NGHIÊN cứu PHÁT TRIỂN kỹ THUẬT THU NHẬN và TÁCH DÒNG TRỌN vẹn các PHÂN đoạn HA, NA và m của VIRUS cúm AH5N1

Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT THU NHẬN VÀ TÁCH DÒNG TRỌN VẸN
CÁC PHÂN ðOẠN HA, NA VÀ M CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
Nguyễn Nam Thắng1, Phạm Ngọc Khái1, ðinh Duy Kháng2, Lương Xuân Hiến1
1
2

Trường ðại học Y Thái Bình
Viện Công nghệ sinh học
TÓM TẮT
Các biến ñổi di truyền trên các phân ñoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 có thể làm thay ñổi các
ñặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc, ñộc lực và khả năng gây bệnh của virus. Nghiên
cứu này trình bày một phương pháp mới ñể khuếch ñại và tách dòng trọn vẹn các phân ñoạn HA, NA và M của
virus cúm A/H5N1. Mẫu RNA của virus cúm A/H5N1 ñược sử dụng ñể khuếch ñại trọn vẹn các phân ñoạn
HA, NA và M bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) hai bước. Kỹ thuật
ñược thực hiện với 3 cặp mồi ñặc hiệu ñược thiết kế trên vùng 3’UTR và 5’UTR không dịch mã (UTR untranslated region) của các phân ñoạn tương ứng. Sản phẩm khuếch ñại ñược ñiện di kiểm tra và tinh sạch từ
thạch agarose, sau ñó ñược gắn với vector pJET1.2/blunt ñể tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA của
chủng virus A/H5N1 nghiên cứu. Mười một mẫu bệnh phẩm virus A/H5N1 thu thập từ gia cầm và người ñược
tách RNA làm khuôn thử nghiệm ñể ñánh giá ñộ tin cậy của phương pháp. Sau khi tối ưu hóa, kỹ thuật RTPCR ñã ñược ứng dụng ñể khuếch ñại các phân ñoạn HA, NA và M từ 11 mẫu khuôn RNA của virus cúm
A/H5N1. Kết quả ñiện di cho thấy sản phẩm khuếch ñại của mỗi phân ñoạn của hệ gen là một băng ñơn nhất
có thể quan sát rõ ràng trên thạch agarose. Sau khi tinh sạch, sản phẩm RT-PCR ñược gắn vào vector
pJET1.2/blunt và chọn lọc tái tổ hợp. Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả các trình tự nucleotide ñã tách dòng
có ñộ tương ñồng cao với trình tự của phân ñoạn tương ứng của virus A/H5N1. Kỹ thuật khuếch ñại và tách
dòng trọn vẹn các phân ñoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm ñã ñược xây
dựng thành công và có thể ứng dụng trong các nghiên cứu về virus cúm A/H5N1 ở mức ñộ phân tử.
Từ khóa: Cúm gia cầm, A/H5N1, HA, NA, M, RT-PCR, tách dòng

ðẶT VẤN ðỀ
Virus cúm A có hệ gen bao gồm 8 phân ñoạn
RNA ñơn âm, mã hóa 11 protein của virus. Do có

hệ gen là RNA và tính chất phân ñoạn của hệ gen,
nên virus cúm A nói chung và A/H5N1 nói riêng
có tần suất ñột biến cao và khả năng biến ñổi
kháng nguyên nhanh chóng (Drake, 1993). Hiện
tượng biến ñổi kháng nguyên ở virus cúm A/H5N1
là hệ quả của các quá trình biến ñổi ñột biến ñiểm,
tái tổ hợp di truyền và sự trao ñổi vật liệu giữa các
phân typ virus cúm A/H5N1 với nhau (Baigent,
McCauley, 2001; Bouvier, Palese, 2008). Sự biến
ñổi di truyền nhanh chóng của virus cúm A/H5N1
ñã gây khó khăn cho việc chẩn ñoán phát hiện
virus, lựa chọn chủng virus ñể sản xuất vaccine
cũng như công tác phòng chống, kiểm soát bệnh
cúm (Chen et al., 2006; Smith et al., 2006).
Trong số 8 phân ñoạn của virus cúm A nói
chung, các phân ñoạn HA, NA và M chịu trách
nhiệm mã hóa cho các protein mang tính kháng
nguyên của virus. Các kháng nguyên này chính là

các ñích của kháng thể tham gia ñáp ứng miễn dịch
ñối với virus cúm A và cũng là cơ sở ñể nghiên cứu
các vaccine phòng cúm A cho người và ñộng vật
(Suarez, Schultz-Cherry, 2000; Wu et al., 2008).
Các biến ñổi di truyền trên các phân ñoạn của hệ
gen này (ñặc biệt là HA và NA) có thể làm thay ñổi
các ñặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm,
tính kháng thuốc, ñộc lực và khả năng gây bệnh của
virus (Bright et al., 2006; Neumann, Kawaoka,
2006; Yamada et al., 2006). Việc thu nhận từng
phân ñoạn, tách dòng, lưu giữ nguồn gen của các

chủng cúm A/H5N1 gây bệnh ñể làm nguồn nguyên
liệu kiến tạo vaccine thế hệ mới là cần thiết. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp
khuếch ñại và tách dòng trọn vẹn các phân ñoạn
HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 từ một số
chủng phân lập tại Việt Nam, nhằm tạo ra các
plasmid tái tổ hợp có chứa trình tự gen HA, NA và
M. Các plasmid này có thể sử dụng ñể giải trình tự
nhằm tìm hiểu các biến ñổi di truyền của virus cúm
A/H5N1 và lưu giữ bảo quản lâu dài ñể sử dụng
trong các nghiên cứu khác.
425


Nguyễn Nam Thắng et al.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào khả
biến E. coli

Thiết kế mồi

DNA tinh sạch từ thạch agarose ñược sử dụng ñể
tạo plasmid tái tổ hợp với bộ sinh phẩm CloneJET PCR
Cloning kit (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất, mô tả vắn tắt với các bước như sau:

Sử dụng trình tự nucleotide của các phân ñoạn HA
(H5), NA (N1) và M của virus cúm A/H5N1 ñã ñược
công bố trên GenBank và so sánh các trình tự bằng

phần mềm Clustal X 2.0. Sau khi phân tích bằng phần
mềm BioEdit (version 7.0.9.0) và FastPCR (version
5.4.19), các cặp mồi ñược thiết kế trên vùng 3’ UTR và
vùng 5’ UTR của phân ñoạn HA (H5), NA (N1) và M.

1. Sử dụng tuýp 0,5 ml và chuẩn bị các thành phần
phản ứng như sau: 50 - 100 ng DNA, 10 µl 2X
reaction buffer, 1 µl DNA blunting enzyme và bổ
sung nước siêu sạch cho ñủ 18 µl, vortex và ly tâm
nhanh từ 3 - 5 giây.

Khuôn RNA của virus cúm A/H5N1

2. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 70oC trong 5 phút.

ðể xây dựng quy trình, chúng tôi sử dụng khuôn
RNA của virus cúm A/H5N1 ñược lưu giữ tại Viện
Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam. Sau khi hoàn thiện, quy trình khuếch ñại
trọn vẹn phân ñoạn HA, NA và M của virus A/H5N1
ñược thử nghiệm với 11 mẫu khuôn RNA tách từ
bệnh phẩm có nguồn gốc khác nhau (5 mẫu từ vịt, 4
mẫu từ gà và 2 mẫu từ người). Các mẫu RNA của
virus A/H5N1 ở gia cầm do Trung tâm Chẩn ñoán
Thú y Trung ương cung cấp và các mẫu RNA H5N1
ở người do Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ương cung cấp.

3. Bổ sung 1 µl pJET1.2/blunt cloning vector (50
ng/µl) và 1 µl T4 DNA ligase.

Tổng hợp cDNA (complementary DNA)
Năm µl RNA tách chiết ñược sử dụng làm khuôn
ñể thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với bộ sinh
phẩm RevertAid™ H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất. Phản ứng sao mã ngược ñược thực hiện với mồi
ñặc hiệu Uni12: 5’- AGCAAAAGCAGG -3’
(Hoffmann et al., 2001).
Phản ứng khuếch ñại phân ñoạn HA, NA và M và
kiểm tra
Thực hiện ñồng thời với hai hệ thống: PCR Master
mix 2X (Fermentas) và TripleMaster PCR System
(Eppendorf). Phản ứng ñược thực hiện trong ống 0,2 ml
với tổng thể tích là 50 µl và sử dụng máy luân nhiệt
Mastercycler gradient (Eppendorf). Sau khi xác ñịnh
ñược các ñiều kiện tối ưu, phản ứng khuếch ñại phân
ñoạn HA, NA và M của virus A/H5N1 ñược thực hiện
với 11 mẫu cDNA của các chủng virus cúm A/H5N1
thu thập từ các nguồn khác nhau.
Sản phẩm PCR từ khuôn cDNA của các chủng
ñược ñiện di trên thạch agarose 0,8%, sau ñó ñược phân
lập và tinh sạch từ thạch với bộ sinh phẩm QIAquick
gel extraction kit (Qiagen).
426

4. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút. Sử
dụng 2,5 µl hỗn hợp phản ứng ñể biến nạp vào tế bào
E. coli TOP10 theo phương pháp hóa học và nuôi
cấy trên thạch LB (Luria-Bertani Broth), qua ñêm.

Lựa chọn khuẩn lạc, nuôi cấy và tách chiết plasmid
Tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony
PCR), với cặp mồi pJET1.2 forward và pJET1.2
reverse ñể lựa chọn các khuẩn lạc có plasmid tái tổ hợp
chứa trình tự phân ñoạn HA, NA và M. Dùng ñầu côn
lấy một khuẩn lạc riêng rẽ và hòa tan trong 20 µl hỗn
hợp phản ứng gồm: 2 µl 10X HighFidelity buffer, 0,4
µl dNTP (10 mM mỗi loại), 0,2 µl TripleMaster
polymerase mix, 4 pmol mồi pJET1.2 forward và
reverse mỗi loại. Chương trình nhiệt của phản ứng
colony PCR giống như phản ứng khuếch ñại gen. Các
khuẩn lạc dương tính ñược nuôi cấy trong 3 ml môi
trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (100 µg/ml) qua
ñêm, sau ñó plasmid ñược tách chiết với bộ sinh phẩm
GenJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas).
Giải trình tự và phân tích kết quả
ðể khẳng ñịnh plasmid tái tổ hợp có chứa trình
tự gen HA, NA và M của virus H5N1, DNA tái tổ
hợp ñược giải trình tự với bộ sinh phẩm CEQ DTCS
Quick Start Kit và ñiện di mao quản trên hệ thống
CEQ 8000 (Beckman Coulter) tại Phòng Thí nghiệm
sinh học phân tử, Trường ðại học Y Thái Bình. Sau
khi phân tích bằng phần mềm CEQ 8000 Genetic
Analysis System, các trình tự nucleotide ñược so
sánh với các trình tự gen có sẵn trên GenBank bằng
chương trình BLAST.
KẾT QUẢ
Thiết kế mồi
Sau khi phân tích các trình tự phân ñoạn H5, N1

Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011
và M của virus cúm A ñã công bố trên GenBank bằng
các phần mềm chuyên dụng, 3 cặp mồi ñã ñược thiết
kế trên vùng 3’ UTR và vùng 5’ UTR ñể có thể
khuếch ñại trọn vẹn 3 phân ñoạn tương ứng nói trên.
Trình tự các mồi ñược trình bày ở bảng 1.
Phản ứng PCR
Phản ứng PCR khuếch ñại các phân ñoạn HA,
NA và M của virus H5N1 ñược thử nghiệm ñồng
thời với Mastermix 2X và TripleMaster PCR
System. Kết quả thử nghiệm cho thấy hiệu quả
khuếch ñại của TripleMaster PCR System tốt hơn
so với PCR Mastermix 2X. Do ñó TripleMaster
PCR System ñược lựa chọn ñể khuếch ñại phân

ñoạn HA, NA và M của virus H5N1 từ các mẫu
bệnh phẩm.
Sau khi thử nghiệm trong các ñiều kiện khác
nhau, thành phần phản ứng và chương trình nhiệt tối
ưu ñã ñược xác ñịnh. Thành phần phản ứng bao
gồm: 5 µl 10X HighFidelity buffer, 1 µl 10 mM
dNTP (deoxyribonucleotide triphosphates), 0,5 µl
TripleMaster Polymerase mix, mồi xuôi và mồi
ngược mỗi loại 30 pmol, 4 µl cDNA và bổ sung
nước siêu sạch cho ñủ thể tích là 50 µl. Chương trình
nhiệt gồm các bước: biến tính ban ñầu ở 94oC trong
2 phút; tiếp theo là 40 chu kỳ (94oC: 20 giây; 60oC:
20 giây; 72oC: 2 phút 30 giây); giai ñoạn kéo dài
chuỗi sau cùng thực hiện ở 72oC trong 10 phút.

Bảng 1. Trình tự các mồi ñược dùng ñể khuếch ñại gen HA, NA và M của virus H5N1.
Tên mồi

Trình tự 5’ - 3’

Vị trí

Tm

H5F-1

AGCRAAAGCAGGGGTHYAVTCT

1 - 22

58.0

H5R-1776

AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACAATCTGA

1776 - 1743

57.5

N1F-1

AGCRAAAGCAGGAGWTYAAAATGAATCCA

1 - 29

58.7

N1R-1398

AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAYMAAYTAC

1398 - 1367

55.2

MF-1

AGCRAAAGCAGGTAGATRTTGAAARATGA

1 - 29

57.3

MR-1027

AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCCA

1027 - 1000

53.9

Ký hiệu: M=A/C; R=A/G; S=G/C; Y=C/T; K=G/T; V=A/G/C; H=A/C/T; D=A/G/T; B=C/G/T; N=A/G/C/T; Tm: Nhiệt ñộ nóng
chảy của mồi

kb
M NC PC 1 2 3 4
5 6
7 8
9 10 11
2,00

1776 bp

0,75
0,25

kb

M NC PC

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

2,00
1398 bp
0,75
0,25
kb

M NC PC

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

2,00
0,75

1027 bp

0,25

Hình 1. Sản phẩm PCR khuếch ñại gen HA, NA và M của virus cúm H5N1. M: thang DNA chuẩn. NC: mẫu chứng âm; PC:
mẫu chứng dương; 1-5: mẫu thu thập ở vịt; 6-9: mẫu thu thập ở gà; 10 và 11: mẫu thu thập ở người.

427


Nguyễn Nam Thắng et al.
Kết quả ñiện di sản phẩm thử nghiệm với 11 mẫu
cDNA của virus H5N1 thu thập từ gia cầm và người
ñược trình bày ở hình 1. Kết quả cho thấy: phản ứng
PCR với 3 cặp mồi do chúng tôi thiết kế ñã khuếch ñại
thành công toàn bộ phân ñoạn HA, NA và M trên cả
11 mẫu cDNA.
Tạo plasmid tái tổ hợp chứa các phân ñoạn gen HA,
NA và M
Sau khi ñiện di trên thạch agarose, sản phẩm
DNA ñược tinh sạch từ thạch agarose và ño mật ñộ
quang (optical density - OD) ở bước sóng 260 nm
ñể xác ñịnh nồng ñộ DNA. DNA tinh sạch ñược sử

dụng ñể tạo plasmid tái tổ hợp với bộ sinh phẩm
ClonJETTM PCR cloning theo hướng dẫn của nhà
sản xuất.

Plasmid tái tổ hợp ñược biến nạp vào tế bào E. coli
TOP10 và nuôi cấy trên thạch LB có ampicillin, ở
37oC, qua ñêm. Plasmid pJET1.2/blunt có chứa gen
kháng ampicillin nên những tế bào E. coli dung nạp
plasmid thì mới có khả năng phát triển trên môi trường
có bổ sung ampicillin. Ngoài ra, trên plasmid này còn
chứa gen tổng hợp enzyme giới hạn eco47IR gây chết
tế bào vi khuẩn. Vị trí gắn với sản phẩm PCR nằm ở
giữa gen này. Vì vậy, những chủng vi khuẩn có thể phát
triển ñược trên môi trường thạch LB có bổ sung
ampicillin ñều có plasmid tái tổ hợp.
Phản ứng colony PCR ñược thực hiện ñể lựa chọn
các khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen mong
muốn. ðối với mỗi mẫu, tiến hành kiểm tra từ 5 - 8
khuẩn lạc ñể lựa chọn các khuẩn lạc mang plasmid tái
tổ hợp chứa trình tự DNA cần tách dòng (Hình 2).

Gen NA

Gen HA

Gen M

Hình 2. Sản phẩm colony PCR ñể lựa chọn các khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen HA, NA và M của virus cúm H5N1.

Bảng 2. ðộ tương ñồng cao nhất (max identity) của các

trình tự gen ñã tách dòng khi so sánh với trình tự gen của
virus cúm H5N1 trên GenBank bằng chương trình BLAST.
ðộ tương ñồng (%)

Mẫu
Gen HA

Gen NA

Gen M

1

99

99

98

2

99

99

98

3

98

98

99

4

98

98

99

5

97

98

98

6

98

97

98

7

98

97

98

8

97

98

98

9

97

97

98

10

99

99

99

11

99

99

99

428

Các khuẩn lạc có kết quả colony PCR dương tính
ñược nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung
ampicillin, qua ñêm và tách chiết DNA plasmid. DNA
của tất cả các mẫu plasmid ñều ñược giải trình tự và so
sánh với các trình tự gen trên GenBank bằng chương
trình BLAST. Kết quả so sánh cho thấy tất cả các trình
tự gen ñã tách dòng ñều có ñộ tương ñồng cao với trình
tự gen tương ứng của các chủng virus H5N1 ñã công bố
(Bảng 2). Hai mươi bảy trình tự nucleotide của các
phân ñoạn gen HA, NA và M của các chủng virus
H5N1 thu thập từ gia cầm ñã ñược ñăng ký trên
GenBank (các mã số ñăng ký từ CY095680 ñến
CY095706).
BÀN LUẬN
Giải trình tự toàn bộ hệ gen là phương pháp tốt
nhất ñể có thể hiểu rõ các ñặc ñiểm di truyền của virus
H5N1, tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và

Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011
phức tạp. Do ñó hầu hết các nghiên cứu thường chỉ
tập trung vào một hoặc một vài phân ñoạn RNA của
virus. Virus cúm H5N1 có hệ gen gồm 8 phân ñoạn
RNA mã hóa cho 11 protein. Ba phân ñoạn gen HA,
NA và M có vai trò quan trọng, quy ñịnh các ñặc tính
kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc,
ñộc lực và khả năng gây bệnh của virus, do ñó ñược
nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu.

thấy các trình tự gen ñã tách dòng có ñộ tương ñồng
cao (trên 97% - bảng 2) với trình tự gen của virus
H5N1 chứng tỏ kỹ thuật khuếch ñại và tách dòng các
phân ñoạn HA, NA và M của virus H5N1 ñã thu
ñược các phân ñoạn tương ứng. Trình tự gen HA,
NA và M của các chủng virus thu thập trên gia cầm
ñã ñược ñăng ký trên GenBank với các mã số ñăng
ký từ CY095680 ñến CY095706.

Các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu (bảng
1) ñược thiết kế sau khi phân tích các trình tự gen của
virus cúm H5N1 ñã ñăng ký trên GenBank từ năm
2003 - 2010. Trình tự nucleotide tại các vùng này có
tính bảo tồn cao, tuy nhiên ở một số vị trí vẫn có hiện
tượng ña hình. Do ñó, hầu hết các trình tự mồi ñược
thiết kế dưới dạng “degenerative primer” ñể làm tăng
khả năng bắt cặp với cDNA của các chủng H5N1
khác nhau. Ngoài ra, các trình tự mồi ñược thiết kế
ñều có số lượng nucleotide khá lớn (22 - 34
nucleotide), như vậy nhiệt ñộ biến tính của mồi sẽ

tương ñối cao (54 - 58oC), ñảm bảo tính ñặc hiệu của
mồi, hạn chế các sản phẩm phụ khi thực hiện phản
ứng PCR. ðể phản ứng khuếch ñại gen có hiệu quả tốt
nhất, chúng tôi ñã tiến hành thử nghiệm phản ứng ở
các ñiều kiện khác nhau và ñã xác ñịnh ñược chương
trình nhiệt (nhiệt ñộ, thời gian gắn mồi; thời gian kéo
dài chuỗi; số chu kỳ khuếch ñại) và thành phần phản
ứng (nồng ñộ dNTP; nồng ñộ mồi; nồng ñộ enzyme)
tối ưu cho phản ứng.

Việc khuếch ñại và tách dòng trọn vẹn các phân
ñoạn gen HA, NA và M của virus cúm H5N1 là tiền
ñề cung cấp nguyên liệu gen và trình tự nucleotide
cho các nghiên cứu di truyền phân tử liên quan ñến
ñặc tính kháng nguyên, tính kháng thuốc, khả năng
lây nhiễm, ñộc lực, khả năng gây bệnh, sự tiến hóa
và các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của virus
cũng như ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất vaccine,
phát triển các sinh phẩm chẩn ñoán dựa trên kỹ thuật
miễn dịch.

Sau khi ñiện di và tinh sạch từ thạch agarose,
DNA ñược gắn vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp
vào tế bào E. coli TOP10. Vector pJET1.2/blunt có
hiệu quả biến nạp cao với tế bào E. coli TOP10 và
sau khi nuôi cấy mỗi tế bào E. coli có thể tạo ra 300 700 bản sao. Việc lựa chọn các khuẩn lạc có chứa
plasmid tái tổ hợp có thể thực hiện bằng phản ứng
colony PCR hoặc sử dụng enzyme giới hạn. Các
phân ñoạn gen của virus H5N1 có kích thước lớn
(trên 1000 bp) và có ñộ biến ñổi cao nên nếu dùng

enzyme giới hạn thì số lượng sản phẩm của phản ứng
giới hạn có thể thay ñổi tùy thuộc vào từng chủng
virus (không có, có một hay có nhiều vị trí giới hạn
trên trình tự DNA), gây khó khăn cho việc phân tích.
Do ñó chúng tôi ñã áp dụng kỹ thuật colony PCR ñể
lựa chọn các khuẩn lạc có plasmid tái tổ hợp chứa
trình tự gen cần tách dòng. Dựa vào kết quả ñiện di
sản phẩm phản ứng colony PCR (Hình 2) có thể lựa
chọn ñược các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp
mong muốn một cách dễ dàng.
Tất cả 33 trình tự gen ñã tách dòng ñều ñược xác
ñịnh trình tự nucleotide trên hệ thống CEQ 8000 và
kiểm tra bằng chương trình BLAST. Kết quả cho

KẾT LUẬN
Kỹ thuật RT-PCR hai bước khuếch ñại trọn vẹn
các phân ñoạn HA, NA và M của virus cúm H5N1
với 3 cặp mồi thiết kế trên vùng 3’ và 5’ UTR ñã
ñược xây dựng thành công. Thử nghiệm kỹ thuật trên
11 mẫu RNA của virus cúm H5N1 cho thấy tất cả
các phân ñoạn HA, NA và M của virus cúm H5N1
ñều ñược khuếch ñại trọn vẹn. Tất cả các phân ñoạn
HA, NA và M của 11 mẫu virus cúm H5N1 thu thập
từ gia cầm và người ñều ñược gắn với vector
pJET1.2/blunt, tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự
gen của virus cúm H5N1.
Lời cảm ơn: Nghiên cứu ñược thực hiện với sự hỗ
trợ kinh phí của ñề tài hợp tác theo Nghị ñịnh thư
giữa Việt Nam và Thái Lan “Hợp tác nghiên cứu ñặc
ñiểm lưu hành và sự biến ñổi gen của virus cúm gia

cầm H5N1 ở khu vực phía Bắc Việt Nam” do
Trường ðại học Y Thái Bình chủ trì. Chúng tôi xin
ñược bày tỏ lòng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Văn
Cảm - nguyên Giám ñốc Trung tâm Chẩn ñoán thú y
Trung ương và TS. Lê Thị Quỳnh Mai - Giám ñốc
Trung tâm Cúm Quốc gia ñã cung cấp các mẫu RNA
của virus A/H5N1.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of
haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine
to regulate the growth of avian influenza viruses in
tissueculture. Virus Res 79(1-2): 177-185.
Bouvier NM, Palese P (2008) The biology of influenza
viruses. Vaccine 26 Suppl 4: D49-53.

429


Nguyễn Nam Thắng et al.
Bright RA, Shay DK, Shu B, Cox NJ, Klimov AI (2006)
Adamantane resistance among influenza A viruses isolated
early during the 2005-2006 influenza season in the United
States. JAMA 295(8): 891-894.
Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, Rayner JM,
Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung
CL, Xu KM, Duan L, Huang K, Qin K, Leung YH, Wu
WL, Lu HR, Chen Y, Xia NS, Naipospos TS, Yuen KY,
Hassan SS, Bahri S, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JS,
Guan Y (2006) Establishment of multiple sublineages of
H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic

control. Proc Natl Acad Sci USA 103: 2845-2850.
Drake JW (1993) Rate of spontaneous mutation among
RNA viruses. Proc Natl Acad Sci USA 90(9): 4171-4175.
Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR
(2001) Universal primer set for the full-length
amplification of all influenza A viruses, Arch Virol 146:
2275-2289.
Neumann G, Kawaoka Y (2006) Host range restriction and
pathogenicity in the context of influenza pandemic. Emerg
Infect Dis 12: 881-886.

Smith GJ, Fan XH, Wang J, Li KS, Qin K, Zhang JX,
Vijaykrishna D, Cheung CL, Huang K, Rayner JM, Peiris
JS, Chen H, Webster RG, Guan Y (2006) Emergence and
predominance of an H5N1 influenza variant in China. Proc
Natl Acad Sci USA 103: 16936-16941.
Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000) Immunology of avian
influenza virus: a review. Dev Comp Immunol 24(2-3):
269-283.
Wu WL, Chen Y, Wang P, Song W, Lau SY, Rayner JM,
Smith GJ, Webster RG, Peiris JS, Lin T, Xia N, Guan Y
and Chen H (2008) Antigenic profile of avian H5N1
viruses in Asia from 2002 to 2007. J Virol 82(4): 17981807.
Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA,
Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M,
Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T,
Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell
RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006)
Haemagglutinin mutations responsible for the binding
of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors.

Nature 444(7117): 378-382.

DEVELOPMENT OF AMPLIFYING AND CLONING METHOD FOR FULL-LENGTH
HA, NA AND M SEGMENTS OF INFLUENZA A/H5N1VIRUS
Nguyen Nam Thang1, Pham Ngoc Khai1, Dinh Duy Khang2, Luong Xuan Hien1, ∗
1
2

Thaibinh Medical University
Institute of Biotechnology
SUMMARY
Genetic variation in HA, NA and M segments of influenza A virus may alter antigenic characteristics,
transmissibility, drug resistibility, virulence, and pathogenicity. In this study, a novel method for amplifying and
cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus is described. RNA templates of influenza
A/H5N1 virus were used for amplification of full-length HA, NA and M segments by two step RT-PCR method.
The method was carried out with 3 specific primerpairs designed based on consensus sequences of the 3’ UTR
and 5’ UTR by multiple aligment of each segment. The DNA amplifications were examined by electrophoresis
and eluted from agarose gel, then ligated with pJET1.2/blunt vector to generate recombinant plasmids. RNA
templates extracted from 11 isolates of H5N1 virus collected from poultry and humans were tested to evaluate the
accuracy of the method. After optimization, the RT-PCR method was used to amplify all HA, NA and M
segments from RNA templates of 11 influenza H5N1 isolates. Electrophoresis result showed that all
amplifications of HA, NA and M segments were clearly visualized on agarose gel. After gel-elution, the
amplifications were inserted into pJET1.2/blunt vector. Sequencing results indicated that all of the sequences from
the clones have high nucleotide identity with the corresponding H5N1 sequences. The method for amplifying and
cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus isolated from poultry and humans was
successfully developed and could be applied for study of influenza H5N1 virus at the molecular level.
Keywords: A/H5N1, avian influenza, cloning, HA, NA, M segment, RT-PCR

∗

Author for correspondence: Tel: 84-913291360 ; E-mail:

430