Nghiên cứu định lượng levetiracetam trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LIÊN
Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT
TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LIÊN
Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT
TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy
2. ThS. Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện:

Trung tâm đánh giá tƣơng
đƣơng sinh học - Viện kiểm
nghiệm thuốc TW

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học tôi đã được Ban giám hiệu
nhà trường và các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy và
giúp đỡ trong suốt quá trình học tập tại trường. Sau một thời gian thực hiện đề tài
với rất nhiều nỗ lực và cố gắng, khi khóa luận này được hoàn thành là lúc tôi xin
được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn
và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm
ơn tới PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy và Ths. Tạ Mạnh Hùng- Giám đốc Trung tâm
Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, là những
người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
và Trung tâm Đánh giá Tƣơng đƣơng sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ƣơng đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài tại đây. Tôi xin tỏ lòng
biết ơn đến toàn thể các anh, chị trong Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học
đã tạo điều kiện giúp đỡ, luôn tận tình giải đáp những thắc mắc trong công việc và
đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình tôi, cùng toàn thể bạn
bè, những người luôn sát cánh, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học
tập và nghiên cứu.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Hà Thị Liên


MỤC LỤC
Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN …………………………………………………

3

1.1.LEVETIRACETAM ……………………………………………………..

3

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa…………………………………

3

1.1.2. Tác dụng dƣợc lý và dƣợc động học…………………………………..

4

1.1.3. Chỉ định - chống chỉ định……………………………………………….

4

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trƣờng………………………………………

5

1.1.5. Các phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam…………………………

5

1.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO…………………………………….

7

1.2.1. Khái niệm……………………………………………………………….

7

1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC……………………………………

8

1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký…………………………

8

1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký……………………

11

1.2.5. Phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC………………………………..

14

1.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC

15

1.3.1. Khái niệm………………………………………………………………..

15

1.3.2. Các chỉ tiêu thẩm định………………………………………………….

15

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19


2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

19

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……………………………………….

19

2.1.2. Dụng cụ, máy móc, thiết bị……………………………………………..

20

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………………..

20

2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp HPLC định lƣợng LEVET trong huyết
tƣơng…………………………………………………………………………..

20

2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích……………………………………

21

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………….

21

2.3.1. Chuẩn bị mẫu huyết tƣơng tự tạo chứa LEVET……………………...

21

2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích……………………………………

22

2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích…………………………………..

23

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

28

3.1. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LEVET TRONG HT

28

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn………………….

28

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện tách chiết Levetiracetam....................

32

3.1.3. Quy trình phân tích Levetiracetam trong huyết tƣơng………………

33

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH........................................

34

3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu..........................................................................

34

3.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính......................................................

36

3.2.3. Giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ).........................................................

36

3.2.4. Độ đúng - Độ chính xác…………………………………………………

37

3.2.5. Tỷ lệ thu hồi..............................................................................................

38

3.2.6. Độ ổn định của hoạt chất trong HT……………………………………

39

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................

44

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................

44

4.2. KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,
STT
Ý nghĩa
chữ viết tắt
1

CV

Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

2

DĐH

Dược động học

3

ĐVTN

Động vật thí nghiệm

4

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

5

HQC

Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao
(High Quality ControlSample)

6

HT

Huyết tương

7

IS

Nội chuẩn (Internal Standard)

8

LCMS

Sắc ký lỏng khối phổ

(Liquid Chromatography Mass Spectrometry)

9

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification)

10

LQC

Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp
(Lower Quality Control sample)

11

MQC

Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình

12

NTN

Người tình nguyện

13

PA

Tinh khiết phân tích (Pure Analysis)

14

QC

Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control sample)

15

SKĐ

Sắc ký đồ

16

SPE

Chiết pha rắn (Solid-Phase Extration)

17

TKTW

Thần kinh trung ương

18

TĐSH

Tương đương sinh học

19

US-FDA

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ
(The United States Food and Drug Administration)

20

UV-VIS

Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT

6

2.1

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

19

2.2

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

19

2.3

Các mẫu HT trắng dùng trong nghiên cứu

19

2.4

Các thiết bị đã dùng trong nghiên cứu

20

2.5

Thiết bị HPLC

20

2.6

Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn trong HT

22

2.7

Cách chuẩn bị mẫu QC trong HT

22

2.8

Chuẩn bị mẫu QC xác định độ đúng

24

3.1

Độ đúng của các mẫu thuộc các đường chuẩn

36

3.2

Kết quả xác định giá trị LLOQ

37

3.3

Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày

37

3.4

Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày

38

3.5

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của LEVET

38

3.6

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS

39

3.7

Kết quả độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn

39

3.8

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn

40

3.9

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ 2ºC - 8ºC

40

3.10

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

41

3.11

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

42

3.12

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau xử lý (trong

43

autosampler)


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình

Nội dung

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của levetiracetam

3

3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của LEVET

28

3.2

SKĐ LEVET và nội chuẩn amoxicillin

29

3.3

SKĐ LEVET và nội chuẩn atenolol

29

3.4

SKĐ LEVET và nội chuẩn paracetamol

30

3.5

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung

31

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 15 : 85 (tt/tt)
3.6

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung

31

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 6 : 94 (tt/tt)
3.7

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung

32

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 4 : 96 (tt/tt)
3.8

SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng ACN

32

3.9

SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng acid HClO4

33

3.10

SKĐ mẫu HT sau khi chiết lỏng – lỏng với cloroform

33

3.11

SKĐ mẫu HT trắng

34

3.12

SKĐ mẫu HT trắng có chuẩn nội paracetamol

35

3.13

SKĐ mẫu chuẩn LEVET nồng độ 0,25 µg/mL có IS

35


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Động kinh là một tình trạng bệnh lý của não do nhiều nguyên nhân khác nhau
gây ra với bệnh cảnh rất phức tạp và đa dạng. Bệnh này có thể gặp ở mọi tuổi, mọi
giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc bệnh động
kinh trên thế giới khoảng 0,5% dân số, thay đổi tùy theo từng quốc gia, từng vùng,
từng dân tộc. Tại Việt Nam khoảng 2% dân số mắc bệnh và trong đó có đến 60% số
bệnh nhân là trẻ em [8] [9] [12] [17]. Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn
Quốc tế chống động kinh ILAE (International League Against Epilepsy) xác định:
“Động kinh là tình trạng tái diễn ít nhất hai cơn động kinh trở lên cách nhau trên 24
giờ, không phải do sốt cao và các nguyên nhân cấp tính khác như các rối loạn
chuyển hóa, ngừng thuốc hay rượu đột ngột gây nên” [17] [23].Bệnh động kinh
đang được xem là vấn đề thời sự với chuyên ngành tâm thần thần kinh. Mặc dù là
một nhóm bệnh lý rất nặng của hệ thần kinh nói chung, của não nói riêng, tuy nhiên
nếu điều trị sớm và phù hợp, số trường hợp khỏi bệnh chiếm tỷ lệ cao [1] [4] [8].
Trên thế giới, động kinh có thể được điều trị bằng bằng thuốc kháng động kinh hoặc
phẫu thuật đối với một số cá thể [12]. Tại Việt Nam số lượng bệnh nhân động kinh
được điều trị thành công bằng phương pháp phẫu thuật còn rất ít, hầu hết phải dùng
thuốc kháng động kinh kéo dài.
Levetiracetam (C8H14N2O2, M =171,19 g/mol) là dẫn chất của pyrolidin, dùng để
điều trị bệnh động kinh có hiệu quả và mới được Cơ quan quản lý Thuốc và thực

phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép đăng ký lưu hành năm 2008. Levetiracetam
(LEVET) có cấu trúc hóa học không giống với các thuốc điều trị động kinh khác
hiện có và là thuốc chống co giật mới trên thị trường Dược phẩm Việt Nam nên chi
phí điều trị hiện tương đối cao. Để giảm gánh nặng điều trị cho bệnh nhân và cộng
đồng, một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất các
thuốc generic chứa dược chất LEVET. Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu về sinh khả dụng
và tương đương sinh học các thuốc này là cần thiết để chứng minh các thuốc


2

generic có hiệu quả điều trị tương đương với thuốc biệt dược gốc. Dựa trên điều
kiện trang thiết bị hiện có và tham khảo tài liệu [13] [14] [16] [22], chúng tôi đã tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng Levetiracetam trong huyết tương người
bằng phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu xây dựng một phương
pháp phân tích LEVET trong huyết tương có đủ độ nhạy, độ chính xác và phù hợp
cho các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học
(TĐSH) các thuốc chứa hoạt chất levetiracetam. Để đạt được mục tiêu này, đề tài
thực hiện các nội dung:
1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng levetiracetam trong huyết tương
bằng phương pháp HPLC.
2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo quy định của US-FDA.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. LEVETIRACETAM
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
1.1.1.1. Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C8H14N2O2
- Khối lượng phân tử: 171,19372 g/mol.
- Tên khoa học: (-)-(S)-α-Ethyl-2-oxo-1-pyrrolidin acetamid [21]
Công thức cấu tạo của LEVET được trình bày ở Hình 1.1.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của levetiracetam [21]
1.1.1.2. Tính chất hóa lý
- Levetiracetam là chất bột, màu trắng đến trắng tinh, không mùi, vị đắng.
- Độ tan: Tan nhiều trong nước (104,0 g/100 mL), dễ tan trong cloroform (65,3
g/100 mL) và methanol (53,6 g/mL), tan trong ethanol (16,5 g/mL), ít tan trong
acetonitril (5,7 g/100 mL) và thực tế không tan trong n-hexan [18].
1.1.2. Tác dụng dƣợc lý và dƣợc động học
1.1.2.1. Dược lý và cơ chế tác dụng
Levetiracetam, dẫn xuất pyrolidin, là một thuốc chống co giật có cấu trúc hóa
học không liên quan đến các thuốc điều trị động kinh khác hiện có. Cơ chế tác dụng


4

của LEVET chưa được biết rõ. Ở động vật, LEVET không bảo vệ chống lại được
cơn co giật đơn độc do dòng điện hoặc hóa chất. Thuốc chỉ bảo vệ rất ít kích thích
dưới mức tối đa và các test ngưỡng, nhưng bảo vệ được cơn co giật toàn thể thứ
phát sau co giật cục bộ do hai hóa chất gây co giật tạo ra, có những đặc tính giống
như phức hợp co giật cục bộ thứ phát toàn thể ở người. LEVET cũng có đặc tính ức
chế ở mô hình chuột đã được làm giảm ngưỡng kích thích, tương tự người bị cơn
động kinh cục bộ phức hợp.
LEVET không có ái lực với các thụ thể benzodiazepin, acid gama-aminobutyric
(GABA), glycin hay N-methyl-D-aspartat (NMDA). Thuốc tác dụng thông qua một
vị trí gắn đặc hiệu của mô não, đó là protein 2A của túi synap (protein SV2A). Sự
gắn kết này có thể hồi phục, bão hòa và có tính chất chọn lọc lập thể. LEVET chỉ

gắn khu trú vào màng tế bào synap ở hệ TKTW mà không gắn vào các mô ngoại vi.
LEVET ức chế sự bùng phát nhưng không ảnh hưởng tới kích thích thần kinh bình
thường, vì thế thuốc ngăn ngừa có chọn lọc tính đồng bộ quá mức của sự bùng phát
dạng động kinh và sự lan truyền của cơn động kinh [2].
1.1.2.2. Dược động học
Khi dùng đường uống, thuốc nhanh chóng hấp thụ từ ống tiêu hóa với sinh khả
dụng xấp xỉ 100%, nồng độ tối đa trong máu thường đạt được trong vòng 1,3 giờ và
trạng thái cân bằng đạt được sau 2 ngày. Tỉ lệ thuốc liên kết protein huyết tương
thấp, ít hơn 10%. Thể tích phân bố khoảng 0,7 lít/kg. Khoảng 25% liều dùng được
hydroxy hóa thành chất chuyển hóa không có hoạt tính. LEVET không có ái lực cao
với các CYP isoenzym và cũng không ức chế các isoenzym này. Khoảng 95% liều
dùng được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng nguyên vẹn ban đầu và chất chuyển
hóa. Nửa đời thải trừ huyết tương của LEVET khoảng 6-8 giờ ở người lớn và trẻ em
trên 12 tuổi, có thể ngắn hơn ở trẻ nhỏ. LEVET được bài xuất qua sữa mẹ, thuốc có
thể được thải trừ ra khỏi cơ thể nhờ thẩm tách máu [2].
1.1.3. Chỉ định - chống chỉ định
1.1.3.1. Chỉ định


5

Levetiracetam là một dẫn chất tương tự piracetam, được sử dụng trong điều trị động
kinh. LEVET dùng phối hợp với các thuốc khác để:
- Điều trị cơn động kinh cục bộ, có hoặc không kết hợp với cơn động kinh
toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ em từ 1 tháng tuổi trở lên.
- Điều trị cơn động kinh rung giật cơ ở người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên
bị bệnh động kinh rung giật cơ thiếu niên.
- Điều trị cơn động kinh toàn thể co cứng - co giật tiên phát ở người lớn và trẻ
em từ 12 tuổi trở lên bị bệnh động kinh toàn thể tiên phát.
Ngoài ra, LEVET có thể được sử dụng đơn độc trong điều trị cơn động kinh cục

bộ, có hoặc không kết hợp với cơn động kinh toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ
em từ 16 tuổi trở lên [2].
1.1.3.2. Chống chỉ định
Quá mẫn với LEVET hoặc các dẫn chất của pyrolidon [2].
1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trƣờng
Các chế phẩm LEVET trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng
250, 500, 750 hoặc 1000 mg; viên nén giải phóng kéo dài: 500, 750 mg; dung dịch
uống 100 mg/mL (chai 150 mL, 300 mL); dung dịch pha truyền 100 mg/mL x 5 mL
[2]. Theo thống kê của Cục Quản lý dược và Tổng công ty dược Việt Nam hiện trên
thị trường dược phẩm Việt Nam có hơn 50 sản phẩm thuốc chứa hoạt chất LEVET,
toàn bộ các sản phẩm này đều chưa có số liệu chứng minh TĐSH với thuốc biệt
dược gốc Keppra do công ty U.C.B. Co., Ltd - Nhật Bản sản xuất [24].
1.1.5. Các phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam
Trong công thức cấu tạo của LEVET không có vòng thơm hay các nối đôi liên
hợp, chỉ có một số dị tố (N, O), nên hấp thụ UV-VIS kém và không có phổ huỳnh
quang. Do vậy, định lượng LEVET trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với
các detector phổ dụng như UV hoặc huỳnh quang gặp nhiều khó khăn. Hiện nay, để
định lượng LEVET trong dịch sinh học đa số các tác giả sử dụng phương pháp sắc
ký lỏng khối phổ (LC-MS). Tuy vậy, phương pháp LCMS kỹ thuật phân tích phức
tạp, thiết bị phân tích có giá trị kinh tế cao không phổ biến tại nhiều phòng thí


6

nghiệm ở nước ta. Do vậy, khó có thể áp dụng được. Một số phương pháp HPLC
định lượng LEVET trong dịch sinh học đã được công bố tuy nhiên có độ nhạy
không cao, không áp dụng được cho các nghiên cứu SKD/TĐSH thuốc LEVET.
Một số phương pháp định lượng LEVET trong HT người được trình bày ở Bảng
1.1.
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT người

Phương pháp xử lý mẫu
Chiết

Điều kiện sắc ký

lỏng - lỏng bằng - Cột Blue Orchid C18, 50 x 2 mm, 1,8 µm

ethylacetat

TLTK
[16]

- Pha động: Acetonitril : nước, tỷ lệ 20 : 80
- Chuẩn nội: Lamivudin
- Detector: MS

Chiết SPE

- Cột C18, 100 x 3 mm, 1,8 µm

[13]

- Pha động: Amoni acetat pH 3,2 : acetonitril,
tỷ lệ 20 : 80
- Chuẩn nội: Chlonazepam
- Detector: MS
Tủa protein bằng acid - Cột Rp18, 5µm, 150 x 4,0 mm

[14]

perchloric và chiết lỏng - - Pha động: Acetonitril : dung dịch đệm
lỏng với cyclohexan

KH2PO4 tỷ lệ 6 : 94
- Chuẩn nội: Không có
- Detector: UV

Tủa protein bằng MeOH,

- Cột C8, 5 µm, 150 x 4,0 mm

[22]

acetonitril, kẽm sulphat và - Pha động: MeOH : MeCN : dung dịch đệm
acid perchloric. Sau đó

phosphat chứa triethylamin, pH 6; tỷ lệ 6:5:89

chiết SPE.

- Chuẩn nội: Adenosin
- Detector: UV

Nhận xét:
-

Phương pháp 1 và 2: Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối với
detector khối phổ (UPLC-MS) có độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn (thời

7

gian lưu của LEVET là 0,8 phút và IS là 1,2 phút) thích hợp cho các nghiên
cứu DĐH của LEVET. Tuy nhiên phương pháp UPLC-MS hiện nay chỉ có
thể thực hiện được tại một số ít phòng thí nghiệm hiện đại vì thiết bị phức tạp
và chi phí phân tích cao. Do thiết bị phân tích không phổ biến nên chúng tôi
không lựa chọn phương pháp này để định lượng LEVET trong HT người.
-

Phương pháp 3: Phân tích bằng HPLC với detector UV, quy trình xử lý tương
đối phức tạp gồm 2 kỹ thuật tủa protein với acid và chiết lỏng - lỏng bằng
cyclohexan. Tuy vậy, giới hạn định lượng của phương pháp không cao (1,0
µg/mL) không phù hợp để định lượng LEVET trong HT người tham gia các
nghiên cứu SKD/TĐSH.

-

Phương pháp 4: Phân tích bằng HPLC với detector UV, có giới hạn định
lượng tốt (khoảng 0,1 µg/mL) tuy nhiên phương pháp xử lý mẫu rất phức tạp
gồm hai bước tủa protein với hỗn hợp dung môi MeOH, acid perchloric và
muối kẽm sulphat sau đó tiếp tục chiết SPE để loại tạp. Kỹ thuật chiết SPE có
chi phí cao khó áp dụng tạo các phòng thí nghiệm của nước ta.

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa
của LEVET, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng LEVET trong
HT bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS bằng cách cải tiến các phương
pháp HPLC đã được công bố của các tác giả. Phương pháp xây dựng sử dụng chất
nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp
phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm
nghiệm của Việt Nam.

1.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các


8

nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: Hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,
loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [5], [7].
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
1.2.2.1. Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh được
áp suất (thường 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn
định, phù hợp với quá trình sắc ký.
1.2.2.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung
môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hòa
tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí).
1.2.2.3. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ
thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay)
hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.
1.2.2.4. Cột sắc ký
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra
quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất,
chịu được áp suất cao tới vài trăm bar.
Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký.

Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm.
1.2.2.5. Bộ phận phát hiện
Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp, hiện nay có các loại detector sau: Detector hấp
thụ UV-VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [5], [7].
1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký
1.2.3.1. Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR
*Thời gian lưu (tR): Là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột
sắc ký, tới detertor và cho píc trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh


9

của píc. Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ, với một chất
nhất định tR là một hằng số khi tiến hành nhiều lần sắc ký trong cùng điều kiện.
Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực
(tR’), được tính bằng công thức sau:
tR’ = tR - tM.
Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.
Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì píc bị loãng, thời gian
phân tích kéo dài.
* Thể tích lưu (VR): Thể tích lưu (VR) là thể tích dung môi đi qua cột cần để di
chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho píc trên sắc ký đồ.
VR= tR×Fc
Với: Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian.
Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến
khi ra khỏi hệ thống [5], [7].
1.2.3.2. Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung
bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.

k

CS
CM

Trong đó: CS và CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất
pha tĩnh và nhiệt độ cột.Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh
càng chậm [5].
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha
và được tính theo sức chứa của cột:

k'  k 

vS Qs
t t
t'

 R  R 0
vR QM t '0
t0


10

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc
điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. Trong phân tích thường chọn cột, pha động
và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤ k ’≤8 [5], [7].
1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số
chọn lọc α :

K A k A' t( R ) A  tM



K B kB' t( R ) B  tM
Qui ước: Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α >1. Để tách riêng 2
chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [5], [7].
1.2.3.5. Hệ số đối xứng của píc F
F

W
2a

Trong đó:
W: Chiều rộng của píc đo ở 1/20 chiều cao của píc.
a: Khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh píc đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao píc [5], [7].
1.2.3.6. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:

N  16[

tR 2
tR 2
]
] hay N  5,54[
W

W
1
2

Trong đó:
W1/2: Chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của đỉnh píc.
W: Chiều rộng của píc đo ở đáy píc [5], [7].
1.2.3.7.Độ phân giải Rs của cột
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
N  16[

1.18.(t( R ) A  t( R ) B )
tR 2
t
] N  5,54[ R ]2 hoặc Rs 
W
W1
W1 2 A  W1 2 B
2


11

Trong đó:
t(R)A, t(R)B : Thời gian lưu của 2 píc liền kề nhau (A và B).
WA; WB: Độ rộng píc đo ở các đáy píc. W1/2A; W1/2B: Độ rộng píc đo ở nửa chiều
cao píc. Yêu cầu: Rs > 1, giá trị Rs tối ưu ≥ 1,5 [5], [7].
1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của

một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được
chia thành 2 loại:
- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích
thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.
- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường
là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền
hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ pha
đảo: Pha tĩnh trên nền silica (Hình 1.2) có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.2. Gốc siloxan
Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:
- R là các nhóm phân cực (ưa nước): Nhóm -OH hoặc các alkylamin -CH2-NH2,
alkyl nitril - CH2-CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân
tích các chất ít hoặc không phân cực [15].


12

- Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng
cách alkyl hóa các nhóm -OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl (-R) của
mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm -OH thân
nước được thay thế bằng các gốc -R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica
đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân
cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [5].
Tuy vậy do hiệu ứng lập thể nên những nhóm -OH tự do chưa được thay thế
trong cấu trúc của pha tĩnh có thể gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy
theo môi trường pH phân tích. Trong môi trường acid mạnh, pH < 2 thì có sự phân
ly các nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân
tích không thể tương tác với cột. Trong môi trường base (pH>7), các nhóm -OH

trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương
tác của chất tan với nhóm -SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có
những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi làm cho việc tích phân tính
diện tích hay chiều cao píc có độ chính xác không cao. Một trong những cách khắc
phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc
hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm -OH này. Cấu trúc pha
liên kết của cột LC-DB được trình bày ở hình 1.3.

Hình 1.3. Cấu trúc pha tĩnh cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm -OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm -OH,
được trình bày ở hình 1.4:


13

Hình 1.4.Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực
để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối
với những hợp chất phân cực mạnh [5] [7] [15].
1.3.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như: Nước, methanol, acetonitril… hoặc hỗn hợp của
chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như:
Độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy píc… nên việc
phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.
+ Yêu cầu của 1 pha động

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.
- Hòa tan được chất cần phân tích.
- Có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Có tính kinh tế và không gây ô nhiễm môi trường.
+ Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả
- Bản chất của dung môi để pha pha động.
- Thành phần các chất trong pha động.
- pH của pha động.
- Tốc độ dòng của pha động.


14

+ Chọn đệm - pH: Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base
thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH
thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.
+Tốc độ dòng của pha động: Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng
hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách
các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [15].
1.3.4.3. Lựa chọn Detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển thành
tín hiệu và được ghi trên SKĐ. Detector phổ biến nhất là detector UV - VIS. Tùy
theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau [15].
1.2.5. Phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC
1.2.5.1. Cách đánh giá píc
- Đánh giá diện tích píc: Để tính diện tích píc có thể dùng tích phân kế hoặc dùng
máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.
- Đánh giá chiều cao của píc với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều
cao của píc chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.

1.2.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng
độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó.
Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: Phương pháp
chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp
chuẩn hóa diện tích. Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để
định lượng thuốc trong huyết tương. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những
nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể
gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các
mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp.
+ Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những
lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện.


15

+ Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian
lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là: Chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn
hóa nhiều điểm. Để chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu
có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng
nhau.Tiến hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương
quan giữa tỷ số diện tích (hay chiều cao) píc của chất chuẩn với chuẩn nội (SS/SIS)
so với tỷ số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (CS/CIS). Dựa vào đường chuẩn để

tìm ra nồng độ chất thử [5], [7].
1.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC
1.3.1. Khái niệm
Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để
đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm
chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực
hiện phân tích những mẫu được khảo sát.
Phân tích dược chất trong dịch sinh học là cơ sở để đánh giá SKD và TĐSH trực
tiếp và chính xác nhất. Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp là các chất chất nội
sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá
thể, lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp. Do vậy, phương pháp
phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để
đảm bảo độ tin cậy [11], [19].
1.3.2. Các chỉ tiêu thẩm định
Nội dung thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các thẩm định phương


16

pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA [20] [25].
1.3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu
Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần
phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác.
Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể nhận
diện “chất cần phân tích” và không bị “nhầm lẫn” bởi các chất khác. Do vậy, kết
quả phải thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha
trong mẫu trắng, chất cần phân tích phân tách hoàn toàn với các píc tạp.
Tính chọn lọc - đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên SKĐ cho các
đáp ứng píc thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:

- Píc của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được
hoàn toàn khỏi píc tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi T ≤ 2,0; độ phân giải
(Rs) giữa píc của chất phân tích, píc IS với píc gần nhất phải lớn hơn 1,5.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng píc của từng
mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng píc của từng mẫu LLOQ
phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng.
1.3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của píc (diện tích hay
chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này phải
được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi
quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất).
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường
chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn gồm:
1 mẫu trắng (dịch sinh học không có chuẩn và IS).
1 mẫu zero (dịch sinh học có chuẩn nội, không có chuẩn).
6 mẫu non-zero (dịch sinh học có bổ sung chuẩn và IS) có nồng độ chất chuẩn
pha trong cùng một mẫu dịch sinh học, bao phủ toàn bộ dãy nồng độ mong muốn.
Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích.


17

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số
tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp
bình phương tối thiểu). Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải
tuyến tính và có hệ số R2 ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85-115%, trừ tại điểm
LLOQ được chấp nhận 80% -120%.
- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó

LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.
- Có hệ số tương quan r ≥ 0,99.
1.3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ
đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ
đúng và độ chính xác của phương pháp.
Mẫu được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn: Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải
bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng. Píc của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm
tách riêng và có thể tái lập với độ đúng từ 80 - 120%.
1.3.2.4. Độ đúng - độ chính xác
* Độ đúng (accuracy): Độ đúng của phương pháp phân tích là mức độ gần sát
của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết. Giá trị này phải nằm trong
khoảng 85 - 115% và 80 - 120% đối với điểm gần giới hạn định lượng dưới.
* Độ chính xác (precision): Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ
thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại
nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong
ngày và độ lặp lại khác ngày, được biểu thị bằng giá trị của hệ số biến thiên CV(%).
Trong đánh giá TĐSH, độ chính xác của phương pháp bao gồm độ lặp lại
(repeatability) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác ngày) và độ tái lặp
(reproducibility). Phương pháp xác định độ lặp lại là thực hiện phân tích trên một
mẫu thử đồng nhất n lần (n ≥ 5) cùng một lúc và trong cùng một thời điểm hoặc
khác ngày. Xác định độ hệ số biến thiên CV giữa các lần thử. Yêu cầu CV ≤ 15%,