sử dụng kháng
sinh làm gia tăng những chủng kháng thuốc.
1.1.1. Đặc điểm phân loại
Đặc điểm phân loại của K. pneumoniae (theo NCBI): Giới: Bacteria;
Ngành: Proteobacteria; Lớp: Gammaproteobacteria; Bộ: Enterobacteriales;
Họ: Enterobacteriaceae; Chi: Klebsiella; Loài: Klebsiella pneumoniae.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố
K. pneumoniae là trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không di động, có
nang polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được các tác nhân gây hại
cho tế bào. Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên. Ở người, có thể tìm
thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay các vết thương.
1.1.3. Các yếu tố độc lực của K. pneumonia
a) Kháng nguyên vỏ (bề mặt): gồm có 2 nhóm kháng nguyên K có bản
chất polysaccharide và kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide, đều
là yếu tố gây bệnh ở K. pneumoniae.
b) Hệ thống nhung mao (pili): là cơ quan giúp Klebsiella bám dính lên
bề mặt tế bào chủ, có khả năng đông tụ hồng cầu của nhiều loài động vật.
c) Các yếu tố kháng huyết thanh: lớp vỏ polysaccharide bao bọc và che
chở cho lớp lipopolysaccharide nằm bên dưới và kháng nguyên O xuyên qua
lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể.

d) Siderophore (chất mang ion – ion carrier): Klebsiella tiết ra những
chất kìm nối (chelator) phân tử lượng nhỏ, có ái lực rất cao với sắt được gọi
là các siderophore (enterochelin và aerobactin) giúp vi khuẩn có thể tăng
trưởng trong mô tế bào chủ.
1.1.4. Cấu trúc di truyền của K. pneumoniae
Ngoài một số cấu trúc di truyền của K. pneumoniae được giải trình tự
toàn bộ hay một phần trước đây như K. pneumoniae sub sp. pneumoniae
MGH (một nhiễm sắc thể dạng vòng 5,1 Mbp có tỷ lệ GC là 57%), chủng K.

3


pneumoniae NTUH-K2044 phân lập tại Đài Loan, chủng K. pneumoniae
subsp. rhinoscleromatis (ATCC13884), chủng có khả năng cố định nitơ, K.
pneumoniae 342, được sử dụng trong nghiên cứu mối quan hệ giữa thực vật
và vi khuẩn. Năm 2015, Kathryn E. Holt và cộng sự vào đã giải trình tự toàn
bộ hay một phần của 288 K. pneumoniae ở nhiều nơi trên thế giới và so sánh
với các trình tự đã được công bố nhằm mục đích xác nhận mối liên hệ giữa
các gen và mối liên quan đến khả năng gây bệnh ở người.
1.1.5. Sự đề kháng kháng sinh carbapenem ở K. pneumoniae
Klebsiella đã đề kháng với hầu hết các kháng sinh họ -lactam do gen
mã hóa -lactamase phổ rộng (ESBL) làm bất hoạt các kháng sinh này.
Carbapenem được khuyến cáo sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn
do các vi khuẩn kháng đa kháng sinh tiết ESBL, nhất là ở nhóm trực khuẩn
đường ruột gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae. K. pneumoniae đã phát
triển hoặc thu nhận gen mã hóa carbapenemase đề kháng carbapenem một
cách nhanh chóng và đã lan truyền cho các vi khuẩn khác trên thế giới.
Carbapenemase là enzym β-lactamase, được chia thành ba nhóm lớn:
nhóm A, KPC là enzym quan trọng nhất về lâm sàng và dịch tể, các enzyme
khác như SME (Serratia marcescens enzym), NMC-A/IMI (not metalloenzym carbapenemase/imipenem-hydrolysing -lactamase) và GES (Guiana

extended spectrum) không gây ra những vấn đề lâm sàng lớn; Nhóm B gồm
metallo--lactamase (MBLs), IMP (imipenemase), VIM (Verona integron
encoded metallo--lactamase) và New Delhi Metallo--lactamase (NDM);
Nhóm D gồm carbapenemase loại OXA thường được phát hiện ở
Acinetobacter spp. và cũng được phát hiện trên các Enterobacteriaceae.

4


1.2. Kháng sinh và kháng sinh họ -lactam
1.2.1. Kháng sinh
Nhiều loại kháng sinh tự nhiên hay tổng hợp khác nhau có chung một
cơ chế và phổ kháng khuẩn nên được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học và
trên tác động kìm khuẩn (bacteriostatic) hay diệt khuẩn (bacteriocidal).
1.2.2. Kháng sinh họ -lactam và các cơ chế đề kháng -lactam
Kháng sinh -lactam có cấu trúc chứa vòng -lactam, khi liên kết với
một cấu trúc khác sẽ hình thành nên các phân nhóm khác nhau như penicilin,
cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng hơn, có hoạt tính ức chế tổng hợp
peptidoglycan trên màng tế bào vi khuẩn, đích đến là phản ứng transpetidase
trong liên kết chéo của quá trình tổng hợp peptidoglycan. Do vậy, đây là
kháng sinh đáp ứng tốt nhất nguyên tắc độc tính chọn lọc và là liệu pháp điều
trị hữu hiệu được sử dụng nhiều nhất hiện nay.
Sự đề kháng kháng sinh -lactam ở Enterobacteriaceae chủ yếu do tiết
enzym  -lactamase thủy phân vòng -lactam làm mất hoạt tính của kháng
sinh. Các -lactamase được phân loại dựa trên sự tương đồng của các axit
amin và được chia thành bốn lớp phân tử là A, C và D gồm các -lactamases
có serine ở vị trí hoạt hóa và nhóm B còn gọi là metallo-beta-lactamase
(MBL), có kẽm ở vị trí hoạt hóa.
1.3. Carbapenem và các cơ chế đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae
Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của thienamycin, một hợp

chất tự nhiên do nấm Streptomyces catlaya tiết ra, có phổ kháng khuẩn rộng
nhất so với các -lactam khác. Carbapenem có cấu trúc gần giống với
penicillin nhưng có nhiều ưu điểm hơn so với các kháng sinh -lactam khác
là: (i) phân tử nhỏ nên có khả năng sử dụng những lổ nhỏ trên màng ngoài tế
bào vi khuẩn gram âm để tiếp xúc với PBP (penicillin binding protein); (ii)
khó bị phân hủy bởi các -lactamase của nhiều vi khuẩn và (iii) có ái lực với

5


nhiều PBP khác nhau của nhiều loại vi khuẩn. Các cơ chế đề kháng
carbapenem chính ở K. pneumoniae gồm:
- Cơ chế qua trung gian enzym ESBL hay carbapenemase và biểu hiện
của một hay nhiều ESBL, sản xuất vượt mức AmpC -lactamase kết hợp với
giảm tính thấm màng ngoài do mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng
vào của kháng sinh.
- Cơ chế không enzym: bơm đẩy kháng sinh hay thay đổi ái lực đối với
carbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với chuỗi
peptidoglycan đang được tổng hợp của vi khuẩn.
Cơ chế quan trọng và được quan tâm nhiều nhất hiện nay là cơ chế
kháng thông qua enzym carbapenemase được mã hóa bởi gen nằm trên
plamid gọi là Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) và New Dehli
Metalo--lactamase (NDM).
1.4. Tình hình nghiên cứu tính đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae
1.4.1. Tình hình đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae trên thế giới
Gen mã hóa KPC được phát hiện lần đầu tiên năm 2001 trên plasmid
của K. pneumoniae đề kháng carbapenem, các cephalosporin phổ rộng và
aztreonam. Sự phát triển tính kháng do KPC được phát hiện khi kháng sinh
này được dùng để điều trị trên bệnh nhân đã mang các chủng đề kháng với
ceftazidime và aminoglycoside (Muhamad Ahmad và cộng sự) và quá trình

kháng carbapenem có thể kết hợp giữa sự mất đi porin và sự hiện diện của lactamase qua trung gian plasmid (Martinez) hay giảm điều hòa phosphate
transport porin PhoE. Gen mã hóa KPC hiện diện trên tranposon mới của
Tn3 là Tn4401 có kích thước 10 kb, mang một transposase và hai trình tự
chèn ISkpn6 và ISkpn7, có vai trò lan truyền gen này thông qua plasmid.
Nhiều nghiên cứu môi trường chọn lọc để phát hiện vi khuẩn tiết
carbapenemase, các phương pháp sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu

6


để phát hiện nhanh và phát hiện phân biệt các biến thể của gen mã hóa KPC
cũng như chứng minh khả năng lan truyền gen đề kháng cho các vi khuẩn
cùng hay khác loài gây nên nhiều vụ dịch bệnh trên thế giới.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh carbapenem ở K.
pneumoniae tại Việt Nam
Ở Việt Nam, carbapenem là một kháng sinh mới và chưa phổ biến nên
sự đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh này còn ít và hiện nay chưa có
nghiên cứu về sự đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae thông qua cơ chế
tiết enzym KPC. Các dữ liệu công bố tại các bệnh viện về tình hình đề kháng
carbapenem của K. pneumoniae chủ yếu dựa trên kết quả xét nghiệm kháng
sinh đồ hay nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) mà chưa nêu rõ được cơ chế của
hiện tượng đề kháng. Do vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử
về kiểu hình, kiểu gen và biểu hiện của các gen mã hóa KPC hiện diện trên
plasmid ở một số chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem cũng như cơ
chế gây nên sự lan truyền của tính kháng carbapenem của K. pneumoniae
mang gen mã hóa KPC là cần thiết trong giai đoạn hiện nay.
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
27 chủng K. pneumoniae kháng carbapenem phân lập được từ tháng 6 –
2010 đến tháng 6 năm 2014.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Vi khuẩn K. pneumoniae được phân lập và định danh vi khuẩn bằng bộ
định danh vi khuẩn IDS 14® GNR (Nam Khoa, Việt Nam, TCCL số
02951/2001/CBTC-TDC) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Xác định mức độ đề kháng đa kháng sinh của các chủng K.
pneumoniae bằng kỹ thuật kháng sinh đồ với đĩa kháng sinh (Bio-Rad (Mỹ).

7


- Xác định mức độ đề kháng carbapenem bằng phương pháp khuếch tán
kháng sinh và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với kháng sinh carbapenem
(imipenem, meropenem và ertapenem) theo tiêu chuẩn CLSI.
- Phát hiện kiểu gen đề kháng carbapenem (gen mã hóa KPC và NDM1) bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR theo khuyến nghị của CDC và
kiểu gen đề kháng đa kháng sinh (ESBL và AmpC -lactamase) của các
chủng bằng kỹ thuật Multiplex PCR.
- Các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa
KPC được xác định kiểu hình sinh carbapenemase bằng kỹ thuật Modified
Hodge Test (MHT); Sản phẩm khuếch đại gen mã hóa KPC được giải trình
tự và so sánh trên ngân hàng gen để xác định kiểu gen đề kháng.
- Nghiên cứu khả năng lan truyền tính kháng carbapenem từ các chủng K.
pneumoniae sang cho vi khuẩn E. coli J53 bằng phương pháp tiếp hợp, xác
nhận kiểu hình, kiểu gen bằng kỹ thuật multiplex PCR, multiplex real-time
PCR và kiểm tra xác nhận protein KPC bằng kỹ thuật Western blot.
- Phân tích biểu hiện hoạt tính KPC trong dịch đồng nhất sinh khối của
hai chủng KP02 vả KP03 và; tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa KPC của hai
chủng trên với promoter tự nhiên và promoter T7. Protein KPC được tinh
sạch trên cột sắc ký ái lực và kiểm tra bằng kỹ thuật sắc ký kết hợp với khối
phổ (LC-MS), sau đó được dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột; kháng

huyết thanh kháng KPC được kiểm tra bằng phương pháp miễn dịch ELISA
và sử dụng để kiểm chứng sự hiện diện của KPC trên các chủng K.
pneumoniae đề kháng carbapenem theo cơ chế KPC và các vi khuẩn khác
bằng kỹ thuật Western blot.

8


KẾT QUẢ
3.1. Thu nhận, khảo sát mức độ kháng thuốc của các chủng K.
pneumoniae đề kháng carbapenem
3.1.1 Thu nhận, xác nhận các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem
Từ tháng 06 năm 2010 đến tháng 06 năm 2014, đã thu nhận được 27
chủng K. pneumoniae từ Bệnh viện Truyền máu Huyết học Trung ương và
Bệnh Viện Nguyễn Tri Phương TP.HCM đề kháng với kháng sinh
carbapenem trong số 1,538 chủng nghi ngờ kháng (1,76%). Các chủng được
định danh là K. pneumoniae, đủ điều kiện để thực hiện nghiên cứu.
3.1.2. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy 100% các chủng đã kháng với
ampicillin và các kháng sinh khác thuộc nhóm -lactam, 93% đến 100%
chủng kháng với các kháng sinh khác nhau thuộc nhóm carbapenem, 90%
kháng quinolone, gần 50% kháng aminoglycoside và 18,5% kháng colistin.
Các chủng kháng với 9 - 14 loại kháng sinh thông dụng. 1 chủng kháng
14 kháng sinh (chiếm 4% số chủng), 6 chủng kháng 13 kháng sinh (22%), 6
chủng kháng 12 kháng sinh (22%), 9 chủng kháng 11 kháng sinh (33%), 4
chủng kháng 10 kháng sinh (15%), và 1 chủng kháng 9 kháng sinh (4%).

Hình 3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh ở các chủng K. pneumoniae kháng
carbapenem.
9

3.1.3. Mức độ đề kháng carbapenem của các chủng
Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC cho thấy 26/27 chủng
(96%) K. pneumoniae phân lập được đã kháng với imipenem, 25/27 chủng
(92,5%) đã kháng với meropenem và 100% kháng với ertapenem.
3.2. Nghiên cứu kiểu gen đề kháng carbapenem của các chủng K.
pneumoniae
3.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của gen mã hóa KPC và NDM-1 ở các chủng
Kết quả multiplex Real-time PCR cho thấy có 11 chủng dương tính với
gen mã hóa KPC, 15 chủng còn lại dương tính với gen mã hóa NDM-1, 1
chủng âm tính với cả hai gen mã hóa trên. Các chủng có KPC (+) đều có
NDM-1 (-) và ngược lại.
3.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của các gen mã hóa ESBL ở các chủng
Các enzym SHV, TEM, CTX-M và OXA là những -lactamase phổ
rộng phổ biến góp phần làm giảm nhạy cảm của kháng sinh carbapenem
trong điều trị ở K. pneumoniae và vi khuẩn đường ruột khác. Kết quả kiểm
tra sự hiện diện gen mã hóa ESBL ở các chủng được trình bày trên Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số gen mã hóa ESBL ở các chủng K. pneumoniae kháng
carbapenem
Số gen

Gen mã hóa

ESBL
0
1

Số chủng

01 (3,7)
SHV

Chủng

(%)
KP06

05 (18,5) KP01, KP23, KP25, KP30
và KP33

2

SHV, TEM

11 (40,7) KP03, KP10, KP12, KP18,
KP19, KP24, KP28, KP31,
KP32, KP35 và KP36

SHV, CTX-M-1

02 (7,4)

10

KP21 và KP34


Số gen

Gen mã hóa

ESBL

3

Số chủng

Chủng

(%)

SHV, CTX-M-9

02 (7,4)

KP04 và KP27

SHV, TEM, CTX-M-1

04 (14,8) KP07, KP16, KP20, KP26

SHV, TEM, CTX-M-9

02 (7,4)

KP02 và KP13

Gen mã hóa SHV hiện diện ở 26/27 số chủng (chiếm 96%); 17/27 số
chủng mang gen mã hóa TEM (63%). Có 14 chủng (52%) mang đồng thời 2

gen ESBL; Hầu hết các chủng đều mang gen mã hóa SHV và TEM (chiếm
71,5%). Không phát hiện CTX-M2 và sự hiện diện đồng thời của gen mã hóa
TEM và CTX-M. Có 6 chủng (22%) mang 3 gen mã hóa ESBL (gen mã hóa
SHV, TEM và CTX-M1 hoặc CTX-M9).
3.2.3. Sự hiện diện gen mã hóa -lactamase AmpC ở các chủng
Kết quả phân tích cho thấy có bốn loại -lactamase AmpC ở các chủng
K. pneumoniae kháng carbapenem được phát hiện là ACC, DHA, ACT1 và
CMY ở 10 trong số 27 chủng nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 37%.
3.3. Đặc điểm kháng carbapenem do KPC ở K. pneumoniae đề kháng
carbapenem
3.3.1. Kiểu hình sinh carbapenemase của các chủng K. pneumoniae đề
kháng carbapenem
Mười một chủng đề kháng mang kiểu gen mã hóa KPC được kiểm
chứng có kiểu hình carbapenemase dương tính bằng thử nghiệm Hodge cải
biên, (MHT - Modified Hodge Test) theo hướng dẫn của CLSI với hai chủng
chuẩn K. pneumoniae ATTC® BAA-1705 (chủng có carbapenemase dương
tính) và 1706 (chủng có carbapenemase âm tính).
3.3.2. Giải trình tự xác định gen mã hóa KPC
Gen mã hóa KPC của các chủng có kiểu hình KPC (+) và MHT (+)
được nhân bản, thu nhận bằng phản ứng PCR trên khuôn là DNA của các

11


chủng này. Sản phẩm PCR giải trình tự được điện di mao quản trên hệ thống
ABI 3130 XL Gentic Analyser. Kết quả được phân tích bằng phần mềm
Sequencing Analysis và kiểm tra độ tương đồng trên ngân hàng gen NCBI.

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự chủng K. pneumoniae ATCC BAA 1705.
Việc giải trình tự gen mã hóa KPC của các chủng thí nghiệm cũng cho

kết quả tương đồng 99% - 100% so với chủng chuẩn ATCC BAA 1705 khi
tra cứu so sánh trên chương trình BLAST (NCBI) và cả 11 chủng đều mang
gen mã hóa cho KPC-2.
3.3.3. Hoạt tính enzym KPC trong dịch đồng nhất sinh khối của các
chủng
Vi khuẩn E. coli ATCC 25922 phát triển được trên đĩa môi trường
xung quanh các đĩa giấy có tẩm dịch đồng nhất sinh khối của các chủng K.
pneumoniae kháng carbapenem nhưng không phát triển được xung quanh và
bên trong vòng vô khuẩn tạo ra bởi đĩa giấy tẩm kháng sinh carbapenem.
Chứng tỏ dịch đồng nhất từ sinh khối các chủng K. pneumoniae thử nghiệm
có hoạt tính carbapenemase.
3.4.4. Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa KPC-2
Gen mã hóa KPC-2 từ hai chủng KP02 và KP03 được thu nhận và tạo
dòng trong vector biểu hiện pET28a có cấu trúc đuôi Histidin với promoter
tự nhiên và promoter T7. Các plasmid được biến nạp vào tế bào E. coli BL21

12


và nuôi cấy trong môi trường chứa ertapenem (4 µg/ml). Kết quả nuôi cấy
sau 4h (T=4h) ở giá trị OD600nm.
Bảng 3.7. Biểu hiện carbapenemase ở chủng mang plasmid tái tổ hợp
E. coli BL21 mang

OD600nm / kháng sinh Ertapenem 4 µg/ml

plasmid tái tổ hợp Trước khi bổ sung (T=0 h)

Sau khi bổ sung (T=4 h)

pKPCwt-1705

2,08

3,10

pKPCwt-KP02

2,05

2,90

pKPCwt-KP03

2,07

3,06

pKPCcc-1705

2,01

3,49

pKPCcc-KP02

2,02

3,27

pKPCcc-KP03

2,04

3,65

pET28a

2,01

0,66

Kết quả khảo sát cho phép khẳng định gen mã hóa KPC-2 hiện diện
trong các tế bào E. coli tái tổ hợp được biểu hiện với promoter tự nhiên và T7
có hoạt tính carbapenemase thủy phân ertapenem trong môi trường nuôi cấy.
3.3.5. Thu nhận KPC-2 tái tổ hợp dùng làm kháng nguyên gây đáp ứng
miễn dịch để thu nhận kháng thể
Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy, ở các giếng điện di đều xuất
hiện một vạch protein đậm khoảng 29 kDa mà không xuất hiện trên mẫu đối
chứng E. coli BL21 (DE3) mang plasmid gốc pET28a và chủng mang
plasmid không được cảm ứng bằng IPTG. Protein KPC-2 của chủng mang
plasmid pKPCcc-KP03 và đối chứng dương 1705 được kiểm tra tính tan và
tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Kết quả cho thấy protein KPC-2 hiện diện chủ
yếu trong pha tan (S) và protein KPC-2 sau tinh chế là một vạch protein mục
tiêu với kích thước khoảng 29 kDa.
Kết quả LCMS cho thấy có 1 cấu tử duy nhất với khối lượng phân tử
29,542 Da (tương ứng với khối lượng protein KPC-2 trong tự nhiên) tại thời

13

gian lưu 11,3 – 11,5. Chứng tỏ protein KPC-2 thu được là tinh sạch và có
trọng lượng phân tử chính xác với trọng lượng phân tử KPC trong tự nhiên.

(A)

(B)

Hình 3.13. Kết quả kiểm tra tính tan và tinh sạch protein KPC-2. (A) Tính
tan của protein KPC-2 biểu hiện trong tế bào E. coli tái tổ hợp (B) Độ tinh
sạch của protein sau khi tinh chế protein bằng sắc ký ái lực. M: Thang
protein chuẩn, T: protein tổng, P: protein tủa và S: protein tan.
3.3.6. Gây đáp ứng miễn dịch và thu nhận kháng huyết thanh chứa
kháng thể kháng KPC-2

Hình 3.15. Kết quả đánh giá kháng huyết thanh chuột được gây đáp ứng
miễn dịch với KPC-2 bằng phương pháp ELISA
Kết quả đánh giá kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA với
chứng âm là mẫu huyết thanh chuột khi chưa tiêm protein KPC được trình
14


bày trên Hình 3.15 cho thấy sự đáp ứng tốt với kháng thể kháng KPC-2 có
trong huyết thanh chuột ở độ pha loãng là 1/125,000 tại nồng độ protein
KPC-2 là 0,1 g. Như vậy, kháng huyết thanh thu nhận từ chuột được gây
đáp ứng miễn dịch có chứa kháng thể chuyên biệt đối với KPC-2.
3.3.7. Xác nhận biểu hiện gen mã hóa KPC-2 ở các chủng K. pneumoniae
đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 bằng Western blot
Dịch đồng nhất từ sinh khối của 11 chủng đề kháng carbapenem qua cơ
chế KPC-2, chủng chuẩn ATCC 1705, các chủng đối chứng âm E. coli

BL21, B. subtilis 1102 và E. coli J53 được điện di trên gel SDS-PAGE và
thực hiện phản ứng Western blot. Kết quả được trình bày trên Hình 3.16.

(A)

(B)

Hình 3.16. Kết quả Western blot khẳng định sự hiện diện protein KPC-2 ở
các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2.
Kết quả lai Western blot cho thấy hầu hết các chủng đều xuất hiện vạch
tín hiệu lai tương tự như chủng chuẩn K. pneumoniae ATCC 1705 hay vạch
protein KPC-2 đã tinh sạch (KPC+) với kích thước khoảng 29 kDa. Điều này
cho phép khẳng định gen mã hóa KPC-2 đã biểu hiện thành protein KPC-2

15


hiện diện trong dịch đồng nhất sinh khối các chủng có khả năng thủy phân
kháng sinh carbapenem.
3.4. Nghiên cứu khả năng lan truyền tính đề kháng theo chiều ngang của
các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem theo cơ chế KPC
3.4.1. Khả năng lan truyền tính đề kháng carbapenem của các chủng K.
pneumoniae sang E. coli in vitro
E. coli J53 là chủng có F- met pro, mang gen kháng sodium azide được
sử dụng để làm chủng nhận, các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem
mang gen mã hóa KPC-2 dùng làm chủng cho.
50l dịch nuôi cấy trên môi trường LB broth với tỉ lệ 1:1 (1ml dịch
nuôi cấy K.pneumoniae và 1 ml E. coli J53 vào 18ml LB), được cấy kiểm tra
trên môi trường chọn lọc có bổ sung Az và ertapenem (4g/ml). Hai chủng
tiếp hợp của các chủng KP06 và KP18 phát triển được trên môi trường chọn

lọc, được ký hiệu lần lượt là Eco06 và Eco18 và được định danh là
Escherichia coli. Như vậy, tỷ lệ chuyển gen trong thí nghiệm này là 18,18%.
3.4.2. Kiểm chứng kiểu hình kháng carbapenem các chủng tiếp hợp
bằng phương pháp kháng sinh đồ
Hai chủng tiếp hợp Eco06 và Eco18 đều có kiểu hình đề kháng trung
gian với carbapenem, đồng thời cũng đề kháng với các -lactam khác.
Bảng 3.9. Sự đề kháng kháng sinh của chủng cho KP06 và KP18 với các
chủng tiếp hợp Eco06 và Eco18
Chủng IM

ME

EN CO DX

RF

CI

AM

AC

CX

CT

CZ AK

CN

KP06

R

R

R

S

S

R

I

R

R

R

R

R

R

R

Eco06

I

I

I

S

S

R

S

R

R

R

R

S

S

S

KP18

R

R

R

R

S

R

R

R

R

R

R

R

S

R

Eco18

I

I

I

S

S

S

S

S

R

I

R

S

S

S

R: kháng, I: kháng trung gian, S nhạy cảm.
AM (ampicillin); CN (cefoxitin); CT (cefotaxim); CZ(ceftazidime); AC
(amoxillin/clavulanic acid); RF (rifampin); DX (doxicycline); CI (ciprofloxacin); AK
(amikacin); IM (imipenem); EN (ertapenem); ME (meropenem); CO (colistin)

16


3.4.3. Kiểm chứng kiểu gen KPC-2 của các chủng E. coli tiếp hợp
Hai chủng tiếp hợp Eco06 và Eco18 có kết quả là KPC-2 khi kiểm tra
bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR. Chủng Eco06 không nhận được gen
ESBL hay AmpC, chủng Eco18 nhận được một gen ESBL là TEM.
Bảng 3.10. Kết quả tiếp hợp in vitro các chủng kháng carbapenem.
Chủng
KP06
KP18

+

LB+Az
+ En
+

Định
danh
E. coli

Nhận được
các gen
KPC

+

+

E. coli

KPC, TEM

Gen hiện diện

LB+Az

ESBL: KPC
AmpC: ACT-1
ESBL: KPC, SHV,
TEM
AmpC: không

3.4.4. Kiểm tra sự biểu hiện gen mã hóa KPC-2 ở chủng tiếp hợp
Kết quả kiểm chứng sự hiện diện của protein KPC trong chủng tiếp
hợp bằng kỹ thuật Western blot cho thấy ở cả hai chủng tiếp hợp đều xuất
hiện vạch tín hiệu lai tương tự như chủng chuẩn K. pneumoniae ATCC 1705
và vạch protein KPC-2 đã tinh sạch (KPC (+). Kết quả này khẳng định đã có
sự truyền gen mã hóa KPC kháng carbapenem từ các chủng K. pneumoniae
đề kháng carbapenem sang vi khuẩn E. coli J53 và gen mã hóa KPC-2 đã
được biểu hiện đến mức protein trong chủng tiếp hợp gây nên hiện tượng đề
kháng trung gian với carbapenem.
BÀN LUẬN
Nghiên cứu này đã sàng lọc và thu nhận được 27 chủng K. pneumoniae

đề kháng với carbapenem trong số 1,538 chủng sinh ESBL (chiếm tỷ lệ
1,76%) từ tháng 06 năm 2010 đến tháng 06 năm 2014. Tỷ lệ này tương đồng
với các nghiên cứu đa trung tâm trong nước như MIDAS, GARP hay
SMART, gần với nghiên cứu trên 49 nước Châu Á từ năm 2000 đến năm
2012 (0.8 đến 1.4%) và Việt Nam là một trong ba nước có tỷ lệ đề kháng cao
nhất. Các chủng K. pneumoniae phân lập được trong nghiên cứu này đã
kháng từ 9 đến 14 loại kháng sinh thông dụng trong điều trị nhiễm khuẩn như
17


penicillin, cephalosporin thế hệ 3 ở tỷ lệ 100%, các quinolone hơn 90%.
Carbapenem là kháng sinh được sử dụng để điều trị bao vây và theo mục tiêu
các vi khuẩn sinh ESBL đề kháng đa kháng sinh cũng đã bị kháng từ 96%
đến 100%. Kết quả này hoàn toàn tương tự với các kết luận khác đã được
công bố ở các K. pneumoniae đề kháng carbapenem sẽ đề kháng với các βlactam khác như penicillin, cephalosporin, and monobactam, và có hoạt tính
yếu với cefamycin và ceftazidime.
Cơ chế đề kháng carbapenem do KPC và NDM-1 là hai cơ chế quan
trọng và được quan tâm nhiều nhất ở K. pneumoniae trong điều trị và giám
sát nhiễm khuẩn.
Đề kháng carbapenem do gen mã hóa carbapenemase KPC và NDM-1
Tỷ lệ kiểu gen mã hóa KPC là 40,7% và NDM-1 là 55,6% trong số các
chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem tương đương với nghiên cứu tại
bệnh viện Nguyễn Đình Chiểu, Bến Tre (55,6%) và Bệnh viện Chợ Rẫy
(52,63%), gần với nghiên cứu tại các nước Mỹ La Tinh và Ấn Độ nhưng thấp
hơn so với các nước như Anh (64,3%), Italy (89,5%) và Canada (80%).
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy các quốc gia phát triển đã sử
dụng carbapenem từ những năm 1990 nên tỷ lệ đề kháng ở các chủng K.
pneumoniae mang gen mã hóa NDM-1 và KPC khá cao. Ở các quốc gia đang
phát triển như Mỹ La Tinh hay Châu Á, điều kiện chăm sóc sức khỏe và y tế
chưa tiên tiến, carbapenem được sử dụng trễ hơn nên tỷ lệ đề kháng thấp

hơn. Điều này áp dụng đúng trong nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên
cứu khác tại Việt Nam bởi vì carbapenem chỉ được sử dụng nhiều và thường
xuyên khi có khuyến cáo chính thức của Vụ điều trị, Bộ Y tế vào năm 2006
(công văn số 7654/BYT- ĐTr ngày 10/10/2006) mà trước đó chỉ sử dụng hạn
chế theo kinh nghiệm điều trị của bác sĩ.
Sự xuất hiện các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem mang
gen mã hóa NDM-1 và KPC trong nghiên cứu của chúng tôi, cùng với các

18


luận cứ về mối tương quan giữa việc sử dụng carbapenem và sự đề kháng
kháng sinh này cho thấy rằng việc thay thế các kháng sinh khác bằng
carbapenem trong điều trị dẫn đến hiện tượng đề kháng carbapenem bởi vì
việc gia tăng sử dụng kháng sinh này chính là áp lực chọn lọc để các vi
khuẩn phát triển tính đề kháng.
Đề kháng carbapenem do mang gen mã hóa NDM-1
NDM-1 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2008 ở chủng K.
pneumoniae phân lập từ một bệnh nhân người Thụy Điển có tiền sử điều trị
bệnh tại New Dehli, Ấn Độ. Sau đó đã được phát hiện tại Pakistan, Trung
Quốc, Anh Quốc và nhiều nước lân cận Việt Nam như Singapore, Đài Loan,
Thái Lan… Trong đó K. pneumoniae là vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất.
Cũng như các nghiên cứu khác trên thế giới, các chủng K. pneumoniae
kháng carbapenem mang gen NDM-1 trong nghiên cứu của chúng tôi đều
mang các gen ESBL phổ rộng như TEM, SHV; các ESBL phổ mở rộng như
CTX-M; các AmpC -lactamase như ACC, CMY, DHA và đã đề kháng với
các loại kháng sinh thuộc họ -lactam, cephamycine, aminoglycoside,
tetracycline, quinolone và còn nhạy cảm với hai kháng sinh diệt khuẩn là
colistin và fosfomycin và một kháng sinh kìm khuẩn là tigecycline.
Ba chủng K. pneumoniae mang gen NDM-1 là KP30, KP32 và KP35

đã đề kháng với cả colistin, chứng tỏ các chủng này đã có xu hướng phát
triển tính đề kháng với kháng sinh này. Đây là một vấn đề cần quan tâm tại
Việt Nam vì đã có nghiên cứu cho biết colistin không phù hợp để điều trị các
chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem có mang gen mã hóa NDM-1.
Đồng thời, các K. pneumoniae mang gen mã hóa NDM-1 đã được chứng
minh có khả năng lan truyền ngang sang cho các chủng cùng hay khác loài
dẫn đến việc vô hiệu hóa và thất bại trong điều trị bằng nhóm kháng sinh
quan trọng này.

19


Đề kháng carbapenem do mang gen mã hóa KPC
Kể từ khi được phát hiện ở K. pneumoniae, KPC đã là tác nhân gây
nên nhiều vụ dịch bệnh tại các đơn vị lâm sàng và đã lây lan ra nhiều quốc
gia khác trên các vi khuẩn đường ruột như E. coli, P. aeruginosa,
Citrobacter freundii, Serratia marcescens và E. cloacae.
Mười một chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem trong nghiên
cứu của chúng tôi đều mang gen mã hóa carbapenemase KPC-2. Đây là kiểu
gen được phát hiện đầu tiên trên thế giới ở chủng K. pneumoniae phân lập tại
Bắc Carolina, Hoa Kỳ năm 2001 có khả năng thủy phân hầu hết các β-lactam
bao gồm cả penicillin, cephalosporin, and monobactam (aztreonam), có hoạt
tính yếu với cefamycin và ceftazidime.
Một báo cáo trước đây tại Việt Nam cũng cho thấy có sự hiện diện của
chủng Ent. hormaechii mang gen KPC-2 và liên tục sau đó đã phân lập thêm
được các chủng khác như E. coli, Ent. cloaceae hay Ent. absuriae. Đây là
một vấn đề đáng quan tâm về sự lan truyền tính đề kháng giữa các chủng
củng hay khác loài.
Các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem trong nghiên cứu này
có kiểu gen mã hóa KPC-2 và có mang gen mã hóa CTX-M hay AmpC

ACC, có kiểu hình đề kháng từ 9 đến 14 loại kháng sinh thuộc 7 nhóm kháng
sinh thông dụng trong điều trị. Như vậy, về kiểu hình và kiểu gen đề kháng
carbapenem, các chủng K. pneumoniae này cũng có cùng cơ chế đề kháng
như các nghiên cứu khác trên thế giới là các K. pneumoniae đề kháng
carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 thường đồng thời mang các gen mã
hóa SHV, TEM và CTX-M hay AmpC -lactamase gây nên hiện tượng đề
kháng với nhiều kháng sinh kể cả aminoglycoside và quinolone.
Cùng một kiểu gen mã hóa là KPC, SHV và TEM nhưng với chủng có
thêm gen mã hóa AmpC là ACC (KP03 và KP12) hay CTX-M (chủng KP02,
KP04, KP07, KP13) thì MIC của carbapenem tăng lên so với chủng không

20


mang enzym này. Điều này là do các gen đề kháng kháng sinh phổ rộng làm
tăng cường mức độ kháng carbapenem ở các chủng này.
Tuy nhiên, vẫn có sự sai biệt trong mức độ đề kháng (giữa chủng KP02
và KP13; KP07 và KP20) có thể do nhiều yếu tố khác nhau, đó là: i) Có sự
đồng hiện diện của các cơ chế đề kháng khác; ii) Các ức chế về mặt di truyền
dẫn đến gen không biểu hiện; hay iii) Số lượng gen đề kháng trên plasmid
hay số lượng plasmid có mang gen đề kháng.
Đặc điểm kháng carbapenem do KPC ở các chủng K. pneumoniae đề
kháng carbapenem
100% số chủng K. pneumnoniae đề kháng carbapenem mang gen mã
hóa KPC-2 trong nghiên cứu của chúng tôi được xác nhận mang kiểu hình
carbapenemase dương tính bằng phương pháp Modified Hodge Test. Đây
cũng là là phương pháp được CDC công bố có độ nhạy và độ đặc hiệu là
100% trên các chủng Enterobacteriaceae mang gen mã hóa KPC. Theo CLSI,
thử nghiệm này có độ nhạy và độ chuyên biệt cao để phát hiện
carbapenemase loại KPC, mà chưa rõ đối với các metallo-beta-lactamase hay

trên cabapenemase nhóm D hoặc do các chủng này tiết enzym ESBL cùng
với giảm hoặc mất biểu hiện porin.
Về biểu hiện protein KPC, dịch đồng nhất sinh khối từ chủng KP02 và
KP03 có hoạt tính carbapenemase và các chủng E. coli mang plasmid tái tổ
hợp chứa gen mã hóa KPC-2 của hai chủng này với promoter tự nhiên
(pKPCwt) biểu hiện thành protein KPC-2, khi có hay không bổ sung IPTG,
chứng tỏ promoter tự nhiên của các chủng tạo dòng và biểu hiện được trong
plasmid tái tổ hợp dù mức độ biểu hiện thấp hơn so với promoter T7. Các
nghiên cứu khác cho thấy ở các chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa KPC,
MIC của chủng mang plasmid nhân tạo thường cao hơn MIC ở các chủng
mang plasmid tự nhiên nhất là khi plasmid mang gen mã hóa KPC có sự hiện

21


diện của các gen đề kháng kháng sinh khác cũng làm tăng tính kháng đối với
carbapenem ở các chủng này.
Kết quả biểu hiện carbapenemase KPC-2 trong chu chất của chủng E.
coli tái tổ hợp trong phản ánh đúng bản chất biểu hiện tính kháng ở vi khuẩn
Gram âm là các enzym -lactamase, ở đây là KPC-2, được sản xuất nội bào
bên trong chu chất giữa màng ngoài và vách tế bào vi khuẩn.
Sự lan truyền gen đề kháng carbapenem của các K. pneumoniae in vitro
Hai trong số 11 chủng (18,18%) sau tiếp hợp được xác nhận mang gen
mã hóa KPC-2 và biểu hiện thành protein KPC-2 có hoạt tính
carbapenemase. Tỷ lệ này tương tự một nghiên cứu tại Việt Nam trên các
chủng vi khuẩn đường ruột đề kháng carbapenem chuyển gen sang vi khuẩn
E. coli J53 là 14,3% và các nghiên cứu khác trên thế giới. Sự lan truyền gen
mã hóa KPC theo cơ chế này cũng được Sarah N. Richter sử dụng để giải
thích sự chuyển gen KPC-2 từ K. pneumoniae sang vi khuẩn E. coli trên
cùng một bệnh nhân tại Châu Âu.

Nhiều nghiên cứu cho thấy sự lan truyền gen mã hóa KPC trên các
chủng sau tiếp hợp chủ yếu thông qua plasmid và tranposon, gen này được
phát hiện trên các biến thể của Tn4401 như plasmid IncFII có kích thước 130
kb nằm trên transposon Tn4401a hay plasmid IncN (40 kb), IncL/M (50 to
60 kb) trên transposon Tn4401b nhưng chỉ có các plasmid IncFII là lan
truyền được theo cơ chế tiếp hợp. Gen mã hóa KPC cũng hiện diện trên
nhiều trình tự ST khác nhau làm cho gen này có khả năng lan truyền sang
cho các vi khuẩn khác. Mặc dù chưa thực hiện được việc xác định tính đa
dạng di truyền của plasmid mang gen mã hóa KPC-2 để làm sáng tỏ khả
năng lan truyền gen này từ K. pneumoniae sang E. coli J53, các kết quả trên
có thể làm luận cứ để giải thích lý do tại sao chỉ có 2 trong số 11 chủng có
thể lan truyền được sang E. coli trong nghiên cứu của chúng tôi. Bên cạnh

22


đó, đây là các chủng mới tiếp hợp có thể chưa ổn định về mặt di truyền nên
biểu hiện tính kháng chưa đủ để phát hiện trên môi trường chọn lọc.
Đối với 2 chủng tiếp hợp thành công, chủng Eco06 nhận được gen mã
hóa KPC-2, có kiểu hình kháng với các kháng sinh -lactam và kháng trung
gian với carbapenem nhưng không đề kháng với các kháng sinh quinolone
hay aminoglycoside như chủng KP06 cho thấy gen mã hóa KPC-2 đã chuyển
sang cho chủng Eco06 có thể không mang các gen gây nên hiện tượng đề
kháng hai kháng sinh này. Các nghiên cứu trước đây trên thế giới cũng có
cùng nhận định là khi vi khuẩn mang gen mã hóa KPC-2 sẽ đề kháng với các
kháng sinh -lactam nhưng không đề kháng các kháng sinh không phải lactam nếu không mang các gen đề kháng các kháng sinh này.
Tương tự chủng Eco06, chủng Eco18 nhận được thêm gen ESBL là
TEM, đề kháng với cefotaxime, ceftazidime và kháng sinh phối hợp
amoxiline/ clavulanic aicd nhưng lại kháng số lượng kháng sinh ít hơn chủng
Eco06, điều này có thể do sự khác biệt về biểu hiện gen giữa hai chủng sau

tiếp hợp, các ức chế về mặt di truyền trên tế bào E. coli hay sự khác biệt về
số lượng gen hiện diện trên plasmid có mang gen đề kháng ở hai chủng này.
Như vậy, các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem trong nghiên
cứu của chúng tôi được chứng minh (i) có mang gen mã hóa cho KPC-2 (ii)
biểu hiện được thành protein KPC-2 có hoạt tính thủy phân carbapenem và
(iii) gen này có khả năng lan truyền theo chiều ngang cho vi khuẩn E. coli
làm cho vi khuẩn này cũng biểu hiện tính kháng với carbapenem.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Các kết quả thực nghiệm của luận án có thể được tóm tắt như sau:
- Hai mươi bảy chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem đã đề kháng từ
9 đến 14 loại kháng sinh thông thường sử dụng trong điều trị nhiễm
khuẩn; 100% số chủng kháng với ampicillin và cephalosporin các thế hệ;

23