Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (tóm tắt)

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nước
uống không được bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hư thối
do nhiễm khuẩn hoặc hóa chất độc hại Các nghiên cứu gần đây đã
xác định một trong những nguyên nhân của nhiều trường hợp ngộ
độc thức ăn là do vi khuẩn E. coli .
E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, có
nhiều trong tự nhiên, trong ruột của người và gia súc. Trong đường
ruột, chúng hiện diện chủ yếu ở đại tràng nên còn được gọi là vi
khuẩn đại tràng. E. coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật.
Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ gây bệnh. Đa
số các chủng E. coli là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng có vài
chủng rất độc như chủng E. coli O157:H7 có thể tìm thấy trong ruột
và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò, chất thải
của bò và các sản phẩm như thịt bò, sữa bò chưa khử trùng
Các bệnh có liên quan đến E. coli là tiêu chảy, viêm phổi, viêm
đường dẫn tiểu và một số bệnh khác. Triệu chứng bị nhiễm trùng vi
khuẩn thường khác nhau, nhưng nhìn chung, bệnh nhân hay có các
triệu chứng như: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết dưới da, tăng huyết
áp, tiêu chảy thường có máu Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau 5
đến 7 ngày. Vì vi khuẩn E. coli quá phổ biến, nên hàng năm trên
khắp thế giới đều có người mắc bệnh do vi khuẩn này. Các chuyên
gia ước tính rằng ở Mỹ mỗi năm có khoảng 70 nghìn người mắc bệnh
liên quan đến E. coli O157:H7.
Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực
phẩm, năm 2010 có 175 vụ ngộ độc với 5664 người mắc, trong đó có
3978 người phải nhập viện và 51 người tử vong. Năm 2011 có 148
2
vụ ngộ độc, trong đó có 4700 người mắc với 3663 người phải nhập

viện và 27 người tử vong. Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, trong đó có
5541 người mắc với 4335 người nhập viện và 34 người tử vong. Như
vậy, trong ba năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 người tử vong.
Trong năm 2013 nước ta xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng nhất
là những tháng cuối năm. Số liệu thống kê trong quý III năm 2013
cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây
ra. Chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 được xác định lần đầu tiên ở
Việt Nam vào năm 2005, tiếp đó đã có những nghiên cứu về E. coli
O157:H7. Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nước ta hiện chưa tìm
thấy sự hiện diện của chủng E. coli O157:H7, tuy nhiên những vi
khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các bệnh liên quan đã
được phát hiện trong nhiều trường hợp. Trong sinh hoạt hàng ngày,
không ngoại trừ trường hợp chúng ta bị nhiễm E. coli O157:H7 thông
qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân người, động vật và gia cầm.
Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E. coli
O157:H7 trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con
người là cần thiết. Việc sử dụng kháng thể kháng E. coli O157:H7, một
trong những yếu tố quan trọng để phát hiện E. coli O157:H7 vẫn còn
chưa được nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E. coli
O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3. Nội dung nghiên cứu
(i) Xác định chủng E. coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền:
(1) Tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA; (2) Tách dòng và
3
xác định trình tự gen mã hóa cho các độc tố Stx1, Stx2 và (3) Kỹ
thuật LAMP.

(ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn
E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phage display;
(iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli
O157:H7;
(iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp.
4. Những điểm mới của đề tài:
(i) Tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu chủng vi khuẩn E. coli
O157:H7 bằng kỹ thuật phage display.
(ii) Đã sử dụng phức hợp nano-kháng thể trong việc phát hiện vi
khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp soi dưới kính hiển vi.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
(i) Đánh giá các phương pháp (PCR nhân gen 16S rRNA, gen
độc tố và kỹ thuật LAMP) trong việc phát hiện và phân loại chủng E.
coli O157:H7.
(ii) Cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng ứng dụng kỹ thuật
phage display trong việc tạo protein kháng thể tái tổ hợp.
(iii) Đã nghiên cứu các đặc điểm cấu trúc gen và protein kháng
thể tái tổ hợp đặc hiệu E. coli O157:H7 có nguồn gốc từ thư viện
phage display.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy có thể sử dụng các
phương pháp khác nhau như PCR nhân gen 16S rRNA, gen độc tố
hoặc kỹ thuật LAMP hướng tới việc thiết kế phát triển kit phát hiện
nhanh vi khuẩn E. coli O157:H7 một cách đơn giản, hiệu quả, giá
thành thấp, phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
4
Bên cạnh đó, việc tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu E. coli
O157:H7 có vai trò quan trọng trong việc phát triển các kit phát hiện
vi khuẩn này trong các mẫu thực phẩm và cũng như trong phác đồ

điều trị các bệnh liên quan đến E. coli O157:H7 với độ nhạy và độ
đặc hiệu cao.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 106 trang (kể cả tài liệu tham khảo), được chia
thành các phần: Mở đầu: 2 trang; Chương 1 Tổng quan tài liệu: 32
trang; Chương 2 Vật liệu và phương pháp: 16 trang; Chương 3 Kết
quả và thảo luận: 42 trang; Kết luận và đề nghị: 1 trang; Danh mục
các công trình công bố kết quả liên quan đến luận án: 1 trang; Tài
liệu tham khảo: 13 trang với 103 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt
và tiếng Anh. Luận án có 12 bảng số liệu, 38 hình.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án tổng kết 106 tài liệu trong đó có 9 tài liệu tiếng Việt, 97
tài liệu tiếng Anh và 6 tài liệu Internet về 3 vấn đề: (1) Đặc điểm vi
khuẩn E. coli O157:H7 bao gồm các nội dung: đặc điểm chung của
chủng vi khuẩn E. coli O157:H7, độc tố Shiga-like toxin bản chất và
tác hại , t
; (2) Các phương pháp phát hiện và xác
định vi khuẩn E. coli O157:H7 bao gồm các nội dung: phương pháp
PCR dựa trên DNA, kỹ thuật LAMP, sử dụng kháng thể tái tổ hợp
trong phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7, p
E. coli O157:H7
.

5
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vi khuẩn E. coli O157:H7 được cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh
vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQG Hà Nội.
- Các vật liệu khác như thư viện Thực khuẩn thể Griffin.1, các

chủng tế bào E. coli , các enzyme, các kháng thể, được mua của các
hãng nổi tiếng như: Merck, Invitrogen, Sigma, Biolabs, Fermentas,
Promega, của các nước Mỹ, Anh, Đức, Trung Quốc.
2.2. Thiết bị
Các thí nghiệm được tiến hành trên các trang thiết bị thuộc
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen và phòng Công
Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị thường sử dụng như: Máy ly tâm,
bộ điện di đứng, máy Speed Vac, được mua từ nhiều hãng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong luận án thực hiện
theo Sambrook và cộng sự (2001) có cải tiến phù hợp. Một số
phương pháp tiến hành theo kit và hướng dẫn của nhà sản xuất. Gồ
ứu DNA;Kỹ thuật
bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display); ứu
protein; Phương pháp phân tích và sử lý số liệu.







6
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
:

3.1.

Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm của luận án.
3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI O157:H7 BẰNG

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DNA
3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật
PCR gen mã hóa 16S rRNA
3.1.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn
Chủng E. coli O157:H7 được nuôi trong môi trường LB lỏng,
thu sinh khối tế bào và tách chiết DNA. Kết quả điện di cho thấy ở cả
hai mẫu đều xuất hiện 1 băng sáng, không bị đứt gẫy và không có sản
phẩm phụ chứng tỏ DNA tổng số được tách chiết từ vi khuẩn E. coli
O157:H7 có độ tinh sạch cao.
3.1.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá 16S rRNA
Tiếp theo, gen mã hoá 16S rRNA sẽ được nhân bản với cặp mồi
đặc hiệu 16S rRNA-F/16S rRNA-R. Sản phẩm PCR được kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.3).
Kết quả trên hình 3.3 cho thấy, sản phẩm PCR của cả 2 mẫu đều
là 1 băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,5 kb phù hợp với kích
p ng vi n
c nh ng gen 16S rRNA
t n ng
gen c Stx
t n ng
kt LAMP
ng vi n
E. Coli O157:H7
n Griffin. 1
Gen a
ng 
ng c
Protein ng 
nh c u
a ng 

o ng &
u n gen
m tra
7
thước tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và đủ tiêu
chuẩn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Để khẳng định xem đoạn
gen nhân được được có phải là gen mã hóa 16S rRNA hay không, sản
phẩm PCR được tiến hành tách dòng và xác định trình tự.

Marker: Marker 1kb
Mẫu 1: E. coli O157:H7 số 1
Mẫu 2: E. coli O157:H7 số 2
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA
3.1.1.3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp mang gen 16S rRNA vào tế
bào E. coli DH5α
Quá trình tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá 16S rRNA
được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng PCR vào
vector tách dòng pBT. Sau đó vector tái tổ hợp pBT mang đoạn gen
16S rRNA được tách chiết và kiểm tra bằng phương pháp cắt bởi
enzyme giới hạn BamHI. Tiếp theo, các plasmid tái tổ hợp sẽ được
tách chiết với số lượng lớn và được tinh sạch để sử dụng cho phản
ứng xác định trình tự.
3.1.1.4. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA plasmid, gen 16S rRNA sẽ
được xác định trình tự theo nguyên tắc của F. Sanger và cộng sự
(1981), sử dụng trên máy xác định trình tự tự động. Đoạn gen 16S
rRNA đã tách dòng có kích thước 1499 bp. Kết quả so sánh trình tự
với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần
mềm FASTA ( cho thấy trình tự nucleotide của
8

đoạn gen thu nhận được có độ tương đồng cao (trên 99%) với trình tự
gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 khác nhau.
Như vậy, có thể kết luận rằng chủng vi khuẩn đã nuôi cấy chính là E.
coli O157:H7.
Chủng E. coli O157:H7 tách dòng được có độ tương đồng cao
với các chủng E. coli O157:H7 khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế
trong đó cao nhất với chủng E. coli O157:H7 mã số AB035923
(99,4%). So với các chủng vi khuẩn khác như E. coli chủng WD01,
AE1-2 chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 phân lập được độ tương
đồng khoảng 99%. Trình tự gen 16S rRNA mới được xác định này đã
được đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số HQ658163.
3.1.2. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2 của
vi khuẩn E. coli O157:H7
3.1.2.1. Nhân bản đoạn gen Stx1 và Stx2
Sau khi tách chiết DNA tổng số vi khuẩn E. coli O157:H7, gen
Stx1 và Stx2 được khuếch đại với hai cặp mồi đặc hiệu tương ứng là
Stx1F/Stx1R và Stx2F/Stx2R. Đối chứng âm là vi khuẩn DH5α. Sản
phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả
được trình bày trên hình 3.7.

M: marker 1kb
1: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R
đối với E. coli DH5α
2: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R
đối với E. coli DH5α
3: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R
đối với E. coli O157:H7
4: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R
đối với E. coli O157:H7
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 và Stx2

9
Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy ở giếng số 1 và giếng số 2
không xuất hiện băng chứng tỏ E. coli DH5α không mang gen độc.
Giếng số 3 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 180 bp, tương
ứng với kích thước của gen Stx1 theo tính toán lý thuyết. Ở giếng số
4 có một băng vạch sáng đậm có kích thước khoảng 200 bp phù hợp
với kích thước của gen Stx2 như tính toán theo lý thuyết. Các băng
đều sáng, đậm, rõ nét và đủ tiêu chuẩn để tiến hành các thí nghiệm
tiếp theo. Tiếp theo, sản phẩm PCR thu được được tiến hành tách
dòng và xác định trình tự.
3.1.2.2. Chọn dòng gen Stx1 và Stx2 trong vector pJET1.2/blunt
Sản phẩm PCR nhân hai gen Stx1 và Stx2 được tách dòng bằng
cách gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt, sau đó vector tái tổ hợp
pJET1.2 mang gen Stx1 và Stx2 được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.
coli DH5α. Kiểm tra các dòng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi của
vector pJET1.2.
Để khẳng định kết quả tách dòng đối với 2 gen Stx1 và Stx2, tiếp
theo plasmid của dòng số 1 mang gen Stx1 và dòng số 5 mang gen
Stx2 được tinh sạch và giải trình tự.
3.1.2.3. Xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA plasmid, đoạn gen Stx1 và
Stx2 được xác định trình tự. Kết quả xác định trình tự cho thấy đoạn
gen Stx1 có kích thước là 150bp, đoạn gen Stx2 có kích thước là
205bp. Đoạn gen Stx1 và Stx2 đều nằm ở tiểu phần A, tiểu phần có
vai trò như một enzyme N-glycosidase. Trình tự gen Stx Stx2
được được so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen
Quốc tế bằng phần mềm phân tích độ tương đồng BLAST
(). Kết quả nhận được cho thấy trình tự
nucleotide thu được có độ tương đồng 99% với các trình tự của đoạn
10

gen Stx E. coli O157:H7 và các chủng vi khuẩn
E. coli khác.
3.1.3. Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E. coli O157:H7
3.1.3.1.
Trên gen đích có 6 vùng bao gồm vùng F3/F3c, F2/F2c, F1/F1c ở
đầu 3’ và vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c ở đầu 5’. Tuy nhiên, theo
nghiên cứu của Maruyama số bộ mồi tối thiểu cần để tiến hành là 1 cặp
mồi BIP/FIP. Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ mồi
theo nghiên cứu của Maruyama nhằm làm sáng tỏ thêm vấn đề này.
3.1.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn
DNA tổng số của vi khuẩn E. coli O157:H7 được tách chiết làm
mẫu nghiên cứu, song song với vi khuẩn E. coli O157:H7, vi khuẩn
E. coli ATCC được sử dụng làm đối chứng âm.
3.1.1.2. Phản ứng LAMP


Hình 3.12. Hình ảnh điện di
sản phẩm phản ứng LAMP

M: Marker 1kb
1: vi khuẩn E. coli O157:H7
2: vi khuẩn E. coli ATCC
Trong các phương pháp phát hiện thì điện di trên gel agarose là
thông dụng nhất. Sản phẩm LAMP là tổng hợp của nhiều đoạn DNA
cuộn xoắn có các kích thước khác nhau. Băng nhỏ nhất (< 250bp)
tương ứng với kích thước đoạn gen nằm giữa hai mồi ngoài. Nếu
11
phản ứng LAMP âm tính thì không có đoạn DNA nào được tạo ra,
sản phẩm của phản ứng sẽ dưới dạng không có băng nào.
Kết quả nhận được trên Hình 3.12 cho thấy phản ứng LAMP

cho kết quả dương tính với vi khuẩn E. coli O157:H7 (giếng 1) và âm
tính với vi khuẩn E. coli ATCC (giếng 2). Ở đường chạy số 1 xuất
hiện 1 dải băng dài với kích thước nhỏ nhất dưới 250 bp. Kết quả này
phù hợp với tính toán lý thuyết. Khi nhân PCR với cặp mồi ngoài,
đoạn DNA thu được sẽ có kích thước là 139 bp. Bên cạnh đó, ở
đường chạy số 2 không thấy xuất hiện dải băng, chứng tỏ phản ứng
LAMP không xảy ra đối với vi khuẩn E. coli ATCC, điều này là phù
hợp do trong DNA vi khuẩn E. coli ATCC không có chứa gen Stx2
mã hóa độc tố Shiga-like toxin 2. Như vậy, có thể nhận định, phản
ứng LAMP vẫn có thể xảy ra trong trường hợp chỉ sử dụng 1 cặp mồi
FIP/BIP.
Tiếp theo độ nhạy của phản ứng LAMP xác định. Sau khi thí
nghiệm và tính toán, hàm lượng DNA tối thiểu để phản ứng dương
tính trong thời gian 25 phút là: 93,5pg/µl (tương đương khoảng 166
tế bào) đối với điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi.
Cùng với hàm lượng DNA tối thiểu cần thiết cho phản ứng
LAMP, thời gian tối thiểu để phản ứng diễn ra cũng được thực hiện.
Tiến hành phản ứng LAMP trên máy PCR thông thường, sau đó mẫu
được lấy ở các thời điểm sau 15 phút, 25 phút, 30 phút, 40 phút và 60
phút và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Kết quả là sau 25 phút có thể quan sát được phản ứng LAMP khi kết
quả cho dương tính.
3.1.1.3. Phát hiện sản phẩm LAMP
Một cách phát hiện sản phẩm LAMP khác bằng mắt thường là
sử dụng SYBR Green I. Những mẫu nào dương tính sẽ cho màu
12
xanh, còn mẫu nào âm tính sẽ cho màu vàng chanh (hình 3.14A). Có
thể quan sát mẫu dương tính được nhuộm SYBR Green I dưới tia
UV. Khi quan sát dưới tia UV, mẫu dương tính sẽ phát quang, mẫu
âm tính sẽ không có mầu ( hình 3.14B).

Hình 3.14. Sản phẩm LAMP khi nhuộm SYBR Green I
A: Quan sát dưới ánh sáng thường; B: Quan sát dưới tia UV
1: phản ứng âm tính 2: phản ứng dương tính
Thảo luận
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật đã được sử dụng từ lâu trong việc xác
định và phân loại sinh vật đặc biệt là đối với gen 16S rRNA. Bên
cạnh đó, quá trình khuếch đại và giải trình tự các gen độc tố cũng
được sử dụng trong việc xác định các loại vi khuẩn gây độc. Kỹ thuật
LAMP đã được sử dụng rất nhiều trong nghiên cứu cũng như trong
các kit xét nghiệm. Mặc dù có nhiều ưu điểm như nhanh, kỹ thuật
đơn giản nhưng kỹ thuật này có một nhược điểm có thể gặp phải đó
là khó phân biệt được kết quả âm tính hay âm tính giả.
Tóm lại, mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm khác nhau, tùy
từng điều kiện cơ sở vật chất mà sử dụng các phương pháp phù hợp
cho việc phát hiện và phân loại vi khuẩn. Cần phối hợp nhiều phương
pháp với nhau để đưa ra kết luận chính xác nhất.

A
B
13
3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI
VỚI VI KHUẨN E. COLI O157:H7
3.2.1. Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1
Trong nghiên cứu này, thư viện phage của Griffin1 được sử
dụng để sàng lòng. Để thu được kháng thể gắn đặc hiệu với kháng
nguyên đích (ở đây là tế bào E. coli O157:H7) từ thư viện này, cần
tiến hành các vòng sàng lọc. Trong nghiên cứu này có 5 vòng sàng
lọc, vòng 1, 2, 3, 5 sử dụng tế bào E. coli O157:H7 làm kháng
nguyên và vòng 4 là vòng sàng lọc loại trừ (sử dụng tế bào E. coli

ATCC 25922 làm kháng nguyên). Đánh giá khả năng gắn kết của
hỗn hợp phage với tế bào đích sau mỗi vòng sàng lọc được đánh giá
bằng kỹ thuật ELISA . Kết quả sau 5 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage
thu được chứa chủ yếu các dòng phage mà kháng thể bộc lộ trên đó
gắn đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7.
Để tạo dòng, hỗn hợp phage sau vòng sàng lọc 5 được xâm
nhiễm vào E. coli chủng TG1, sau đó 37 khuẩn lạc chứa phagemid đã
chọn được nhân lên và thu phage. Phage thu được từ các khuẩn lạc
riêng rẽ này dưới dạng từng dòng riêng biệt và được sử dụng cho thí
nghiệm xác định khả năng gắn kết với E. coli O157:H7 bằng phương
pháp ELISA.
3.2.2. Chọn dòng kháng thể phage đặc hiệu với vi khuẩn E. coli
O157: H7
37 dòng khuẩn lạc sau chọn lọc được tiến hành tách phage để
thực hiện phản ứng ELISA đánh giá độ gắn kết. Kết quả nhận được
cho thấy tất cả 37 dòng phage được chọn đều thể hiện khả năng gắn
với E. coli O157:H7 qua phản ứng ELISA. Ngoại trừ dòng phage 20
có tín hiệu ELISA cao vượt trội, các dòng phage còn lại có kết quả
trung bình và gắn khá đồng đều với E. coli O157:H7 (Hình 3.17).
14
Điều này chứng tỏ sau 5 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu được chứa
chủ yếu các dòng phage có khả năng gắn với E. coli O157:H7.
Từ kết quả trên, một số dòng phage có tín hiệu ELISA trung
bình và cao (bao gồm cả dòng phage 20) từ lần phản ứng ELISA
trước được tiến hành chọn lọc bằng ELISA tiếp theo để phân tích khả
năng gắn kết của từng dòng phage trên đích E. coli O157:H7 so với
các đối chứng âm (giếng chứa PBS) và đối chứng dương (giếng chứa
vi khuẩn E. coli ATCC 25922). Kết quả xác nhận khả năng nhận biết
và liên kết đặc hiệu với tế bào E. coli O157:H7 (các dòng phage cao
và trung bình) bằng kỹ thuật ELISA được thể hiện trong hình 3.18.

Hình 3.17. Kết quả của phản ứng
ELISA đánh giá ái lực của hỗn hợp
phage vòng sàng lọc 5.
Hình 3.18. Kết quả đánh giá ái lực của
dòng phage 20 với tế bào E. coli
O157:H7 và tế bào E. coli ATCC
25922.
Kết quả trên Hình 3.18 cho thấy hầu hết các dòng phage được
chọn đều có tín hiệu ELISA cao hơn so với các giếng đối chứng âm
và đối chứng dương. Đặc biệt dòng phage 20 vẫn có kết quả cao hơn
hẳn so với các giếng đối chứng và so với các dòng phage còn lại.
Điều đó có thể nhận định rằng kháng thể phage thu nhận được có khả
năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7.
OD 450
Dòng phage
15
Để nghiên cứu sâu hơn về bản chất của kháng thể phage đơn
chuỗi thu nhận được, trình tự đoạn gen mã hóa kháng thể này được
tiến hành xác định.
3.2.3. Nhân bản gen mã hóa kháng thể bằng PCR
Dòng phage 20 được nhân lên trong tế bào E. coli chủng TG1,
sau đó tách DNA phage để làm khuôn nhân bản đoạn gen mã hóa
đoạn kháng thể bằng phản ứng PCR với cặp mồi LABF/LABR. Sản
phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và được
thể hiện trên hình 3.19.

Hình 3.19.Kết quả điện di sản
phẩm PCR của dòng 20 với

cặp mồi LABF/LABR.

M: Marker DNA
1: Sản phẩm PCR
So sánh với các băng vạch đã biết trước kích thước trên thang DNA
chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 600bp tương ứng
với kích thước gen mã hóa kháng thể theo tính toán lý thuyết. Tiếp theo,
gen mã hóa kháng thể này được tiến hành giải trình tự.
3.2.4. Giải trình tự gen mã hoá kháng thể
Trình tự gen mã hóa kháng thể được xác định theo phương pháp
của F. Sanger và cộng sự, sử dụng trên máy xác định trình tự tự động.
Đoạn kháng thể thu nhận được có trình tự amino acid suy diễn như sau:
MNTYCLRQPLDCYYSRPSRPWPRCSCRSTSSGGGGSGGGG
SGGSALQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGYYP
NWFQQKPGQAPRALIYSTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAAL
TLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGAMVFGGGTKLTVLGAAA
16
Đoạn gen mã hóa cho kháng thể có độ dài 623bp (với tỉ lệ C+G
là 54.98%) mã hóa cho một protein kháng thể gồm159 amino acid.
Đoạn kháng thể thu được không phải là đoạn scFv đầy đủ mà chỉ
gồm toàn bộ chuỗi nhẹ (V
L
) nối với một phần chuỗi nặng (V
H
). Vùng
linker nối giữa hai đoạn chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có trình tự amino
acid là SSGGGGSGGGGSGGS.
Tính đặc hiệu của kháng thể nằm trong 6 vùng quyết định tính
bổ trợ (complementarity determining region, CDR), vùng tạo hình
dạng của vị trí gắn kết với kháng nguyên (mỗi chuỗi nặng hoặc chuỗi

nhẹ chứa 3 vùng CDR). Khi sử dụng hệ xác định Kabat (cách xác
định các CDR dựa trên trình tự kháng thể có sẵn) các vùng quyết
định tính bổ trợ của chuỗi nhẹ của kháng thể đã được xác định lần
lượt là CDR1 (ASSTGAVTSGYYPN), CDR2 (STSNKHS), và
CDR3 (LLYYGGAMV).
So sánh với các trình tự protein đã công bố trên Ngân hàng Gen
Quốc tế cho thấy trình tự amino acid trong phân tử protein kháng thể
có độ tương đồng từ 65% đến 100% so với các trình tự kháng thể đã
công bố. Trong đó trình tự amino acid của protein thu nhận được
giống đến 98% so với trình tự vùng 4A trong chuỗi nhẹ của các
globin miễn dịch dạng lambda ở người (Ig lambda chain V region
4A). Các phần khác nhau của hai trình tự tập trung chủ yếu vào các
CDR. Nhằm tìm hiểu rõ hơn cấu trúc không gian, phân tử kháng thể
tái tổ hợp được xây dựng cấu trúc 3D trên trang web
www.sbg.bio.ic.ac.uk và www.ncbi.nlm.nih.gov (Hình 3.20).
Phân tích hình 3.20 có thể thấy cấu trúc của kháng thể tái tổ hợp
chỉ là một phần của kháng thể, tuy nhiên vẫn chứa đầy đủ các vùng
CDR, là những vùng chính quyết định sự bắt cặp giữa kháng nguyên
và kháng thể. Phần có mầu vàng trên hình 3.20A là vùng bắt cặp đặc