Khóa luận nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn quang hợp tía có khả năng cố định nitơ phân tử

Khoá luận tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, chúng ta đều biết ô nhiễm môi trường đã trở thành vấn đề
bức xúc đối với mỗi quốc gia. Sự gia tăng dân số và phát triển sản xuất đã kéo
theo sự tích tụ ngày càng nhiều các loại chất thải trong lòng đất, các thủy vực
tù đọng. Hiện nay, toàn cầu đang phải đối mặt với sự biến đổi khí hậu, trong
đó các nước nhiệt đới phải chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Liên hợp quốc đang
kêu gọi mỗi Quốc gia cần phải có các biện pháp cấp bách để giảm thiểu được
tối đa những yếu tố gây ảnh hưởng đến môi trường, khí hậu.
Trong sản xuất Nơng nghiệp ngày nay, việc lạm dụng các hóa chất
trong phân bón hóa học, thuốc trừ sâu… đã gây ảnh hưởng xấu đến môi
trường và làm nghèo đất, làm ành hưởng tới quần thể vi sinh vật đất làm mất
cân bằng sinh thái. Do đó, người ta khuyến cáo nên dùng phân bón hữu cơ và
phân bón vi sinh trong sản xuất nơng nghiệp nhằm mang lại sự bền vững sinh
thái.
Theo hướng nghiên cứu này, nhiều nhà khoa học đã sử dụng các nhóm
vi sinh vật có ích trong đất, đặc biệt nhóm có khả năng cố định nitơ phân tử
để sản xuất các chế phẩm sinh học sử dụng trong nông nghiệp. Trong số các
nhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử, người ta đang chú trọng
đến nhóm vi khuẩn quang hợp tía vì chúng có khả năng sử dụng nhiều hợp
chất trong tự nhiên làm nguồn Carbon cho sinh trưởng nên dễ dàng sản xuất
sinh khối của chúng. Mặt khác, có thể tận dụng các nguồn nước thải nơng
nghiệp làm môi trường nuôi để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, sinh khối sau
khi xử lý có thể được sử dụng làm phân bón vi sinh cố định nitơ.
Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này ít được chú ý, trước đây người ta
thường sử dụng vi khuẩn lam, vi khuẩn nốt sần để tạo các chế phẩm phân bón
vi sinh nhưng chưa đề cập đến nhóm vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH). Do
đó, chúng tơi chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng
vi khuẩn quang hợp tía có khả năng cố định Nitơ phân tử ”
Trương Thị Trang

1

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
Đề tài được nghiên cứu theo hai nội dung chính:
• Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng cố định nitơ
phân tử phân lập được ở Việt Nam.
• Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn.

Trương Thị Trang

2

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trương Thị Trang

3

Lớp: K13-0605

Khố luận tốt nghiệp
I.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên:
Chu trình N là chu trình trong đó khơng khí là kho dự trữ đồng thời là
van bảo hiểm của hệ thống. Giữa chu trình và khơng khí có sự trao đổi thường
xuyên: N phân tử chuyển thành N liên kết qua các quá trình cố định N sinh
học, do tác dụng của điện và cố định quang học.
Phản nitrate là quá trình ngược lại. Nguồn nitơ để tổng hợp các amino
acid và protein được lấy từ đất và nước bởi cây ở dạng nitrate. Cơ thể thực vật
được động vật ăn và chúng dùng các amino acid từ các protein của thực vật để
tổng hợp nên amino acid, protein, nucleic acid và các hợp chất nitơ khác của
riêng mình. Những vi khuẩn hoại sinh sẽ biến đổi những hợp chất nitơ đó
thành amoniac khi các động vật hoặc thực vật chết. Các động vật cũng thải ra
nhiều loại chất thải chứa ure, acid uric, creatinin và amoniac. Các vi khuẩn
phân hủy biến đổi acid uric và ure thành amoniac. Những amoniac này được
biến đổi bởi các vi khuẩn nitrite sang nitrite và tiếp tục biến đổi thành nitrate
nhờ các vi khuẩn nitrate. Một số các amoniac được biến đổi sang nitơ khơng
khí bởi các thành phần vi khuẩn khử nitrate. Nitơ khơng khí đến lượt mình có
thể được biến đổi sang amino acid và các hợp chất nitơ hữu cơ khác bởi một
số vi khuẩn lam, vi khuẩn quang hợp và vi khuẩn đất.
Một số loài vi khuẩn khác thuộc giống Rhizobium mặc dù tự mình
khơng cố định được nitơ khơng khí, nhưng lại có khả năng làm được việc này
nhờ hợp tác với tế bào của rễ cây họ đậu hay một vài loại rau củ khác. Vi
khuẩn xâm nhập vào rễ cây và kích thích cây họ đậu hình thành các nốt sần ở
rễ. Sự hợp tác của tế bào cây họ đậu và tế bào vi khuẩn để có khả năng cố
định đạm là một q trình khơng thể thực hiện được một mình. Vì vậy, các
cây họ đậu thường được trồng để phục hồi độ phì nhiêu của đất sau khi loài
cây khác được trồng ở đó nhiều vụ. Nitơ khí quyển cũng cịn được cố định
nhờ năng lượng điện hoặc sấm sét tự nhiên. Mặc dù, nitơ chiếm 4/5 khí của
khí quyển, nhưng chỉ có một vài loại thực vật có khả năng dùng được nitơ

Trương Thị Trang

4

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
phân tử. Khi các cơ thể của vi khuẩn cố định nitơ chết, các amino acid được
đồng hóa thành amoniac và sau đó được biến đổi sang nitrite và nitrate nhờ
các vi khuẩn nitrite và nitrate hóa.

Hình 1. Chu trình N trong tự nhiên
I.2. Quá trình cố định Nitơ.
I.2.1. Quá trình cố định nitơ trong tự nhiên:
Sự sống của vạn vật trên trái đất đều có nhu cầu đối với các hợp chất nitơ
để tạo ra các hợp chất cơ bản như protein và các axit nucleic. Trong khơng khí,
nitơ phân tử chiếm 79% nhưng chỉ một số loài vi sinh vật sử dụng được nitơ ở
dạng này. Nitơ phân tử có thể chuyển thành các hợp chất nitơ vơ cơ khác dưới
các hình thức: cố định trong khơng khí, tổng hợp thành các hợp chất nitơ nhờ
phương pháp hóa học dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất khơng khí cao (nhiệt độ
khoảng 500oC, áp suất khơng khí khoảng 200atm) và thơng qua q trình cố
định nitơ sinh học. Quá trình cố định nitơ sinh học được thực hiện chủ yếu nhờ
một số loài vi khuẩn. Để tiến hành quá trình cố định nitơ sinh học địi hỏi vi sinh
vật phải có một phức hợp các enzyme tham gia và nhu cầu sử dụng ATP tương
đối lớn.

Trương Thị Trang

5

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
I.2.2. Các nhóm vi sinh vật có khả năng cố định N2
I.2.2.1. Vi khuẩn nốt sần:
- Vi khuẩn nốt sần: thuộc loại hiếu khí khơng tạo bào tử có thể đồng hóa
nhiều nguồn cacbon khác nhau, pH thích hợp: 6,5-9,5, nhiệt độ phát triển
thích hợp: 24-26oC. Phân loại vi khuẩn nốt sần có nhiều ý kiến chưa thống
nhất:
+ Theo Todorovic chia vi khuẩn nốt sần ra 2 lồi: Rhizibiomonas
leguminosarum và Rhizobacterum leguminosrum
+ Theo Bergli thì chi Rhizobium bao gồm 6 loài vi khuẩn nốt sần:
R.leguminosarum, R.phaseoli, R.Trifolii, R.lupini, R.sapnicum, R.meliloti.
- Cơ chế tạo thành nốt sần:
Vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua lông hút đôi
khi thông qua vết thương. Một số cây họ đậu tiết ra xung quanh rễ những chất
có tác dụng kích thích những vi khuẩn tương ứng với mình phát triển mạnh
hơn (để có thể nhiễm vào thực vật, vi khuẩn phải đạt mật độ tế bào 104/gam
đất.
Vi khuẩn sau khi tiếp xúc với lông hút của thực vật, tạo thành dãy xâm
nhập đi dần vào bên trong của rễ và xâm nhập vào nhu mơ kích thích tế bào
thực vật bị phân chia nhanh chóng thành tế bào mới. Vi khuẩn đi vào tế bào
chất và phân chia chuyển thành thể giả khuẩn. Giả khuẩn không phân chia
được nhưng phát triển mạnh tăng nhiều ribosom, nốt sần xuất hiện.
Nốt sần thích hợp ở các điều kiện: Độ ẩm của đất: 60 - 70%; Độ thống
khí: càng nhiều càng tốt, điều này cho thấy rễ càng sâu lượng nốt sần càng
kém; pH thích hợp từ 4,6-8,0; Phân đạm thường ức chế tạo thành nốt sần;

Phân lân, kali có tác dụng tích cực; Phân canxi, magiê và các muối khác cũng
có tác dụng tốt đến q trình tạo thành nốt sần; Chất dinh dưỡng cacbon như
Trương Thị Trang

6

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
nước đường, rơm, rạ làm tăng khả năng xâm nhập và khả năng cố định nitơ,
ngược lại những vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh sẽ gây ức chế vi
khuẩn Rhizobium.
I.2.2.2. Vi khuẩn hiếu khí sống tự do thuộc chi Azotobacter và Beiferinckia
- Azotobacter: chủ yếu có 4 lồi:
+ Azotobacter chroocuccum: kích thước 3,1x2,0µ khi cịn non có khả
năng di động, khi già có sắc tố màu nâu đến màu đỏ, không khuyếch tán vào
môi trường.
+ Azotobacter beijerincki: kích thước 3,1x2,0µ khơng di động, khi già có
sắc tố màu vàng đến màu nâu sáng, khơng khuyếch tán vào mơi trường.
+ Azotobacter vinelandi: kích thước 3,4x1,5µ có khả năng di động, sắc tố
màu vàng lục đến huỳnh quang, khuyếch tán vào mơi trường.
+ Azotobacter agilis: kích thước 3,3x2,8µ có khả năng di động, sắc tố
màu lục, huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường.
Azotobacter làm tăng cường nguồn thức ăn cung cấp cho cây trồng, kích
thích khả năng tăng trưởng, nâng cao tỷ lệ nảy mầm và độ phát triển của mầm
vì nó tiết ra mơi trường thiamin, acid nicotinic, acid pantotenic, acid
piridoxin, biotin,… và có khả năng tiết ra một số chất chống nấm.
- Beiferinckia: là lồi hiếu khí, cố định nitơ giống Azotobacter nhưng có
khả năng chịu chua cao hơn. Gồm có 3 nhóm:

+ B.indica: kích thước tế bào 0,5-1,5 x 1,7-3,0µ có khả năng di động
hoặc khơng di động, khi già có sắc tố màu đỏ đến màu nâu, có tốc độ cố định
nitơ nhanh
+ B.fluminensis: kích thước tế bào 1,1-1,5 x 3,0-3,5µ có khả năng di
động, sắc tố màu nâu tối, tốc độ cố định nitơ chậm.
Trương Thị Trang

7

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
+ B.derxii: kích thước tế bào 1,5-2,0 x 3,5-4,5µ khơng di động, sắc tố
màu lục huỳnh quang.
I.2.2.3. Vi khuẩn kỵ khí sống tự do thuộc Clostridium:
Lồi được nghiên cứu nhiều nhất là Clostridium pasteriaum, ngồi ra
cịn có các lồi Clostridium khác như C.butylicum, C. Bacterinkin, C.
ceticum,..
Kích thước tế bào 2,5-7,5 x 0,7-1,3µ có thể riêng rẽ hoặc xếp đơi hoặc
thành chuỗi ngắn. Có khả năng di động khi cịn non, có khả năng tạo bào tử,
bào tử có kích thước lớn hơn tế bào và có thể nằm ở đầu hoặc ở giữa tế bào.
I.2.2.4. Vi khuẩn lam sống tự do và vi khuẩn lam cộng sinh trong bèo hoa
dâu:
Hiện nay đã phát hiện nhiều loài vi khuẩn lam sống tự do trong đất và
trong nước có khả năng cố định nitơ. Có một số lồi sống cộng sinh với thực
vật, trong đó đáng chú ý nhất là vi khuẩn cộng sinh trong bèo hoa dâu (vi
khuẩn này có tên là Anabaena azollae). Đa số các lồi vi khuẩn lam phát triển
tốt trong mơi trường trung tính hoặc kiềm, hiếu khí, thích hợp ở nhiệt độ 2830oC, cần khí CO2.
I.2.3. Cơ chế của q trình cố định nitơ phân tử:

Quá trình cố định nitơ phân tử theo 2 hướng cơ bản: con đường khử và
con đường oxy hoá.
Con đường khử theo chuỗi biến hoá:
N2 → HN=NH → H2N-NH2 → NH3 → NH4OH
Con đường oxy hoá:
N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH

Trương Thị Trang

8

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
Q trình cố định nitơ phân tử bị ức chế khi có mặt oxy nên hiệu suất cố
định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn những vi sinh
vật hiếu khí.
I.3 Khả năng cố định nitơ phân tử ở vi khuẩn tía quang hợp.
I.3.1 Giới thiệu vi khuẩn tía quang hợp:
Vi khuẩn quang hợp tía (VKTQH) là sinh vật chưa có nhân thật
(prokaryote) và thuộc nhóm proteobacteria. Trong q trình quang hợp, chúng
không sử dụng nước làm nguồn cho điện tử như các đối tượng quang dưỡng
khác mà sử dụng các hợp chất khác nhau từ bên ngoài như lưu huỳnh và các
hợp chất của lưu huỳnh, phân tử hydro (H 2) hoặc các hợp chất hữu cơ đơn
giản, do đó khơng thải oxy.
Nhóm VKTQH có khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí theo kiểu
quang dị dưỡng với các nguồn cơ chất hữu cơ khác nhau hoặc sinh trưởng
theo kiểu quang tự dưỡng CO2 với phân tử hydro làm chất cho điện tử. Ở điều
kiện hiếu khí và vi hiếu khí, tối, nhiều lồi có thể sinh trưởng hóa dị dưỡng và

một vài lồi sinh trưởng hóa tự dưỡng. Một số loài rất nhạy cảm với oxy, một
số khác sinh trưởng tốt ở điều kiện hiếu khí, tối với áp suất oxy khí quyển.
VKTQH có các kiểu trao đổi chất rất linh hoạt, phụ thuộc vào điều kiện
của môi trường sống nên chúng phân bố trong tự nhiên rất rộng rãi. Có thể
tìm thấy chúng trong các điều kiện mơi trường sống khắc nghiệt như ở Nam
Cực hay suối nước nóng, suối lưu huỳnh. Sự điều hịa giữa các q trình trao
đổi chất để tạo năng lượng ở VKTQH được điều khiển bởi ánh sáng, oxy và
các chất cho điện tử.

I.3.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào của VKTQH.
Trương Thị Trang

9

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào gram âm, đơn bào và có các dạng
cầu, xoắn, gậy và phẩy. Có thể gặp chúng ở trạng thái chuỗi trong những điều
kiện mơi trường đặc biệt. Kích thước của tế bào thường từ 0,3 – 6µm. Đa số
các lồi đều sinh sản bằng nhân đơi, một số lồi có tế bào dinh dưỡng dạng
phân cực thường sinh sản bằng cách nảy chồi ( là đặc trưng của chi
Rhodopseudomonas ). Khi sinh trưởng trong điều kiện quang hợp, dịch huyền
phù tế bào thường có màu tía, đỏ, nâu vàng, nâu. Sự khác nhau về màu sắc
này do khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng khác nhau. Phổ hấp thụ
dịch tế bào nguyên của một số đại diện được thể hiện ở hình 2. [20].

Trương Thị Trang

10

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp

Hình 2: Phổ hấp thụ dịch huyền phù tế bào của một số đại diện vi khuẩn
quang hợp [20]

Trương Thị Trang

11

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
I.3.1.2 Đặc điểm sắc tố quang hợp của VKTQH.
Đặc trưng của nhóm vi khuẩn quang hợp này là chứa sắc tố quang hợp
loại bacteriochlorophyll (Bchl) và các dạng carotenoid khác nhau: .
Đa số các loài sinh trưởng và tổng hợp Bchl trong điều kiện kỵ khí khi
được chiếu sáng, một số lồi khác có thể tổng hợp một lượng rất nhỏ khi sinh
trưởng ở điều kiện tối, vi hiếu khí hoặc hiếu khí.
 Bacteriocholorophyll (Bchl) :

Sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp là bacteriochlorophyll
(Bchl). Hiện nay, bacteriochlorophyll của nhóm VKTQH được chia thành 2
nhóm a và b. Vùng cực đại của phổ hấp thụ dịch chiết trong ete hoặc dịch tế
bào nguyên của hai loại này được phân biệt ở bảng 1.

Bảng 1. So sánh cực trị hấp thụ của các dạng bacteriochlorophyll ở vi
khuẩn quang hợp [65].
Dạng

Cực đại hấp thụ (nm )

bacteriochlorophyll

Nhóm vi khuẩn

a
b

Vi khuẩn tía
Vi khuẩn tía

Chiết trong ete

Trong tế bào nguyên

770-775
790

830-890
1020-1030

 Caroteinoid :
Ngồi bacteriochlorophyll, tế bào VKTQH cịn chứa các carotenoid. Sự
phân biệt màu sắc của các chủng và loài trong tự nhiên là do sự khác nhau về
thành phần các carotenoid có trong tế bào (bảng 2). Về cấu trúc và cực đại

của phổ hấp thụ, carotenoid có thể được chia thành 4 nhóm theo cấu trúc phân
tử và cực đại hấp thụ của dịch huyền phù tế bào. Đặc điểm này được các nhà
khoa học sử dụng làm một trong các yếu tố để phân loại vi khuẩn quang hợp
trong khóa phân loại vi khuẩn của Bergey [20].

Bảng 2: Các nhóm carotenoid có mặt trong tế bào vi khuẩn quang hợp.
Trương Thị Trang

12

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
Nhóm
1

Họ carotenoid
Spirilloxanthin thường

Các carotenoid chính
Lycopen, rhodopin, spirilloxanthin

2

Spirilloxanthin thay thế

Chloroxanthin,

Okenone

Rhodopinal

(spiriloxanthin)
Okenon
Lycopen,
lycopenal,

3
4

sphaeroiden,

sphaeroidenon,

lycopenol,

rhodopin,

rhodopinal, rhodopinol, (spirilloxanthin)

I.3.1.3 Phân loại VKTQH
Năm 1907, Molisch là người đầu tiên phát hiện ra một số vi khuẩn có
sắc tố màu đỏ và có khả năng quang hợp nên ơng gọi nhóm vi khuẩn này là
Rhodobacteria (hay chính là vi khuẩn tía quang hợp ). VKTQH bao gồm hai
họ Thiorhodanceae ( là những vi khuẩn tía có khả năng hình thành giọt lưu
huỳnh “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaeae (là những vi khuẩn tía khơng
có khả năng hình thành giọt lưu huỳnh “S” trong tế bào) [1]. Đây là đặc điểm
quan trọng về hình thái để phân biệt hai nhóm này.
• Vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh :
Nhóm vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các thủy vực nước

ngọt hoặc mặn có chứa sulfua với hàm lượng cao (40-100mg/l). Ngồi ra, có
thể tìm thấy đại diện của nhóm này ở các suối nước nóng và các thủy vực
kiềm hóa[49].
Hình ảnh tế bào một số lồi đại diện của nhóm này mơ tả ở hình 3.
A

B

C

Hình 3. Dạng tế bào của một số đại diện vi khuẩn tía quang hợp lưu
huỳnh. A. Chromatium okeni; B. Thiospirillum ; C. Thiopedia rosea
• Vi khuẩn tía quang hợp khơng lưu huỳnh:

Trương Thị Trang

13

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
Các vi khuẩn nhóm này được phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Có thể gặp
chúng trong các ao hồ tù đọng, các thủy vực chứa nước thải, các vùng đầm
nước lợ hay mặn, cũng có thể tìm thấy chúng trong đất bùn hay đất ruộng.
Tuy nhiên, chúng ưa thích các thủy vực chứa nước ngọt, lợ hay mặn với hàm
lượng chất hữu cơ khá cao và hàm lượng oxy hịa tan thấp.
Hình ảnh tế bào của một số chủng đại diện

A

B

C

D

E

F

Hình 4. Dạng tế bào của một số đại diện chủng VKTQH không lưu
huỳnh. A. Rhodospirillum rubrum; B. Rhodospirillum tenue; C. Rhodobacter
sphaeroides;D. Rhodocyclus perpureus; E. Rhodoacidophila; F.
Rhodomicrobium vannielli
I.3.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng cacbon:

Trương Thị Trang

14

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
 Cố định CO2:
Giống như các đối tượng quang dưỡng khác, VKTQH lưu huỳnh và
không lưu huỳnh cũng có khả năng cố định CO2 theo chu trình Calvin [4, 61].
Một số lồi VKTQH khơng lưu huỳnh như ở lồi R. rubrum và R.
genlationsus cịn có khả năng sử dụng CO làm nguồn cơ chất cho sinh trưởng.

Ban đầu, CO bị oxy hóa thành CO 2 nhờ CO – dehydrogenase, sau đó CO 2
được tế bào đồng hóa trở lại theo chu trình Calvin. Ngồi khả năng cố định
CO2, VKTQH khơng lưu huỳnh cịn có khả năng đồng hóa nhiều loại hợp chất
hữu cơ có sẵn trong mơi trường.
 Khả năng sử dụng các nguồn C hữu cơ :
Nhóm VKTQH lưu huỳnh sinh trưởng chủ yếu bằng quang hợp tự
dưỡng, sử dụng CO2 làm nguồn cacbon và các hợp chất khử của lưu huỳnh
hoặc H2 làm chất cho điện tử. Khả năng đồng hóa các chất hữu cơ của chủng
kém hơn so với lồi VKTQH khơng lưu huỳnh. Acetate và một số hợp chất
hữu cơ được các loài vi khuẩn nhóm này sử dụng như nguồn cacbon bổ sung
và được đồng hóa theo chu trình TCA ( Tricacboxylic Acid) nhưng khơng
khép kín hoặc chu trình glyoxylate hoặc qua con đường đồng phân [12]
Nhóm VKTQH khơng lưu huỳnh có khả năng sử dụng nhiều hợp chất
hữu cơ làm nguồn cacbon cho sinh trưởng. Chúng có sự điều chỉnh các cơ chế
trao đổi chất hữu cơ rất linh hoạt tùy thuộc các điều kiện sinh trưởng khác
nhau. Hầu hết, các lồi thuộc VKTQH khơng lưu huỳnh đều có khả năng sinh
trưởng ở ngồi sáng trên mơi trường chứa hợp chất 2C như acetate [40],
pyruvate [53]… và hợp chất 3C như glycerol, acetone. VKTQH không lưu
huỳnh sinh trưởng nhanh hơn và mật độ cao hơn khi sinh trưởng trong môi
trường chứa các cơ chất 4C với hai nhóm carboxyl so với khi sinh trưởng trên
các nguồn cơ chất khác.

Trương Thị Trang

15

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp

Các con đường trao đổi chất trung tâm ở nhóm VKTQH khơng lưu
huỳnh được mơ tả ở hình 5.

Hình 5. Các con đường trao đổi chất trung tâm ở vi khuẩn tía quang hợp
khơng lưu huỳnh [Tabita , 1995]
Ngồi ra, một số lồi VKTQH khơng lưu huỳnh có khả năng sinh
trưởng trên mơi trường có chứa hợp chất hữu cơ 1C như lồi R. palustris có
khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa formate khi được chiếu sáng, lồi
Rhodospirillum gelatinosa và R. acidophila có khả năng sử dụng methanol làm

Trương Thị Trang

16

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
nguồn carbon khi sinh trưởng ngồi ánh sáng nhưng cần có CO 2 làm chất
nhận điện tử.
I.3.2 Khả năng cố định nitơ phân tử của VKTHQ .
I.3.2.1 Khả năng sử dụng các nguồn nitơ liên kết.
Nguồn nitơ ưa thích nhất đối với hầu hết các VKTQH là amơn. Rất
nhiều lồi có khả năng sử dụng các amino acid làm nguồn nitơ cho sinh
trưởng. Khả năng đồng hóa nitrate của VKTQH rất hạn chế, một số loài như
R.sphaeroides, R.capsulatus có thể sinh trưởng được trong điều kiện mơi
trường có chứa nitrate nhưng nguồn nitơ mà chúng sử dụng trực tiếp để xây
dựng tế bào là nitơ phân tử được sinh ra trong q trình khử nitrate dị hóa
[9,41]. Hệ thống enzyme tham gia q trình nitrate dị hóa ở các vi khuẩn này
là các protein nằm ở màng ngồi tế bào và hoạt tính của chúng bị ức chế bởi

ánh sáng và oxy.
II.3.2.2. Khả năng cố định nitơ phân tử ở Vi khuẩn tía quang hợp
Gest và Kamen là những người đầu tiên phát hiện khả năng cố định
nitơ phân tử ở vi khuẩn quang hợp khi tiến hành nghiên cứu quá trình quang
thải H2 của Rhodospirillum rubrum [10]. Những nghiên cứu sau đó đã khẳng
định rằng khả năng cố định nitơ phân tử khơng chỉ có ở R. rubrum mà cịn có
ở những lồi vi khuẩn quang hợp khác với mức độ hoạt tính nitrogenase khác
nhau (Bảng 3). Hoạt tính cố định nitơ phân tử được xác định thơng qua hoạt
tính khử acetylen thành etylen [34].

Trương Thị Trang

17

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp

Bảng 3. Hoạt tính khử acetylen ở một số lồi vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh
Hoạt tính nitrogenaza
Lồi

(nmol C2H4 / mg trọng lượng khơ/h)

Rb. sphaeroides

2755

Rb. capsulatus

4900

Rps. palustris

700

Rps. sulfoviridis

520

Rps. viridis

2510

Rps. blastica

1230

Rps. acidophila

880

Rd. globiformis

515

Rc. gelatinosus

3490

R. rubrum

1175

R. tenue

1400

R. fulvum

930

R. molischianum

1030

R. photometricum

755

R. salexigens

630

Rm. vannielii

1570

Chú thích:

Rb. : Rhodobacter ; Rps. : Rhodopseudomonas ; R. : Rhodospirillum ;
Rd. : Rhodopila ; Rc. : Rhodocyclus ;Rm. : Rhodomicrobium.

Cũng giống như các vi sinh vật cố định nitơ khác, về cấu trúc thành
phần các amino acid và vật liệu gen mã hóa cho protein, enzyme nitrogenase
ở vi khuẩn quang hợp bao gồm hai tiểu phần : Protein- Mo ( dinitrogenase )
và Protein-Fe (dinitrogenase – Rc2 ). Để nitrogenase hoạt động đòi hỏi phải

Trương Thị Trang

18

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
có đầy đủ các thành phần bao gồm hai protein của nitrogenase, năng lượng
khử (ATP), chất khử có thế năng thấp và nguồn điện tử [60, 72].
Phức hợp enzyme nitrogenase xúc tác phản ứng khử một phân tử nitơ
tạo thành amơn theo phương trình phản ứng sau [5, 6]:
N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP

2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Các vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh được coi là các cá thể có khả năng cố
định nitơ với tốc độ cao nhất, trong số đó đáng kể đến là các chủng thuộc các
lồi Rhodobacter capsulatus, Rb. Sphaeroides, Rhodopseudomonas viridis,
Rhodocyclus gelatinosus và Rb. Blastica. Các lồi thuộc chi Rhodospirillum có
hoạt tính cố định nitơ phân tử ở mức thấp hơn [45, 46] Đa số các VKTQH
khơng lưu huỳnh có thể sinh trưởng với nitơ phân tử làm nguồn N duy nhất

(diazotrophic ) và tốc độ sinh trưởng mạnh nhất được ghi nhận ở điều kiện
quang dị dưỡng ( photoheterotrophic ) [46]. Tuy nhiên, một số ít lồi cịn có
khả năng cố định nitơ phân tử khi sinh trưởng quang tự dưỡng
(photoautotrophic) với các chất cho điện tử quang hợp là H 2, các hợp chất khử
của lưu huỳnh hoặc một số nguồn vô cơ khác [42]. Khi nghiên cứu về khả
năng sinh trưởng của vi khuẩn quang hợp ở điều kiện tối (kỵ khí cũng như
hiếu khí ), một số nhà khoa học đã giả thiết rằng có mối liên quan chặt chẽ
giữa quang hợp và cố định nitơ ở các nhóm này [43,47,82]. Năm 1979,
Madigan và cs [44] đã ghi nhận được hoạt tính nitrogenase của Rhodobacter
capsulatus, khi sinh trưởng ở điều kiện kỵ khí trong tối với mức độ thấp.
Cũng như các đối tượng cố định nitơ khác, oxy không chỉ gây bất hoạt
nitorgenase ở VKQH mà còn là tác nhân gây ức chế sự tổng hợp enzyme này
[18, 4]. Trong quá trình trao đổi chất theo kiểu hơ hấp hiếu khí, VKQH cần
oxy để sản xuất ATP nhưng oxy lại có tác dụng phá hủy cả hai tiểu phần
protein và gây bất hoạt nitrogenase [55]. Mức độ ảnh hưởng của oxy đối với
enzyme này lại tùy thuộc vào khả năng hô hấp hiếu khí của từng lồi [57], do
đó người ta vẫn có thể quan sát được sự cố định nitơ phân tử của một số
Trương Thị Trang

19

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
chủng trong điều kiện vi hiếu khí hay hiếu khí [48, 7, 58]. Nitrogenase trong
dịch chiết tế bào loài Rb. capsulatus bị ức chế hoàn toàn khi nồng độ của oxy
vượt quá 40% trong pha khí [48].
Hoạt tính nitrogenase của vi khuẩn quang hợp được tăng cường khi có
mặt carbonate [54], alcohol, bicarbonate hoặc bất kỳ một nguồn CO 2 nào khác

mà chúng có thể sử dụng được [23]. Hydro phân tử có thể được sử dụng làm
nguồn cho điện tử bổ sung trong quá trình cố định nitơ nhưng khi nồng độ
quá cao lại trở thành tác nhân gây ức chế quá trình này [7, 81, 99].
Khi các tế bào của VKQH sinh trưởng trong điều kiện có amơn,
nitrogenase bị bất hoạt rất nhanh nhưng có thể được phục hồi khi mơi trường
ni chỉ cịn nitơ phân tử là nguồn N duy nhất. Hiện tượng này được gọi hiệu
ứng “ NH4 switch - off ” và quan sát được ở rất nhiều lồi thuộc nhóm vi
khuẩn tía khơng lưu huỳnh và hai lồi vi khuẩn xanh Chlorobium limicola và
thiosulfatophilum [69, 16, 21, 71, 19, 24]. Hiệu ứng này xảy ra tùy thuộc vào
tuổi của giống cấy [2, 67, 72], các điều kiện cho sinh trưởng quang hợp như
cường độ chiếu sáng [73], nguồn C [70] và đặc biệt là nguồn N [2, 67].
Người ta thấy rằng, sự ức chế hoạt tính nitrogenase (switch - off) là hậu
quả của quá trình biến đổi dẫn đến sự bất hoạt của tiểu phần dinitrogenase
reductase (Rc2) - protein Fe của nitrogenase [22, 23, 14, 37, 38, 11, 54].
Những nghiên cứu về nitrogenase ở Rb. capsulatus cho thấy sự bất hoạt này là
do một phân tử ADP – ribose đã liên kết với protein Rc2 tại vị trí đặc hiệu
arginine 101 nhờ hoạt động của enzyme Dinitrogenase Reductase ADP –
Riboryl Transferaza (DRAT ) [ 54, 36]. Phản ứng này phụ thuộc vào NAD và
MgADP, thường xảy ra khi vi khuẩn không được chiếu sáng hay có mặt một
nguồn nitơ liên kết nào đó [35]. Khi giống cấy được chiếu sáng trở lại hay các
nguồn nitơ liên kết bị cạn kiệt, ditrogenase reductase có thể được hoạt hóa
bằng cách loại bỏ nhóm ADP- ribose nhờ một phản ứng thủy phân với sự
tham gia của enzyme Ditrogenase Reductase
Trương Thị Trang

20

ADP – ribose – N Lớp: K13-0605

Khoá luận tốt nghiệp
glycohydrolase ( DRAG) [56,54]. Phản ứng này phụ thuộc vào MgADP và
Mn++ [24,39]. Mơ hình kiểu điều hịa riboryl hóa Rc2 thuận nghịch của
nitrogenase ở Rhodospirillum rubrum đã được Ludden và Robert [39] mơ tả
như sau:

Hình 6. Kiểu điều hồ hoạt tính thuận nghịch ADP-riboryl hố của
dinitrogenase reductase ở R. rubrum[39].
Ngồi kiểu điều hồ riboryl hố Rc2 thuận nghịch như trên, người ta
cịn cho rằng có một số cơ chế ức chế nitrogenase khác như ức chế sự vận
chuyển điện tử đến nitrogenase [13] hay sự thay đổi tỷ lệ ATP/ADP trong tế
bào, hoặc thay đổi tỷ lệ C/N trong môi trường nuôi cấy [72].
I.3.3 Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn tía quang hợp trong thực tiễn
I.3.3.1 Ứng dụng của VKTQH trong xử lý nước thải
Việc lựa chọn các chủng VKTQH để xử lý những nguồn nước thải có
thành phần khác nhau đã được tiến hành. VKTQH có khả năng chuyển hóa
các hợp chất vơ cơ cũng như hữu cơ trong tự nhiên [29,30], do đó chúng có
thể tham gia vào chu trình chuyển hóa chất thải và đặc biệt ở q trình xử lý
kỵ khí [28]. Đối với nguồn nước thải chứa các hợp chất lưu huỳnh, các chủng
thuộc nhóm VKTQH lưu huỳnh được chú trọng vì ngồi khả năng sử dụng
Trương Thị Trang

21

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
các cơ chất hữu cơ làm nguồn C cho sinh trưởng giống như nhóm VKTQH
khơng lưu huỳnh, chúng cịn có khả năng loại bỏ các hợp chất của lưu huỳnh

với hiệu suất cao [50,51,3]. Do đó, khi làm sạch nguồn nước thải chứa hàm
lượng sulfur cao, người ta thường sử dụng hỗn hợp các chủng VKTQH lưu
huỳnh với các chủng VKTQH không lưu huỳnh để nâng cao hiệu suất xử lý
[27].
Các lồi VKTQH khơng lưu huỳnh thuộc các chi Rhodopseudomonas,
Rhodobacter và loài Rhodocyclus gelatinosus được sử dụng rộng rãi trong xử
lý nước thải. Tuy nhiên, xu hướng được lựa chọn là sử dụng một số chủng để
có thể phân hủy hầu hết các thành phần ô nhiễm có mặt trong nước thải
[68,3,52]. Việc sử dụng hỗn hợp của một số chủng giống trong quá trình xử lý
nước thải đã được đề cập đến rất nhiều trong những năm gần đây [64, 59].
Trong thực tế, người ta thường sử dụng các chủng thuộc hai loài Rhodobacter
sphaeroides và Rhodopseudomonas palustris để xử lý nhiều nguồn nước thải
có thành phần khác nhau. Ngồi mục đích loại bỏ các chất hữu cơ dễ phân
hủy sinh học, chúng cịn có thể sử dụng để loại bỏ các chất khó phân hủy sinh
học như : phenol, cresol, các hợp chất hữu cơ có chứa nhóm halogen hay các
hydrocacbon mạch dài [52,8,17]. Khi sử dụng các chủng vừa nêu với các
chủng thuộc loài VKTQH lưu huỳnh Chromatium vinosum cịn có thể loại bỏ
một số hợp chất vơ cơ có mặt trong nước thải như : H 2S, NO3-,… và do đó,
nâng cao hiệu suất xử lý [25,62].
I.3.3.2 Ứng dụng của VKTQH trong sản xuất phân bón sinh học
Việc sử dụng sinh khối của VKTQH để sản xuất phân bón sinh học có
rất nhiều ưu điểm như khả năng sinh trưởng với tốc độ rất nhanh, tốc độ cố
định nitơ cao, có khả năng sinh trưởng và cố định nitơ ngay cả trong tối …
Vì vậy, việc triển khai áp dụng dạng phân bón này trên đồng ruộng lúa
ở các nước trong khu vực Châu Á gặp nhiều thuận lợi vì đảm bảo các nhu cầu
về ánh sáng, nguồn cơ chất (hữu cơ hoặc vô cơ) và môi trường ngập nước,
Trương Thị Trang

22

Lớp: K13-0605


Khố luận tốt nghiệp
khơng có oxy, thuận lợi cho sự phát triển của VKTQH. Nhiều thực nghiệm
được triển khai có hiệu quả trên đồng ruộng tại các nước Ai Cập, Nhật Bản và
các nước Đông Nam Á như : Thái lan, Philippin [33]. Sử dụng dạng phân bón
này cịn có thể hạn chế bệnh thối rễ lúa do đất nhiễm sulfua vì các VKTQH có
khả năng oxy hóa hợp chất này tới sulffat.
Ngoài ra, người ta đã thử nghiệm thành công trên rất nhiều đối tượng
cây hoa màu, khoai tây [32] và các loại cây ăn quả [28]. Kết quả sử dụng
VKTQH làm phân bón cho các cây ăn quả như cam, chanh…cho thấy chúng
không chỉ làm tăng số lượng quả trên một cây mà còn làm gia tăng trọng
lượng quả, cũng như hàm lượng đường trong quả. Màu sắc của quả cũng trở
nên hấp dẫn hơn do sự gia tăng của hàm lượng sắc tố carotenoid [28]…. Mặt
khác, so với các loại phân bón hóa học thì phân bón sinh học chứa VKTQH
cịn có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các loại nấm gây bệnh cho các loại
cây ăn quả hoặc củ. Các amino acid như proline và uracil được tạo ra bởi
VKTQH lại có tác động đến năng suất và chất lượng khoai tây[15]. Hàm
lượng các vitamin B và C trong củ khoai tây được tưới dịch huyền phù có
chứa VKTQH cao hơn so với các cây đối chứng[26].
Quá trình sản xuất sinh khối vi khuẩn quang hợp với mục đích làm
phân bón vi sinh bằng cách tái sử dụng nước thải làm môi trường nuôi, vừa
giảm thiểu ô nhiễm môi trường vừa đem lại lợi ích về kinh tế và giảm chi phí
sản xuất [31].
Tóm lại : VKTQH có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: xử
lý nước thải, sinh khối sau khi xử lý cịn có thể tái sử dụng để sản xuất phân
bón sinh học và làm thức ăn trong chăn nuôi, làm nguyên liệu trong sản xuất
dược liệu quý để phục vụ đời sống con người.

Trương Thị Trang

23

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp

CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

Trương Thị Trang

24

Lớp: K13-0605


Khoá luận tốt nghiệp
II.1. Đối tượng nghiên cứu:
Nguồn giống lấy từ tập đoàn giống vi sinh vật quang dưỡng tại phịng
Quang sinh học - Viện cơng nghệ sinh học - Viện khoa học và Công nghệ
quốc gia Việt Nam.
II.2. Dụng cụ thí nghiệm:
II.2.1 Hóa chất:
Các hóa chất thơng thường để sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi
khuẩn được sản xuất từ Trung Quốc.
II.2.2 Dụng cụ , máy móc:

- Máy đo quang phổ Novospec
II( Anh )

- Lị vi sóng (Toshiba, Nhật Bản)
- Bình khí Nitơ (Nga )

- Cân phân tích Mettler tolendo
(Thụy sỹ )

- Tủ lạnh Sam Sung Nhật Bản
- Bóng đèn sợi đốt Rạng Đơng

- Nồi khử trùng ướt (Trung
Quốc)

40W
- Đĩa petri, túi nilon kín

- Tủ cấy vơ trùng NU-440-400E
( NUAR. Nhật)

- Đèn

cồn, que cấy bằng kim

loại

- Tủ sấy (TRUNG QUỐC

Trương Thị Trang

25

Lớp: K13-0605