Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học của thân rễ tam thất hoang (panax stipuleanatus tsai feng)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MẠC THỊ THANH HUYỀN
MSV: 1101228

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ
TAM THẤT HOANG
(PANAX STIPULEANATUS TSAI & FENG)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MẠC THỊ THANH HUYỀN
MSV: 1101228

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ
TAM THẤT HOANG
(PANAX STIPULEANATUS TSAI & FENG)

Người hướng dẫn:
1. TS. Đỗ Thị Hà
2. TS. Hà Vân Oanh
Nơi thực hiện:

1. Khoa Hóa thực vật – Viện Dƣợc liệu
2. Bộ môn Dƣợc học Cổ truyền
Hà Nội – 2016


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu trƣờng Đại
học Dƣợc Hà Nội và Bộ môn Dƣợc học Cổ truyền đã tạo điều kiện cho em
đƣợc làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trong trƣờng đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chƣơng trình học tập suốt 5
năm qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến TS. Đỗ Thị Hà, TS.
Hà Vân Oanh, ThS. Nguyễn Thị Duyên, những ngƣời đã luôn tận tình
hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu Khoa Hoá Thực vật –
Viện Dƣợc liệu, các thầy cô ở Bộ môn Dƣợc học Cổ truyền – Đại học Dƣợc
Hà Nội đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chƣơng trình Tây Bắc: “Ứng dụng
các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo
sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,
2015-2017, (Chƣơng trình Tây Bắc) đã tài trợ kinh phí để em thực hiện nội
dung nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Trung tâm các phƣơng pháp phổ
ứng dụng - Viện Hoá học thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã giúp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và ngƣời
thân đã luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhƣng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi
những thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của các thầy cô để
khoá luận thêm hoàn thiện.

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Mạc Thị Thanh Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Vài nét về chi Panax L. ....................................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L. ............................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Panax L. ..........................................................3
1.1.3. Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Panax L. .....................3
1.1.4. Tác dụng dược lý một số loài trong chi Panax L. ......................................9
1.2. Tam thất hoang (TTH) ....................................................................................10
1.2.1. Thực vật học .............................................................................................10
1.2.2. Thành phần hóa học .................................................................................11
1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng ...............................................................13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................15
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................15
2.2. Hoá chất và trang thiết bị ...............................................................................15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................17
2.3.1. Giám định tên khoa học............................................................................17
2.3.2. Nghiên cứu về hoá học .............................................................................17
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN .................................19
3.1. Giám định tên khoa học tam thất hoang .........................................................19
3.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp bằng phản ứng hóa học ...........19

3.2.1. Định tính saponin .....................................................................................19
3.2.2. Định tính alcaloid .....................................................................................20
3.2.3. Định tính glycosid tim ..............................................................................20
3.2.4. Định tính flavonoid ...................................................................................21


3.2.5. Định tính coumarin ..................................................................................21
3.2.6. Định tính tanin..........................................................................................22
3.2.7. Định tính acid hữu cơ ...............................................................................23
3.2.8. Định tính acid amin ..................................................................................23
3.2.9. Định tính đường khử ................................................................................23
3.2.10. Định tính polysaccharid .........................................................................23
3.2.11. Định tính chất béo ..................................................................................23
3.2.12. Định tính sterol .......................................................................................24
3.2.13. Định tính caroten....................................................................................24
3.2.14. Định tính anthranoid ..............................................................................24
3.3. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc chất ...............................................26
3.3.1. Chiết các phân đoạn từ phần dưới mặt đất TTH .....................................26
3.3.2 Kết quả phân lập và tinh chế chất tinh khiết từ phân đoạn n-BuOH ........27
3.4. Bàn luận ..........................................................................................................36
3.4.1. Về đặc điểm thực vật ................................................................................36
3.4.2. Về hoá học ................................................................................................36
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................39
4.1. Kết luận ...........................................................................................................39
4.2. Đề xuất ............................................................................................................39

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Giải nghĩa

13

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13

1

C-NMR

H- NMR

Phổ cộng hƣởng từ proton

DCM

Dicloromethan

Glu

Glucose
Heteronuclear mutiple bond connectivity (phổ

HMBC

tƣơng tác giữa carbon và hydro xa nhau)
Heteronuclear single quantum coherence (phổ

HSQC

tƣơng tác giữa carbon và hydro liên kết trực tiếp)

IC50
Kl
LD50
MeOH

Liều ức chế 50 % đối tƣợng thử
Khối lƣợng
Liều gây chết 50% đối tƣợng thử
Methanol

n-BuOH

n-butanol

Rha

Rhamnose

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

STT

Số thứ tự

TT

Thuốc thử

TTH

Tam thất hoang

UV254

Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 254 nm

UV365

Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 365 nm

Xyl

Xylose


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng 1.1
Bảng 1.2

Tên bảng
Phân bố của các loài thuộc chi Panax L.
Saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)protopanaxatriol

Trang
2
4

Bảng 1.3

Saponin khung dammaran khác

5

Bảng 1.4

Saponin dẫn chất ocotillol

6

Bảng 1.5

Saponin dẫn chất acid oleanolic

7

Bảng 1.6

Bảng 1.7

Các polyacetylen tìm thấy trong một số loài thuộc
chi Panax L.
Các hợp chất saponin đã phân lập đƣợc từ tam

thất hoang

8

12

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng
Bảng 3.1

gặp trong thân rễ tam thất hoang bằng phản ứng

25

hóa học
Bảng 3.2

Phổ 1H,
(9) [44]

13

C-NMR của PS04 và chất tham khảo

33


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Tam thất hoang

10

Hình 1.2

Saponin dẫn chất acid oleanolic

11

Hình 2.1

Nguyên liệu Panax stipuleanatus Tsai & Feng tƣơi

15

Hình 3.1

Quy trình chiết xuất tam thất hoang

26

Sắc ký đồ cao tổng (T), phân đoạn n-BuOH (n-B),
Hình 3.2

dicloromethan (D) và n-hexan (n-H) của TTH sau

27

khi nhúng TT H2SO4 10%/ EtOH và hơ nóng
Hình 3.3

Sắc ký đồ phân đoạn n-BuOH

28

Hình 3.4

Sơ đồ phân lập chất PS04 từ tam thất hoang

30

Hình 3.5

Sắc ký đồ của cao n-BuOH, phân đoạn Pđ B và
chất PS04

31

Hình 3.6

Cấu trúc hóa học của hợp chất PS04

35

Hình 3.7

Tƣơng tác giữa carbon và hydro xa nhau (HMBC)

36


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Khi nhắc tới thảo dƣợc, ngƣời ta không thể không nhắc tới “Sâm” bởi
những tác dụng quý hiếm của nó. Từ “Sâm” ngày nay không chỉ đƣợc dùng
để chỉ cây nhân sâm (Panax ginseng) mà còn đƣợc mở rộng để chỉ một số loài
cùng chi Panax L., họ Nhân sâm (Araliaceae) có tác dụng tƣơng tự nhân sâm,
nhƣ sâm Mỹ, sâm tam thất, sâm Nhật, sâm Việt Nam [10].
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là một trong các
loài thuộc chi Panax L. đƣợc tìm thấy ở Việt Nam. Đây là loài quí hiếm và có
nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam [3]. Loài này đƣợc dùng làm thuốc bổ,
thuốc cầm máu, tăng cƣờng sinh dục, chống stress [16]. Và hiện nay trên thị
trƣờng đang có sự nhầm lẫn giữa loài này với một số loài khác trong chi (sâm
vũ diệp P. bipinnatifidus, sâm Việt Nam P. vietnamensis), do vậy chúng tôi
đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học
của thân rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)” để góp
phần xây dựng dấu vân tay hóa học cho tam thất hoang, làm cơ sở cho việc
phân biệt loài này với các loài khác. Mục tiêu của đề tài là: Chiết tách và xác
định một số thành phần hóa học của thân rễ tam thất hoang.
Để đạt đƣợc mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung sau:
1. Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
2. Định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp trong mẫu nghiên cứu
bằng phản ứng hóa học.

3. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập
đƣợc.


2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về chi Panax L.
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L.
Vị trí của chi Panax L. trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan
(1987) [1]:
Giới Thực vật (Planta)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Hoa tán (Apiales)
Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Chi Panax L.
Theo trang The Plant list [74] có 12 loài và 1 thứ dƣới loài thuộc chi
Panax L. đƣợc chấp nhận. Phân bố của 12 loài nhƣ trong bảng sau:
Bảng 1.1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L. [74]
STT

Loài

Phân bố
Từ dãy Himalaya đến miền trung

1

Panax bipinnatifidus Seem.

Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt
Nam .

2

3

Panax ginseng C.A.Mey
Panax japonicus (T.Nees)
C.A.Mey

Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc,
Đông bắc Trung Quốc.
Nhật Bản, Hàn Quốc.

Panax notoginseng (Burkill)

Miền nam Trung Quốc và một số

F.H.Chen

nơi ở Việt Nam.

5

Panax pseudoginseng Wall.

Nê-pan.

6

Panax quinquefolius L.

Canada, Mỹ.

4


3

7

8
9
10
11
12

Panax sokpayensis Shiva

Vùng Sikkim - Ấn Độ.

K.Sharma & Pandit
Panax stipuleanatus Tsai

&

Feng

Panax trifolius L.
Panax vietnamensis Ha

Bắc Mỹ.
&

Grushv.
Panax wangianus S.C.Sun
Panax zingiberensis C.Y.Wu &
Feng

Trung Quốc, Việt Nam.

Trung Quốc, Việt Nam.
Miền trung, nam Trung Quốc.
Vân Nam - Trung Quốc.

Ở Việt Nam, chi Panax L. tìm thấy các loài Panax bipinnatifidus ở
vùng núi cao Lai Châu, Lào Cai; Panax vietnamensis ở núi Ngọc Linh thuộc
Kon Tum, Quảng Nam; Panax pseudoginseng ở một số tỉnh miền bắc;
Panax stipuleanatus có ở Sapa, vùng núi cao Hoàng Liên Sơn Lào Cai [16].
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Panax L.
Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc
vòng 3-5 lá, mép lá chét có răng cƣa hoặc xẻ thùy lông chim. Cụm hoa tán
đơn, hoa lƣỡng tính có bầu dƣới. Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dƣới, tràng 5, nhị
5. Bầu 2-3 có khi đến 5 ô. Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội
nhũ mịn [62].
1.1.3. Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Panax L.
1.1.3.1. Hợp chất saponin
Saponin đƣợc xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài

thuộc chi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc gần
300 saponin từ các loài thuộc chi này [67], gồm các saponin dẫn chất của 20


4

(S)-protopanaxadiol và 20 (S)-protopanaxatriol, saponin khung dammaran
khác, saponin dẫn chất ocotillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic. Các loại
saponin đƣợc trình bày trong các bảng dƣới đây.
Bảng 1.2 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)protopanaxatriol
STT
1

2

3

Tên
Ginsenosid Rb1

Ginsenosid Rb2
Notoginsenosid

Kiểu
(A)

(A)

(A)

R4
4

Notoginsenosid

(A)

Fa

R2

Ginsenosid Rgl

(B)

6

Notoginsenosid

(B)

R1
Notoginsenosid

(B)

R3

Loài

G1C2-G1C

G1C6-G1C

G1C2-G1C

Glc6-Ara(p)

2

G1C -G1C
Glc2-Glc2-

G1C6-G1C6Xyl

P. ginseng [27];
P. notoginseng [64]
P. ginseng [34];
P. notoginseng [23]
P. notoginseng [69]

Glc6- Glc

P. notoginseng [69]

Glc

Glc

P. ginseng [67]

Xyl

Glc

Glc

G1C6-G1C

Xyl

5

7

R1

P. notoginseng [60]

P. notoginseng [69]

Ghi chú :
R2O
OH

R2O
OH

A

R1O

B

HO
OR1

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol


5

Bảng 1.3 Saponin khung dammaran khác
STT
1

Tên
Majonosid F4

2

Chikusetsusaponin

Loại
(A)

R1
Glc

R2
H

R3
H

R4
Glc

Loài
P. vietnamensis
[66]

(A)

H

OH

H

H

P. japonicus [65]

(B)

H

OH

Glc

H

P. vietnamensis
[24]

(B)

H

OH

H

Glc

P. vietnamensis
[24]

(C)

Glc

-

-

Glc

P. japonicus [70]

L9a
5

Chikusetsusaponin
L9bc

6

Ginsenosid M7cd

7

Chikusetsusaponin
LT8

Ghi chú:
R4O
OR3

A

R1O
R2

OH
R4O

OR3

B

C

R1O

R1O
R2

O

R4O


6

Bảng 1.4. Saponin dẫn chất ocotillol
Kiểu

STT

Tên

1

Pseudoginsenosid
F11

2

R

Loài
P. quinquefolius [41]

(A)

Glc2-Rha

Pseudoginsenosid
RT4

P. japonicus [73]
(B)

Glc

3

Majonosid-R1

(B)

Glc2- Glc

4

Majonosid-R2

(B)

Glc2-Xyl

P. japonicus [66]
P. japonicus [66]

Ghi chú:
OH

OH

B

A
O

O

OH

HO

OH

HO
OR

OR

7

Bảng 1.5. Saponin dẫn chất acid oleanolic

COOR2

R1O
OR

STT

Tên

R1
Glc A2- Glc

Loài

R2
H

P. zingiberensis [28]

1

Zingibrosid R1

2

Glc A3- Glc
Stipuleanosid R1
\
4
-Ara(f)

H

P. stipuleanatus [52]

3

Glc A3- Glc
Stipuleanosid R2
\
4
-Ara(f)

Glc

P. stipuleanatus [52]

1.1.3.2. Hợp chất polyacetylen
Polyacetylen thƣờng là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon
với những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một
đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại
của hợp chất là chuỗi C7H15 [21], [43], [46].

8

Bảng 1.6. Các polyacetylen tìm thấy trong một số loài thuộc chi Panax L.
STT Loài
1

P. ginseng

Hợp chất
- Panaxynol (falcarinol)
- Panaxytriol
- Panaxydol
- Heptadeca-1 -en-4,6-diyn-3,9-diol
- Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol
- Heptadeco-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol
- Panaxacol
- 9,10- epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3ol
- 10-cloro-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol
- 9,10- epoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on
- 9,10-epoxy-1 -heptadecen-4,6-diyn-3-on
- 3-acetoxy-9,10-epoxy-l,16-heptadecadien-4,6-diyn
- 3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn
- 3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn

2

P. quinquefolium

- Panaxynol
- Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol

- Heptadeca-l-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol
- 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1 -en-4,6-diyn
- 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn
- 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on

3

P. notoginseng

- 8-acetoxy-9,10-epoxy-l-heptadecen-4,6-diyn-3-ol
10-metoxyheptadeca-1 -en-4,6-diyn-3,9-diol
- Panaxatriol

4

P. vietnamensis

- Panaxynol
- 10-acetoxy-hetadeca-8 (E) -en-4,6-diyn-3-ol
- Heptadeca-1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol
- Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol
- Heptadeca-1,8(E), 10 (Z)-trien-4,6-diyn-3,12-diol


9

1.1.4. Tác dụng dược lý một số loài trong chi Panax L.
Trong chi Panax L., có một số loài đã đƣợc nghiên cứu nhiều về tác
dụng dƣợc lý nhƣ: nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng),
sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis).

1.1.4.1. Nhân sâm
Nhân sâm đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh có các tác dụng: tăng
lực, hồi phục sức khỏe [59]; cải thiện trí nhớ [71], [48]; chống stress, giải lo
âu và chống trầm cảm [54], [59], [51], [50]; chống oxy hoá và chống lão hoá
[61], [68]; bảo vệ gan [39], [40], [32]; điều hòa miễn dịch [17], [57]; chống ung
thƣ [56], [53]; hạ cholesterol và lipid máu [31], [55]; tác dụng kiểu nội tiết tố
sinh dục [26], [19], [18]; hạ glucose huyết [63].
1.1.4.2. Tam thất
Tam thất cũng thể hiện các tác dụng dƣợc lý tƣơng tự nhân sâm, nhƣ:
tác dụng chống oxy hóa [30]; tác dụng điều hòa miễn dịch [37]; tác dụng bảo
vệ tế bào não trong trƣờng hợp thiểu năng tuần hoàn não [29]; hạ lipid máu và
phòng chống huyết khối [49]; tác dụng bảo vệ gan [45], [68]; tác dụng kiểu
nội tiết tố sinh dục [20].
1.1.4.3. Sâm Mỹ
Sâm Mỹ có tác dụng chống oxy hoá [33]; tăng cƣờng miễn dịch [72];
tác dụng chống stress [33]; gây độc tế bào ung thƣ [25], [42].
1.1.4.4. Sâm Việt Nam
Các công trình nghiên cứu dƣợc lý và lâm sàng cho thấy sâm Việt Nam
có những tác dụng tƣơng tự nhân sâm. Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâm Việt
Nam có tác dụng cải thiện trí nhớ [14], [7]; chống stress và trầm cảm [8],
[47], [15]; chống oxy hóa [15]; tác dụng bảo vệ gan [58], [38], [6]; kháng
khuẩn trên các chủng Streptococcus, Staphylococcus [46], [10]; kích thích


10

miễn dịch [9]; gây độc tế bào ung thƣ [35]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục,
chống đái tháo đƣờng, giảm đau chống viêm [10].
1.2. Tam thất hoang (TTH)
1.2.1. Thực vật học

Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất. Tên khoa học: Panax
stipuleanatus Tsai & Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) Araliaceae.
Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25 – 75 cm; thân rễ
mập nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm
thƣờng có 1 thân mang lá, ít khi 2-3. Lá kép chân vịt, gồm 1-3 cái, mọc vòng
ở ngọn; cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác
thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm.
Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng,
gần hình cầu dẹp, đƣờng kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ. Quả gồm 1 hoặc 2
hạt màu xám trắng. Ra hoa tháng 4-5, có quả tháng 5-9 [16].

Hình 1.1. Tam thất hoang


11

Loài Panax stipuleanatus Tsai & Feng đƣợc hai nhà khoa học ngƣời
Trung Quốc công bố năm 1975. Loài này đƣợc tìm thấy đầu tiên tại khu rừng
Mã Quan, Trung Quốc (phía bắc Việt Nam) ở độ cao 1100-1700 m so với mặt
nƣớc biển [62]. Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở
tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên
Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [5].
1.2.2. Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học trƣớc đây của tam thất
hoang chỉ ra rằng phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu
hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lƣợng tƣơng đối cao cùng
một số saponin khung dammaran với hàm lƣợng thấp. Năm 1985, nhóm các
nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin dẫn chất acid oleanolic,
stipuleanosid R1 và R2, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH [52].

COOR2

R1O
OR

Hình 1.2. Saponin dẫn chất acid oleanolic
Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu
ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung
dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lƣợng nhỏ từ
dich chiết ethanol của TTH đƣợc thu hái ở Trung Quốc [36].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun L. đã phân lập đƣợc 11 hợp
chất saponin từ mẫu TTH thu hái ở Việt Nam [44]. Năm 2013, nhóm tiếp tục


12

phân lập đƣợc 4 hợp chất saponin khác nữa [22]. Các saponin mà nhóm tác
giả trên phân lập đƣợc từ TTH đều là saponin các dẫn chất của acid oleanolic.
Bảng 1.7. Các hợp chất saponin đã phân lập đƣợc từ tam thất hoang
STT

Hợp chất

TLTK

1

Stipuleanosid R1 (1)

[52]

2

Stipuleanosid R2 (2)

[52]

3

Aralosid A methyl este (3)

[44]

4

Chikusetsusaponin IVa (4)

[44]

5

Pseudoginsenosid Rp1 methyl este (5)

[44]

6

Pseudoginsenosid Rt1 (6)

[44]

7

Pseudoginsenosid Rt1 methyl este (7)

[44]

8

Acid oleanolic-3-O-[β-D-glucopyranosyl (1→3)
β-D-glucuronopyranosyl-6 ' - methyl ester]-28O-β-D-glucopyranosyl ester (8)

[44]

9

Acid oleanolic-3-O-β-D-xylopyranosyl (1→2)β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosid
(9)

[44]

10

Spinasaponin A 28-O-glucosid (10)

[44]

11

Spinasaponin A methyl este (11)

[44]

12

Stipuleanosid R2 methyl este (12)

[44]

13

Ginsenosid Rb1 (13)

[36]

14

Ginsenosid Rb3 (14)

[36]

15

Ginsenosid Rc (15)

[36]

16

Ginsenosid Rd (16)

[36]

17

Hemslosid Ma2 (17)

[22]

18

Elatosid A (18)

[22]

19

Stipuleanosid R1 methyl este (19)

[22]

20

Acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl este
(20)

[22]


13

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập đƣợc một số hợp chất
khác từ TTH gồm 3 polyacetylen (trong đó stipudiol và stipuol là 2 chất mới,
(3R,9R,10R)- panaxytriol là chất đã biết), và các hợp chất khác: spathulenol
(là serquiterpen) và 9-docosenoic acid methyl ester (acid béo) [43].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH vẫn còn mới
mẻ. Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất
chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng
phƣơng pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ TLC. Đồng thời bằng
cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu đƣợc acid
oleanolic [12], [13].
1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng
 Tác dụng dược lý
Năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ
củ TTH thể hiện độc tính cấp đƣờng uống với liều LD50 = 8,8 g/kg. Cao TTH
có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đƣa về trạng thái
bình thƣờng ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần
của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd
ở nồng độ 25, 50, 100 μg/ml [12].
Nhóm nghiên cứu của Chun L. (2010) [44] đã thử tác dụng gây độc tế
bào ung thƣ máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất saponin từ
2 đến 12 (theo bảng 1.7), thấy rằng các chất đều có tác dụng gây độc tế bào ở
mức độ khác nhau. Chất 11 với giá trị IC50 là 4,44 và 0,63 µM có tác dụng ức
chế tế bào ung thƣ bạch cầu HL-60 và tế bào ung thƣ ruột kết HCT-116 đáng
kể. Chất 5 có tác dụng gây độc tế bào ở giá trị IC50 là 6,50 µM đối với tế bào
ung thƣ ruột kết, nhƣng lại biểu hiện gây độc tế bào kém hơn ở giá trị IC50 =
41,45 µM. Ngoài ra hai chất đều làm kích thích quá trình chết tự nhiên của
các tế bào này. Chất 4, 8 có tác dụng gây độc tế bào ở giá trị IC50 là 75,94 và

14

78,11 µM lên tế bào HCT-116 Các chất 3, 6, 9, 10, 12 đều có tác dụng gây
độc tế bào với các giá trị IC50 lần lƣợt là 63,44; 67,08; 72,99; 76,23; 83,90;
91,16 lên dòng tế bào HL-60 và có tác dụng lên dòng HCT-116 với các giá
trị IC50 lớn hơn 100 µM.
Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục thử tác dụng gây độc tế bào ung
thƣ máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất polyacetylen
stipudiol và stipuol. Kết quả cho thấy cả 2 chất với giá trị IC50 là 0,13 và
41,45 μM đều kích thích quá trình chết tự nhiên [43].
Trong một công bố khác, năm 2013, nhóm nghiên cứu của Chun L. chỉ
ra rằng các saponin 2, 3, 4, 8, 9, 12 (theo bảng 1.7) biểu hiện ức chế nhân tố
sao chép NF-κB với giá trị IC50 từ 3,1 đến 18,9 μM trên dòng tế bào HepG2
liên quan đến khả năng chống ung thƣ và kháng viêm [22].
 Công dụng
Tam thất hoang có tác dụng tán ứ.
Sách đỏ Việt Nam, 2007 ghi “tất cả các bộ phận của cây đều có công
dụng làm thuốc; thân rễ thƣờng đƣợc dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng
cƣờng sinh dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích
thích tiêu hóa, an thần” [16].


15

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là thân rễ TTH thu hái tại Sapa - Lào Cai, ngày 26
tháng 10 năm 2015. Mẫu đƣợc giám định tên khoa học là Panax
stipuleanatus Tsai & Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân Sâm) (Araliaceae);
tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại Phòng tiêu bản của Khoa tài nguyên Dƣợc liệu, Viện

Dƣợc liệu với số hiệu mẫu: 71DV16 (Phụ lục 1).
Xử lý nguyên liệu: sau khi thu hái đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 50ºC đến
khi đạt độ ẩm khoảng 5%. Sau đó đƣợc cắt miếng mỏng, xay nhỏ làm mẫu
nghiên cứu và đƣợc bảo quản trong túi kín.

Hình 2.1 : Nguyên liệu Panax stipuleanatus Tsai & Feng tƣơi
2.2. Hoá chất và trang thiết bị
Hoá chất:
-

Dung

môi

n-hexan,

ethyl

acetat,

methanol,

cloroform,

aceton,

dicloromethan… là dung môi công nghiệp đã cất lại; ethanol 96%, nƣớc cất


16

hai lần, các dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của
Trung Quốc.
- Các dung môi, hóa chất dùng trong định tính (ethanol 25%, ethanol 80% ,
nƣớc cất, chì acetat 30%, chì acetat 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử
Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussinat 0,5%,
Na2SO4 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, anhydrid acetic, dung
dịch gelatin 1%, cloroform, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung
dịch NaOH 5%, H2SO4 10%/ EtOH 96%) đạt tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam
IV.
- Silica gel pha thƣờng (0,040-0,063 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC
C18 (30-35 µm, FuJi Silysia Chemical Ltd.)
- SKLM đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254
(Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0.25
mm).
- Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc
dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol 96% rồi hơ nóng.
Trang thiết bị:
- Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm nhƣ bình gạn, bình nón, phễu
lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm.
- Cột sắc ký các loại kích cỡ.
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ).
- Tủ sấy Memmert (Memmert - Đức), Binder-FD115(Binder - Đức).
- Bếp điện, bếp đun cách thủy.
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa Thụy Sĩ).
- Đèn UV-Vilber lourmat (Pháp).
- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic - Hàn Quốc).


17

- Máy scan CanoScan LiDe 100 (Canon - Trung Quốc).
- Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): BRUKER AVANCE AM500
FT – NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, chất chuẩn nội là tetramethyl silan.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Giám định tên khoa học
Mẫu TTH sau khi đƣợc thu hái đƣợc giám định tên khoa học dựa trên
đặc điểm về thực vật và đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực
vật nhƣ: “Danh mục các loài thực vật Việt Nam”, “Flora of China” tại Khoa
Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu.
2.3.2. Nghiên cứu về hoá học
2.3.2.1. Phương pháp định tính
Định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp trong dƣợc liệu theo
phƣơng pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dƣợc liệu và Dƣợc liệu học tập
1, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [11], [2].
2.3.2.2. Phương pháp tách chiết, phân lập và xác định cấu trúc chất tinh khiết
từ tam thất hoang
Phƣơng pháp chiết xuất
Thân rễ Tam thất hoang đƣợc chiết hồi lƣu 3 lần với ethanol 70 % ở
nhiệt độ 70oC. Tiến hành lọc loại bã dƣợc liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi dung
môi dƣới áp suất giảm tại 50oC thu đƣợc cao khô. Cao khô này đem phân tán
trong nƣớc rồi lắc lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (nhexan, dicloromethan và n-butanol), thu đƣợc các phân đoạn tƣơng ứng.
Phƣơng pháp phân lập các chất
- Lựa chọn phân đoạn để tiến hành phân lập.
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột.