Nghiên cứu khảo sát hàm lượng apigenin trong cúc hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HIỀN
Mã sinh viên: 1101180

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG
APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG
BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HIỀN
Mã sinh viên: 1101180

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG
APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG
BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Nguyên Hà
2. ThS. Nguyễn Thị Hằng

Nơi thực hiện:
Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng
LỜI CẢM ƠN

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo sát hàm lƣợng Apigenin
trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm
việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ
từ phía nhà trƣờng, thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Việt
Hùng - Phó Viện Trƣởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời đã tạo rất
nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Nguyên Hà - Phó Trƣởng bộ môn
Hóa phân tích - Độc chất, ThS. Đặng Thị Ngọc Lan - GV Bộ môn Hóa phân tích Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này.
Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Nguyễn Thị Hằng - Khoa
Nghiên cứu phát triển - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời đã tận tình
hƣớng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong Viện Pháp Y Quốc Gia, Khoa
Nghiên cứu phát triển, Khoa Vật lý đo lƣờng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng đã
hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt là
những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá
trình học tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Trần Thị Hiền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1.

Tổng quan về cúc hoa vàng ...........................................................................3

1.1.1. Đặc điểm thực vật......................................................................................3
1.1.2. Phân bố ......................................................................................................3
1.1.3. Thành phần ................................................................................................4
1.1.4. Tác dụng của Cúc hoa vàng ......................................................................5
1.2.

Tổng quan về Apigenin .................................................................................5

1.2.1. Tính chất ....................................................................................................5
1.2.2. Tác dụng của Apigenin..............................................................................6
1.3.

Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................................7

1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao................................................7
1.3.2. Máy HPLC ................................................................................................7

1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký .............................................8
1.3.4. Ứng dụng của HPLC .................................................................................9
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) ........................11
1.3.6. Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin..............12
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................14
2.1.

Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu ................................................14


2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..............................................................................14
2.1.2. Hóa chất, dung môi .................................................................................14
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................14
2.2.

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................15

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................15

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ....................................................................................15
2.3.2. Pha dung dịch chuẩn................................................................................15
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký .............................................................15
2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC ....................16
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu .......................................................................19
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................21
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc ký .................21
3.1.1. Chiết xuất .................................................................................................21
3.1.2. Pha dung dịch thử .....................................................................................22

3.1.3. Pha dung dich chuẩn.................................................................................22
3.1.4. Lựa chọn cột sắc ký ..................................................................................22
3.1.5. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện .................................................................22
3.1.6. Lựa chọn tốc độ dòng ...............................................................................23
3.1.7. Lựa chọn pha động ...................................................................................23
3.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng theo tiêu
chuẩn AOAC..........................................................................................................27
3.2.1. Độ đặc hiệu ...............................................................................................27
3.2.2. Độ tƣơng thích của hệ thống sắc ký .........................................................28
3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp......................................................................29


3.2.4. Độ tuyến tính ............................................................................................30
3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp .......................................................................31
3.2.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ ............................33
3.3. Xác định hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng .......................................35
3.4. Bàn luận ..........................................................................................................36
3.4.1. Lựa chọn phƣơng pháp .............................................................................36
3.4.2. Điều kiện xử lý mẫu .................................................................................37
3.4.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng..........................................................37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TT

Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

1.

DAD

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

2.

DĐTQ

Dƣợc điển Trung Quốc

3.

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

4.

EtOH

Ethanol

5.

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatography)

6.

IR

Phổ hồng ngoại (Infra-red)

7.

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

8.

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification)

9.

MeOH

10.

MS

Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry)

11.

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)

12.

SKĐ

Sắc ký đồ

13.

S/N

Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise)

14.

STT

Số thứ tự

15.

UV-VIS

Methanol

Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Khối lƣợng các mẫu thử Cúc hoa vàng

21

3.2

Tỷ lệ dung môi ACN : H2O chạy gradient tại các thời điểm

23

3.3

Thời gian lƣu của mẫu chuẩn và mẫu thử số 1

27

3.4

Giá trị thời gian lƣu và diện tích pic của mẫu chuẩn

29

3.5

Giá trị hàm lƣợng của mẫu thử số 1

30

3.6

Bảng biểu thị giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn

31

3.7

Kết quả biểu thị % tìm lại của khối lƣợng chuẩn thêm vào

33

3.8

Kết quả LOD và LOQ

34

3.9

Giá trị diện tích pic và thời gian lƣu LOD

34

3.10

Kết quả xác định hàm lƣợng của Apigenin trong các mẫu thử

36


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình

Tên ảnh, sơ đồ

Trang

1.1

Cúc hoa vàng

3

1.2

Công thức cấu tạo Apigenin

5

1.3

Sơ đồ nguyên lý máy HPLC

8

1.4

Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

11

3.1

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn ở tỷ lệ MeOH : H3PO4 = 52 : 48

24

3.2

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (1) ở tốc độ 0,8 ml/phút

24

3.3

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (2) ở tốc độ 1,0 ml/phút

25

3.4

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (2) ở tốc độ 0,7 ml/phút

25

3.5

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (3) ở tốc độ 0,7 ml/phút

26

3.6

SKĐ Apigenin mẫu thử

27

3.7

Phổ của Apigenin chuẩn (đƣờng màu đỏ) và phổ Apigenin thử

28

(đƣờng màu xanh)
3.8

Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Apigenin

31


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực
y, dƣợc học, ngày càng có nhiều nghiên cứu các thành phần hoạt chất mang hoạt tính
sinh học trong dƣợc liệu có tác dụng phòng, chữa bệnh, mang lại tiềm năng rất lớn cho
việc sử dụng dƣợc liệu làm nguyên liệu làm thuốc chữa các bệnh nan y. Xu thế tất yếu
là kết hợp hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại nhằm giải quyết những khó khăn
của Y học. Trong những năm gần đây, xu hƣớng quay trở lại sử dụng các sản phẩm
thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc để phòng và điều trị bệnh đang ngày càng trở nên thịnh
hành trên thế giới.
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong dƣợc liệu có tác dụng
chống oxy hóa và các gốc tự do. Apigenin là một flavonoid thiên nhiên có hoạt tính
sinh học đƣợc chiết xuất từ cúc hoa vàng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy apigenin là
một chất chống oxy hóa, có đặc tính chống viêm và chống ung thƣ [13], [18]. Nó có
thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thƣ bằng cách bắt giữ các chu kỳ tế bào ở giai
đoạn G2/M. Apigenin có khả năng gây ảnh hƣởng trên nhiều loại phân tử. Hầu hết tác
dụng qua trung gian ức chế nitric oxid synthase-2 (NOS2), yếu tố cảm ứng tăng áp oxy
(hypoxia inducible factor 1α HIF-1α), lipoxygenase, cyclooxygenase-2 (COX-2) và
yếu tố tăng sinh mạch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF) [5], [18].
Cây cúc hoa vàng đƣợc trồng nhiều ở nƣớc ta từ hàng nghìn năm trƣớc lấy hoa
dùng chữa các chứng nhức đầu, đau mắt, chảy nƣớc mắt, cao huyết áp, sốt… [6], [13],
[17]. Ngoài ra, cúc hoa vàng đƣợc sử dụng kết hợp trong cái bài thuốc chữa hƣ nhƣợc
thần kinh, chữa đinh râu, viêm màng tiếp hợp dị ứng… [6]. Trong DĐVN, DĐTQ

cũng có chuyên luận riêng về cúc hoa vàng, tuy nhiên lại không đề cập đến thành phần
apigenin. Hiện nay, nguồn gốc và chất lƣợng dƣợc liệu đang rất khó quản lý do còn
gặp rất nhiều khó khăn, thiếu những dữ liệu chuẩn làm cơ sở nhận biết, xác định dƣợc
liệu.


2

Để góp phần bổ sung bộ dữ liệu chuẩn dƣợc liệu cho Dƣợc điển Việt Nam phục
vụ công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khảo sát
hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao” nhằm các mục tiêu:
1. Khảo sát và thẩm định phương pháp định lượng Apigenin bằng HPLC.
2. Khảo sát sơ bộ hàm lượng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị
trường hiện nay.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cúc hoa vàng
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khác: kim cúc, hoàng cúc, dã cúc, cam
cúc, khổ ý, bioóc kim (Tày).
Tên khoa học: Chrysanthemum indicum L.
Tên đồng nghĩa: Chrysanthemum procumbens
Lour.
Họ: Cúc (Asteraceae)
Đặc điểm thực vật: Cây thảo, sống hàng
năm hay sống dai, cao 20-50 cm. Thân mọc

thẳng, nhẵn, có khía dọc, phân cành ở ngọn.

Hình 1.1: Cúc hoa vàng

Lá thơm, mọc so le, hình bầu dục, có thùy sâu, không lông, mép có răng cƣa nhọn,
không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dƣới nhạt, cuống lá ngắn, có tai ở gốc.
Cụm hoa hình đầu, màu vàng hơi nâu, đôi khi còn đính cuống; đƣờng kính 0,5
cm đến 1,2 cm. Tổng bao gồm 4 đến 5 hàng lá bắc, mặt ngoài màu xanh hơi xám
hoặc nâu nhạt, ở giữa hai bên mép rất nhạt và khô xác. Có 2 loại hoa: Hoa hình
lƣỡi nhỏ một vòng, đơn tính, không đều ở phía ngoài; nhiều hoa hình ống, đều,
mẫu năm, lƣỡng tính ở phía trong. Chất nhẹ, mùi thơm, vị đắng. Quả bế trụi. Hoa
thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau. Hoa hái về đem đổ rồi phơi 3 - 4
nắng đến khô. Nếu trời râm, phải sấy than hoặc lửa nhẹ [3], [5], [6], [18].
1.1.2. Phân bố
Cúc hoa vàng phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới Bắc bán cầu:
Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ấn Độ, Cúc hoa vàng
đƣợc trồng làm cây cảnh, và từ lâu đƣợc trồng làm thuốc ở Trung Quốc, Nhật Bản
[16], [22].


4

Ở Việt Nam, Cúc hoa vàng đƣợc trồng từ lâu đời. Cúc hoa vàng đƣợc dùng làm
thuốc hay ƣớp chè, nấu rƣợu và đƣợc trồng nhiều ở các làng Nghĩa Trai (Hƣng
Yên), Nhật Tân và Tế Tiêu (Hà Nội)… [16], [17].
1.1.3. Thành phần
Trong cúc hoa vàng có chứa tinh dầu, carotenoid, các acid amin, vitamin A,
flavonoid và một số loại sesquiterpen.
- Tinh dầu: α-pinen, β-pinen, sabinen, mycren, α-terpinen, p.cymen, cineol, αthuyon, chrysanthenon, borneol, chrysanthetriol, linalyl acetat, germacren D,
nerolidol, γ-cadinen, α-selinen, caryophyllen, mourolol [13], [17].

- Thành phần chủ yếu tinh dầu cúc hoa vàng một số vùng Trung Quốc: 1,8-cineol
(0,62-7,34%), (+)-(1R,4R)-camphor (0,17-27,56%), caryophyllen oxid (0,54-5,8%),
beta-phellandren (0,72-1,87%), (-)-(1S,2R,4S)-borneol acetat (0,33-8,46%), 2methyl-6-(p-tolyl)hept-2-en (0,3-8,6%), 4,6,6-trimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2ylacetat (0,17-26,48%) và hexadecanoic acid (0,72-15,97%) [13], [17].
- Carotenoid: chrysanthemoxanthin [13], [17].
- Sesquiterpen: arteglasin A, yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, cumambrin A,
angeloylajadin, tuncfulin [17].
- Flavonoid: luteolin, quercetin, apigenin, luteolin-7-O-beta-D-glucopyranosid,
apigenin-7-O-β-D-galactopyranosid,

chrysanthemin,

apigenin-7-O-glucosid,

acacilin, baicalin, luteolin-7-O-β-D-glucopuranosid, 4’-methoxyluteolin-7-O-β-Dglucopyranosid, cyanidin-3-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosid) [17].
- Acid phenol: acid clorogenic, acid quinic-4-O-cafeciat, acid quinic-3,4-di-Ocafciat [17].
- Acid amin: adenin, cholin, stachydrin [17].
- Thành phần khác: indicumenon, β- sitosterol, α- amyrin, friedelin, sesamin, adenin,
cholin, stachydrin và vitamin A [17].


5

1.1.4. Tác dụng của Cúc hoa vàng
Cúc hoa vàng có vị ngọt, hơi đắng, tính bình hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt,
giải cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc [6]. Cúc hoa vàng có nhiều tác dụng
dƣợc lý nhƣ tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống gốc tự do, kháng khuẩn,
hạ huyết áp và có hoạt tính gây phản vệ [6], [10]. Cúc hoa vàng có tác dụng chống
viêm thực nghiệm trên chuột cống trắng [10]. Dịch chiết ethanol cúc hoa vàng có
tác dụng chống viêm, điều hòa miễn dịch dịch thể và tế bào và hoạt động thực bào
đơn nhân [6].

Cúc hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp trên động vật thí nghiệm (chó), cũng
nhƣ có tác dụng tốt đối với bệnh nhân cao huyết áp. Khả năng làm hạ huyết áp của
cúc hoa vàng có thể là hiệu quả của tác dụng ức chế phản xạ vận mạch có nguồn
gốc trung tâm và tác dụng ức chế adrenalin [6].
Bài thuốc chứa cúc hoa vàng cũng đƣợc dùng để điều trị cho bệnh nhân suy
nhƣợc thần kinh loại hƣng phấn tăng, đa số có nguyên nhân do sang chấn tinh thần.
Phƣơng pháp chữa là hạ hƣng phấn, an thần, phối hợp với châm cứu đã đạt kết quả
tốt [6].
Cúc hoa vàng thƣờng đƣợc dùng để chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não,
viêm mủ da, viêm vú, chóng mặt, cao huyết áp, đau mắt đỏ, chảy nhiều nƣớc mắt,
viêm gan. Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rắn cắn, chấn thƣơng bầm dập [5], [6].
1.2. Tổng quan về Apigenin
1.2.1. Tính chất

Công thức phân tử C15H10O5
Phần trăm thành phần: C 66,67%, H
3,73%, O 29,60% [13].
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: 5,7Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1Hình 1.2: Công thức cấu tạo Apigenin


6

benzopyran-4-on [13].
Tên khác: 4',5,7-Trihydroxyflavon; 2-(p-hydroxyphenyl) -5,7- dihydroxychromon
Trọng lƣợng phân tử: 270,24
Điểm nóng chảy: 345-350°C. Điểm sôi: 555,51°C ở 760 mmHg
Hấp thụ tối đa: UV tối đa (Ethanol): 340 nm
Apigenin (4',5,7-trihydroxyflavon) là một flavonoid tự nhiên, thuộc nhóm flavon
đƣợc tìm thấy trong nhiều loài thực vật, nhƣng rau mùi tây, cần tây và cúc hoa là
những nguồn phổ biến nhất. Nó là một chất rắn kết tinh màu vàng [6], [17], [18].

Độ hòa tan: Hòa tan trong dimethylsulfoxid (27 mg/ml) hoặc dung dịch KOH
1M (50mg/ml). Thực tế không tan trong nƣớc, tan vừa phải trong rƣợu nóng. Hệ số
phân bố (log K) đƣợc tính từ tỷ lệ hòa tan của apigenin trong n-octanol và nƣớc là
2,87 [6], [17], [18].
Một số glycosid tự nhiên hình thành bởi sự kết hợp của apigenin với đƣờng
bao gồm: Apiin, Apigetrin (apigenin-7-glucosid), Vitexin (apigenin-8-C-glucosid),
Isovitexin (apigenin-6-C-glucosid hoặc homovitexin, saponaretin), Rhoifolin
(apigenin-7-O-neohesperidosid)... Có thể thu đƣợc apigenin từ apiin bằng cách đun
sôi với axid, từ apigenin-7-glucosid thủy phân bằng enzyme với emulsin hoặc đun
với H2SO4 15% [6], [17], [18].
1.2.2. Tác dụng của Apigenin
Apigenin ức chế sự hoạt động của collagenase liên quan đến viêm khớp dạng
thấp (RA) và nội độc tố tạo nitric oxid (NO) trong đại thực bào.Apigenin cũng giảm
nội độc tố biểu hiện trên cyclooxygenase-2 (COX-2). Tóm lại, những kết quả cho
thấy apigenin có hoạt tính chống viêm quan trọng có liên quan đến ngăn chặn nitric
oxide qua trung gian COX-2 và các bạch cầu đơn nhân, apigenin có thể điều trị các
bệnh viêm nhiễm [18], [9].
Apigenin có hiệu quả ức chế sự tiến triển ung thƣ tuyến tiền liệt ở chuột bởi
suy giảm IGF-I (Insulin - like growth factors - các yếu tố sinh trƣởng tƣơng tự
insulin). Nồng độ IGF-I trong máu cao sẽ làm giảm tiết GH qua cơ chế điều hòa


7

ngƣợc. IGF-I đóng vai trò quan trọng đối với việc điều tiết các hoạt động của tế bào
không những trong trạng thái sinh lý mà còn trong các quá trình bệnh lý kể cả ung
thƣ [9].
Apigenin hoạt động hoạt hóa vận chuyển monoamin, một trong số ít các chất
có tác dụng này, đã cải thiện nhiều rối loạn bệnh học thần kinh, đặc biệt là phụ
thuộc cocain, thông qua cách điều chỉnh các hoạt động vận chuyển oxidase [9], [18].

Apigenin cũng có thể kích thích tế bào thần kinh ngƣời trƣởng thành, bằng
cách thúc đẩy sự phân hóa tế bào thần kinh, có thể điều trị các bệnh thần kinh, rối
loạn và bị tổn thƣơng, nghiên cứu trên chuột và ảnh hƣởng trên ngƣời vẫn chƣa
đƣợc chứng minh [9].
1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân
bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của các chất này với
pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các
yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector và đƣợc ghi
lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của
chất phân tích [1].
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký
khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc
ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1].
1.3.2. Máy HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động,
bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đƣa mẫu vào
pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi [1].


8

Hệ thống cấp
dung môi

Hệ thu nhận xử lý dữ
liệu (máy ghi, máy tính)

Bơm

Detector

Bộ phận
tiêm mẫu

Cột sắc ký

Thải

Hình 1.3: Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC
1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký
1.3.3.1. Thời gian lưu tR
Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến
detector.Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là
hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất [1].
Thời gian chết tM là thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ.
Thời gian lƣu hiệu chỉnh t’R = tR– tM.
1.3.3.2. Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột. Hệ số k’ còn đƣợc
gọi là hệ số phân bố khối lƣợng giữa 2 pha:
k’ =

t'R tR - tM
=
tM
tM

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ V S/VM.
Thƣờng lựa chọn điều kiện sắc ký để k’ = 1 – 5 là tốt nhất [1].
1.3.3.3. Hệ số chọn lọc α
Hệ số chọn lọc  đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.
=

k'2 tR2 - tM
=
k'1 tR1 - tM

Thƣờng chọn  dao động từ 1,05 – 2. Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài [1].


9

1.3.3.4. Độ phân giải Rs
Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc
ký:
RS =
Trong đó:

2(tR,B - tR,A)
[1]
WB + WA

RS: độ phân giải
tR,A , tR,B: thời gian lƣu chất A, B
WA, WB: lần lƣợt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic
RS  1,5 thì 2 pic coi nhƣ tách nhau hoàn toàn

1.3.3.5. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, đƣợc tính theo công thức:
AF =

W1/20
2a

Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic đƣợc đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đƣờng hạ vuông góc từ đỉnh pic đến mép đƣờng
cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic [1].
Trong định lƣợng yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2
1.3.3.6. Số đĩa lý thuyết
Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý
thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa
pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký
[1].
tR
tR 2
N = 16 [ ]2= 5,54 [
]
W
W1/2
Trong đó: W: là chiều rộng pic ở đáy pic
W1/2: là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
1.3.4. Ứng dụng của HPLC
1.3.4.1. Định tính
Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:


10

 So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian
lƣu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký [1].
 So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm
chuẩn đối chiếu [1].
 So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector
DAD (có hệ số match  0,995) [1].
 Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức

(IR) hoặc số khối (MS) [1].
1.3.4.2. Định lượng
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 3 phƣơng pháp định lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký:
-

Phƣơng pháp chuẩn ngoại

-

Phƣơng pháp chuẩn nội

-

Phƣơng pháp thêm chuẩn
Trong khuôn khổ khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng phápthêm
chuẩn.
Ƣu điểm của phƣơng pháp thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ

đƣợc sai số do các yếu tố ảnh hƣởng, đặc biệt là ảnh hƣởng của quá trình xử lý mẫu

(chiết xuất, tinh chế các chất từ dạng bào chế…) [1].
Tiến hành :
Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.
Thêm vào mẫu thử những lƣợng đã biết của chất chuẩn tƣơng ứng với các
thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều
kiện. Nồng độ chƣa biết CX của mẫu thử đƣợc tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ
ΔC (lƣợng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) pic ΔS
theo công thức :


11

CX = SX

ΔC
ΔS

Có thể tính toán nồng độ CX của mẫu thử theo một công thức khác: Tiến hành
sắc ký một mẫu thử và mẫu thử đã đƣợc thêm chuẩn nhƣ trên.Sử dụng một pic
không muốn định lƣợng của mẫu thử nhƣ là một chuẩn nội [1].
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)
Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, đƣợc dùng
phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190
– 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ
đƣờng kính 1 mm, chiều dài 10 mm. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau
đó đƣợc tách ra thành các bƣớc sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã
tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser.Mỗi diod nhạy với một bƣớc sóng nhất
định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bƣớc sóng khác nhau cùng một lúc.
Thông thƣờng, chỉ có một hoặc hai bƣớc sóng đƣợc theo dõi trong quá trình chạy
sắc ký. Theo dõi hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic [1].

Hình 1.4: Cấu tạo detector mảng diod (DAD)
Quang phổ và sắc ký đồ có thể đƣợc biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ
thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh
detector đo ở bƣớc sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho
đồ thị 3D: độ hấp thụ, bƣớc sóng và thời gian [1].


12

Ứng dụng: Đầu dò DAD cho phép lựa chọn bƣớc sóng phù hợp nhất cho phân
tích, có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của
các chất, ngoài ra detector DAD dùng để xác định độ tinh khiết của pic [1].
1.3.6. Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin
-

Các nghiên cứu đã thực hiện:

STT
1

Tên nghiên cứu

Nội dung

Nghiên cứu chiết - Chiết xuất bằng EtOH

TLTK
[14]

xuất, phân lập, tinh - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
chế Linarin trong với pha động khai triển Cloroform:
Cúc hoa vàng

MeOH: H20 (5 : 1 : 0,1)
- Phân lập: bằng sắc ký cột
- Tinh chế: bằng phƣơng pháp kết
tinh

2

Định tính, định

- Cột: RP 18 (250mm x 4mm; 5µm)

lƣợng Linarin trong

- λ = 334 nm

Cúc hoa vàng bằng

- Pha động: MeOH : acid acetic 4%

HPLC

( 52 : 48)

[10]

- Thể tích tiêm: 20 µL

3

Nghiên cứu chiết - Chiết siêu âm tần số 60 MHz; dung
xuất Flavonoid toàn môi: ethanol 50%; nhiệt độ: 600C;
phần trong Cúc hoa chiết 2 lần với tỷ lệ dung môi/dựợc
vàng

liệu mỗi lần 10/1; thời gian chiết: 60
phút/lần
- Hàm lƣợng flavonoid toàn phần đạt
12,54 mg/g

[8]


13

4

Định lƣợng

- Cột: Phenomenex GenimiRP - C18

Apigenin trong Cúc

- λ = 338 nm

hoa vàng bằng
HPLC

[7]

- Pha động: Acetonitril: acid formic
0,1 % (40:60)
- Thể tích tiêm: 20 µL
- Hàm lƣợng Apigenin: 0,0178 %

5

Xây dựng quy trình

- Dung dịch đệm borat kiềm pH =

định lƣợng

8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế

Apigenin trong

15 kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt

dƣợc liệu Bán chi

độ cột mao quản 25oC, thời gian điện

liên bằng phƣơng

di 15 phút

pháp điện di mao

- λ = 268 nm

quản

- Hàm lƣợng Apigenin: 1,80 – 3,10

[9]

mg/g

Hiện nay các tài liệu dƣợc điển: Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Nhật…chúng tôi
nhận thấy chƣa có tài liệu nào công bố bổ sung phƣơng pháp định lƣợng Apigenin
trong Dƣợc liệu. Vì vậy cần thực hiện khảo sát để có phƣơng pháp định lƣợng phù
hợp, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Dựa trên nghiên cứu “Định lượng Apigenin
trong Cúc hoa vàng bằng HPLC” của nhóm tác giả Nguyễn Minh Chính, Nguyễn
Trọng Điệp, Đào Văn Đôn, Hoàng Việt Dũng, Nguyễn Văn Long, Đoàn Cao Sơn
[5] vừa là tiền đề vừa làm cơ sở cho chúng tôi phát triển và mở rộng nội dung của
nghiên cứu này. Chúng tôi khảo sát hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng ở các
mẫu đang lƣu hành trên thị trƣờng Hà Nội bằng các điều kiện sắc ký khác nhau. Từ
đó, có thể thu đƣợc kết quả chính xác, có ý nghĩa thực tiễn để bổ sung vào tiêu
chuẩn định lƣợng Apigenin trong chuyên luận Cúc hoa vàng của DĐVN.


14

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu: Hoa của cây Cúc hoa vàng (Chryranthemum indicium Lour)

đã đƣợc phơi khô. Nguyên liệu đƣợc bảo quản nơi khô ráo, đƣợc định tính về hóa
học và sơ bộ kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN IV, sau đó đƣợc nghiền thành bột
thô mịn hoặc bột nửa mịn theo quy định của DĐVN IV trƣớc khi tiến hành chiết lấy
Apigenin. Các mẫu đƣợc mua tại cơ sở chế biến dƣợc liệu An Bình, cơ sở Nguyễn
Thế Viễn – Huyện Văn Lâm Hƣng Yên và tại các cửa hàng khác nhau trên phố Lãn
Ông – Hà Nội vào tháng 03/2016.
2.1.2. Hóa chất, dung môi
Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết
phân tích hoặc HPLC.
- Dung môi và hóa chất: ethanol, methanol, aceton, nƣớc cất, acetonitril, acid
phosphoric…
-

Chất chuẩn: chuẩn làm việc Apigenin – hàm lƣợng 98,5% (do Viện Hóa sinh

biển thiết lập).
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
-

Nồi cách thủy

-

Máy li tâm EBA 21

-

Máy chiết siêu âm Elma

-

Máy cất thu hồi dung môi

-

Cân phân tích Sartorius 0,1 mg

-

Máy lọc hút chân không, màng lọc 0,45 µm

-

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1200 series kết nối
DAD/FLD

-

Tủ sấy, phễu lọc thủy tinh, giấy lọc


15

-

Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, bơm tiêm

-

Bộ lọc dung môi hút chân không, màng lọc 0,45 µm

-

Bình định mức các loại: 10 ml, 20 ml, 25 ml, 100 ml, 1000 ml

-

Cốc có mỏ các loại: 50 ml, 100 ml, 200 ml, 1000 ml

2.2. Nội dung nghiên cứu
-

Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn Apigenin với

các hợp chất khác trong dịch chiết Cúc hoa vàng.
-

Thẩm định các điều kiện định lƣợng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng.

- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lƣợng Apigenin có trong các mẫu Cúc hoa vàng
trên thị thƣờng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử
2.3.1.1. Chiết xuất
Vì Apigenin tan tốt trong MeOH nên chúng tôi quyết định chọn MeOH làm dung
môi chiết và pha mẫu chuẩn, mẫu thử.
Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn xử
lý mẫu theo phƣơng pháp chiết siêu âm.
2.3.1.2. Pha dung dịch thử
Bổ sung MeOH vào cốc có mỏ chứa cắn sau khi bốc hơi dung môi, sau đó

chuyển sang bình định mức bổ sung MeOH vừa đủ tới vạch.
2.3.2. Pha dung dịch chuẩn
Pha dung dịch chuẩn gốc Apigenin, từ chuẩn gốc pha dung dịch chuẩn Apigein
ở nồng độ phù hợp, pha các dung dịch chuẩn thứ cấp từ dung dịch chuẩn gốc để
thẩm định độ tuyến tính.
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
2.3.3.1. Dung môi chạy pha động
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký, nó quyết
định thời gian lƣu giữ của chất phân tích và hiệu quả tách sắc ký.


16

Cặp dung môi đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là MeOH :
H2O; ACN : H2O. Mặt khác Apigenin có 2 nhóm –OH gắn vào nhân benzo - γ pyron ở vị trí 5, 7 và một nhóm –OH phenol nên Apigenin có tính acid. Do đó, để
định lƣợng tốt thì pha động cần bổ sung thêm acid (H3PO4) sẽ giảm thiểu đƣợc hiện
tƣợng kéo đuôi.
2.3.3.2. Chọn cột sắc ký
Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với
nhiều tính ƣu việt. Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa
vàng, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phƣơng pháp tách chiết, định
lƣợng một số thành phần trong Cúc hoa vàng, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố
pha đảo trong nghiên cứu này.
Trong định lƣợng sắc ký pha đảo, cột thƣờng dùng là C8 và C18, có kích thƣớc
hạt nhồi là 5 µm hoặc 10 µm, với chiều dài cột là 15 cm hoặc 25 cm. Chúng tôi tiến
hành khảo sát trên các loại cột trên.
2.3.3.3. Chọn tốc độ dòng
Qua các tài liệu tham khảo [5], [6], [9], [10], [21] chúng tôi thƣờng thấy tốc độ
dòng đƣợc khảo sát là 0,8 ml/phút và 1,0 ml/phút. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo
sát trong khoảng 0,7 - 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời

gian lƣu tối ƣu.
2.3.3.4. Chọn bước sóng phát hiện
Do cấu trúc Apigenin có vòng thơm nên có khả năng hấp thu quang phổ tử
ngoại. Xác định cực đại hấp thụ dựa vào phổ UV trong khoảng 190 – 800 nm.
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC
Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa vàng bằng phƣơng
pháp HPLC đƣợc thẩm định thông qua các chỉ tiêu:
- Độ đặc hiệu
- Độ tƣơng thích hệ thống sắc ký
- Độ lặp lại của phƣơng pháp
- Độ tuyến tính và khoảng xác định