Phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số hợp chất từ cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l )

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----------

PHẠM BÁ HẠNH
Mã sinh viên: 1101160

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA
MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
CỎ SỮA LÁ LỚN
(EUPHORBIA HIRTA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM BÁ HẠNH
Mã sinh viên: 1101160

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA
MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
CỎ SỮA LÁ LỚN
(EUPHORBIA HIRTA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng

2. DS. Nguyễn Ngọc Cầu
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dƣợc liệu
2. Viện Dƣợc liệu

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện khóa luận tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại Học
Dược Hà Nội và Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, tôi đã nhận được rất nhiều
sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô, anh chị, các bạn và các em sinh viên trong
nhóm nghiên cứu.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Thu Hằng (giảng viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội)
- người thầy đã luôn giành thời gian, tâm huyết, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động
viên tôi trong suốt quãng thời gian nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược liệu và
thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Dƣợc sĩ Nguyễn Ngọc Cầu – người thầy,
người anh; em Cao Huy Bình đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá
trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đỗ Thị Hà, Thạc sĩ Nguyễn Thị Ngọc Loan và
các cán bộ tại Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược Liệu đã hướng dẫn và tạo điều kiện
giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên công tác
tại Bộ môn Dược liệu - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong
quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, các thầy cô, các
anh chị, các bạn và các em sinh viên tại mái trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn
động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Bá Hạnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. Đặc điểm thực vật...............................................................................................2
1.2. Phân bố ................................................................................................................3
1.3. Thành phần hóa học ..........................................................................................3
1.4. Tác dụng sinh học.............................................................................................10
1.5. Công dụng .........................................................................................................14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................15
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................19
2.3.1. Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn
...............................................................................................................................19
2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân
đoạn dịch chiết .......................................................................................................19
2.3.3. Phân lập các hợp chất từ cỏ sữa lá lớn .......................................................20
2.3.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được .................20
2.3.5. Xử lý kết quả thực nghiệm ...........................................................................20
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................21

3.1. Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn
...................................................................................................................................21


3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân
đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn..............................................................................23
3.3. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn ............23
3.4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc ...............................28
3.4.1. Hợp chất CS2 ...................................................................................................28
3.4.2. Hợp chất CS1 ...................................................................................................29
3.5. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập đƣợc ............31
3.6. Bàn luận ............................................................................................................32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤC LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHT

Butylat hydroxytoluen

BPTMĐ

Bộ phận trên mặt đất

d

doublet

dd

double doublet

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DPPH

1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl

IC50

Inhibitory concentration of 50% (Nồng độ ức chế 50% đối
tượng thử)

IL

Interleukin

iNOS

inducible nitric oxide synthase

J

Hằng số tương tác

NXB

Nhà xuất bản

ppm

Phần triệu

PĐ

Phân đoạn

s

singlet

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TLTK

Tài liệu tham khảo

UV

Ultra violet

δ

Độ dịch chuyển hóa học


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn

4

1.2

Các hợp chất triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn

7

1.3

Các hợp chất diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn

8

3.1

Kết quả chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá
lớn

21

Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết
3.2

methanol và các phân đoạn dịch chiết cỏ sữa lá lớn trên

23

mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro
3.3

Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của hai chất
CS1 và CS2 trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro

33


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình

Tên hình

Trang

2.1

Ảnh chụp cây cỏ sữa lá lớn nghiên cứu tại thực địa

15

2.2

Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn

16

2.3

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

18

Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol và

22

3.1
3.2

các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn
Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân

24

đoạn ethyl acetat cỏ sữa lá lớn
3.3

Cấu trúc hóa học của CS2 (Quercetin)

29

3.4

Cấu trúc hóa học của CS1 (Quercitrin)

30

4.1

Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu phát triển thuốc từ

32

dược liệu


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự gia tăng quá mức các gốc tự do trong cơ thể gây ra hiện tượng “stress oxy
hóa” (oxidative stress) được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh
mạn tính và thoái hóa như ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ
tim, Alzheimer và Parkinson [14], [33], [70]. Các hợp chất chống oxy hóa có khả
năng thu dọn gốc tự do, giảm nguy cơ “stress oxy hóa” [56], [70]. Vì vậy, việc tìm

kiếm những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa để nghiên cứu ứng dụng trong
phòng và điều trị những bệnh có liên quan tới gốc tự do là cần thiết, trong đó các
hợp chất tự nhiên là một đối tượng tiềm năng và được quan tâm.
Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), là loài cây mọc hoang và tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh ở
nước ta [8]. Theo kinh nghiệm dân gian, bộ phận trên mặt đất của cây được sử dụng
để chữa một số bệnh như nhiễm khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn ngoài da, viêm phế
quản, viêm thận [5], [8]. Nghiên cứu bằng thực nghiệm cho thấy cỏ sữa lá lớn có tác
dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, hạ đường huyết [17],
[42], [43], [60]. Trong số các tác dụng được nghiên cứu của cỏ sữa lá lớn, nhiều tác
dụng có liên quan đến khả năng dọn gốc tự do. Trên thế giới, một số tài liệu cũng đã
công bố về tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa lá lớn [44], [73]. Tuy nhiên, ở Việt
Nam, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự do của
dược liệu này. Chính vì vậy, đề tài “Phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy
hóa của một số hợp chất từ cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)” đã được thực
hiện với hai mục tiêu:
1. Phân lập 2 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn.
2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được.


2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae) [1]. Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [74], chi Euphorbia
có vị trí phân loại như sau:
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan)
Phân lớp: Dilleniidae (Sổ)

Bộ: Euphorbiales (Thầu dầu)
Họ: Euphorbiaceae (Thầu dầu)
1.1. Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống hằng năm, cao 30-60 (70) cm. Rễ cọc, đường kính 3-5 mm
[21]. Thân thường phân nhánh ít, phân nhánh từ giữa hoặc phía trên, mọc thẳng
đứng, hiếm khi mọc bò, đường kính 3 mm, màu đỏ nhạt [5],[8], có nhựa mủ trắng
[1],[8] và có nhiều lông che chở dài màu vàng nâu và lông ngắn hơn màu trắng [21].
Lá đơn, mọc đối, gốc cuống lá có hai lá kèm nhỏ hình tam giác [21] hay hình lông
cứng, kích thước 0,8-1,7 mm, rụng sớm [21]. Cuống lá dài 1-3,5 mm, phiến lá hình
mác-thuôn, elip dài, hoặc hình trứng-mác, kích thước 10-50 x 3-16 mm, màu không
đồng đều từ xanh đến đỏ, thỉnh thoảng có các đốm màu đỏ tía dọc theo gân giữa, cả
hai mặt đều có lông dày [21], gốc phiến lá tròn, hơi lệch [8], mép lá nửa dưới toàn
bộ hoặc một phần có răng cưa, nửa trên có răng cưa nhỏ hơn [21], ngọn lá nhọn [8,
21], hoặc tù [21]. Cụm hoa giống đầu [21], mọc ở nách lá, dạng xim, có cuống dài
25 mm, tất cả các bộ phận đều có nhiều lông, tổng bao hình chuông [8], [21], kích
thước 1×1 mm, có lông [21], mép chia 5 thùy, hình trứng-tam giác, có 4 tuyến màu
đỏ, hình tròn đến elip, ở giữa hơi trũng, phần phụ có màu từ trắng đến đỏ, hình elip
đến tam giác, kích thước 0,3-0,2 mm, toàn bộ mép hơi gợn sóng [21]. Hoa đơn tính
[21]. Một cụm hoa có 4-5 hoa đực [1]. Hoa đực tiêu giảm chỉ còn 1 nhị, đối diện lá
bắc nhỏ [21], bao phấn màu đỏ [21], mở ở đỉnh hoặc cạnh [8]. Hoa cái có cuống


3

ngắn, bầu cao, nhô ra khỏi tổng bao hình chuông [21], bầu 3 ngăn, có lông thưa
thớt, vòi nhụy chia 2 thùy [21]. Quả nang 3 góc, kích thước 1-1,5×1-1,5 mm [21],
có nhiều lông ngắn, mịn, cuống dài 1,5 mm [21], có 3 hạt [1]. Hạt thuôn, hình lăng
trụ bốn mặt, 0,7-0,9×0,4-0,5 mm, hơi xù xì, màu đỏ và không có mào. Số nhiễm sắc
thể 2n=18. Mùa hoa và quả từ tháng 6 đến tháng 12 [21].
1.2. Phân bố

Loài Euphorbia hirta L. có nguồn gốc từ vùng Trung Mỹ [17], [36] nhưng
phân bố chủ yếu ở một số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á gồm
Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Lào, Việt Nam và một số nơi ở phía nam
Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh trong cả
nước [8].
1.3. Thành phần hóa học
Theo các tài liệu thu thập, thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn gồm các hợp
chất có cấu trúc đa dạng và có thể chia thành 8 nhóm chính như sau: flavonoid,
tanin, triterpen, diterpen, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các thành phần khác.
1.3.1. Flavonoid
Nhiều nghiên đã chỉ ra flavonoid là thành phần chính của cây cỏ sữa lá lớn
[77]. Đây cũng là nhóm hợp chất được quan tâm nghiên cứu nhiều trong cỏ sữa lá
lớn.
Kết quả nghiên cứu của tác giả Basma và cộng sự [19] cho thấy hàm lượng
flavonoid trong lá cao nhất, tiếp theo là hoa, rễ và thân. Ở Việt Nam, Nghiên cứu
của tác giả Nguyễn Thị Thúy Quỳnh [6] đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần
trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn tính theo quercitrin là 0,578 % trong dược liệu khô
tuyệt đối.
Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng
1.1.


4

Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn
Ký
hiệu

Tên chất

1

Afzelin

2

Euphorbianin

Cấu trúc hóa học

Bộ
phận
Toàn

TLTK

[49]

cây

Toàn
cây

[16],
[62]

3

Epicatechin gallat

4

Epigallocatechin gallat

5

Cyanidin-3-glucosid

6

Cyanidin-3,5-diglucosid

Toàn
cây

Toàn

[62]

[62]

cây

Toàn

[8]

cây

Toàn

[17],

cây

[36]


5

Ký
hiệu

Tên chất

7

Isorhamnetin

8

Kaempferol

9

Leucocyanidin

10

Luteolin

11

Luteolin-7-O-glucosid

12

Myricitrin

13

Cấu trúc hóa học

Bộ
phận

TLTK

BP
TMĐ

[77]

BP
TMĐ
Toàn
cây

BP
TMĐ

[77]

[17],
[36]

[47]

Toàn
cây
BP
TMĐ

[62]

[47],
[49]

Pelargonidin-3,5-

Toàn

[17],

diglucosid

cây

[36]

14

Pinocembrin

15

Quercetin

BP
TMĐ

[77]

BP
TMĐ

[77]


6

Ký
hiệu

16

17

Tên chất

Isoquercetin

Quercitrin

Cấu trúc hóa học

Bộ
phận
Toàn
cây

TLTK

[62],
[79]

Toàn

[31],

cây

[49],
[50]

18

19

Rutin

Xanthorhamnin

Toàn

[17],

cây

[36]

Toàn
cây

[8],
[17],
[36]

5,7-dihydroxy-2-(3’,4’,5’20

trihydroxy-phenyl)-3-O-

Toàn

rhamnosyl-4H-

cây

[50]

benzopyran-4-on
1.3.2. Triterpen
Các triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.2.


7

Bảng 1.2. Các triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn
Ký
hiệu

21

Tên chất

α-amyrin

22

β-amyrin

23

Cycloartenol

24

24-methylen cycloartenol

25

26

Cấu trúc hóa học

Bộ
phận
BPT
MĐ

MĐ

[63]

Toàn
cây
BPT
MĐ

23-en-3β-ol

cây

24-hydroperoxy cycloart-

Toàn

25-en-3β-ol

cây

28

Taraxerol

[63]
[52],

Toàn

Friedelin

[52],

BPT

25-hydroperoxy cycloart-

27

TLTK

[63]

[52]

[63]

[63]

Toàn

[17],

cây

[36]

BPT
MĐ

[2]


8

Ký
hiệu

29

Tên chất

Cấu trúc hóa học

11α-12α-oxidotaraxerol

31

Lupeol

32

Squalen

phận

TLTK
[2],

Toàn

Taraxeron

30

Bộ

cây

[9],
[63]

Toàn

[9]

cây
Toàn
cây

Toàn
cây

[63]

[63]

1.3.3. Diterpen
Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn
Ký
hiệu
33

34

35

36

37

Tên chất

Câu trúc hóa học

Bộ
phận

12-deoxyphorbol-13-

Toàn

dodecanoate-20-acetat

cây

12-deoxyphorbol-13-

Toàn

phenylacetate-20-acetat

cây

TLTK

[17],
[36]
[17],
[36]

Toàn

[17],

cây

[36]

2β-16α-19-trihydroxy-

Toàn

[78]

ent-kauran

cây

2β-16α-dihydroxy-ent-

Toàn

kauran

cây

Ingenol triacetat

[78]


9

Ký
hiệu
38

16α-19-dihydroxy-ent-

Bộ
phận
Toàn

kauran

cây

Tên chất

Câu trúc hóa học

TLTK
[78]

1.3.4. Sterol
Các sterol trong cây cỏ sữa lá lớn gồm: brassicasterol [62], campesterol [62],
cholesterol [62], stigmasterol [62], β-sitosterol, [2], [50], [62], β-sitosterol-D-glucosid,
[52], [62], β-sitosterol 3-O- β-D-glucopyranosid [2].
1.3.5. Các acid hữu cơ
Các acid hữu cơ trong cây cỏ sữa lá lớn gồm: acid caffeic [62], acid ellagic
[8] , acid gallic [8], [47], [77], acid maleic, acid tartric [17], [36], acid syringic [62],
acid tricosanoic [2], acid phthalic [57], acid oleic [57], [83], acid ferulic [58], acid
protocatechuic [83], acid shikmic [83], acid lauric [83], acid eicosanoic [83], acid
palmitic [83], acid linoleic [83].
1.3.6. Tinh dầu
Thành phần tinh dầu lá cỏ sữa lá lớn gồm: 3,7,11,15-tetramethyl-2hexadecen-1-ol, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanon, hexadecanal, phytol, acid nhexadecanic, 2-butoxy ethanol, butyl tetradecyl phthalat, 13-heptadecyn-1-ol, 2-methyl1-hexadecanol, diisooctyl 1,2-benzen dicarboxylat [57].
1.3.7. Tanin
Các hợp chất tanin đã được phân lập trong cây cỏ sữa lá lớn đều thuộc nhóm

tanin thủy phân, được trình bày tóm tắt ở phụ lục 2.
1.3.8. Các thành phần khác
 Alcol: quercitol [36], alcol myricyl [5], [36], inositol, L-hexacosanol [8].
 Alkan: hentriacontan [8], heptacosan, n-nonacosan [17].
 Đường: glucose, fructose, sucrose [8] .
 Alcaloid, acid amin [8], saponin [37] và muối khoáng [17], [36].
 Ngoài ra có hai hợp chất mới được phân lập: n-butyl-1-O-β-L-rhamnopyranosid
và n-butyl-1-O-L-rhamnopyranosid [50].


10

1.4. Tác dụng sinh học
1.4.1. Tác dụng chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa lá lớn là tác dụng được quan tâm và có
nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bằng các phương pháp dọn gốc tự do DPPH,
dọn gốc tự do superoxid, dọn gốc tự do hydroxyl, dọn gốc tự do nitric oxid in vitro.
Dịch chiết nước của lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng chống oxy hóa và dọn
gốc tự do mạnh nhất ở nồng độ 0,25 mg/ml [44]. Ở nồng độ này, tác dụng dọn gốc
tự do DPPH, hydroxyl và ức chế peroxyd hóa lipid với giá trị % ức chế (I%) tương
ứng là 68,80 %, 73,36 % và 77,45 % [44]. Dịch chiết ethanol thân cỏ sữa lá lớn ở
nồng độ 250 µg/ml thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH, superoxyd, nitric oxyd
với I% tương ứng là 59,95 %, 59,67 % và 28,54 % [73]. Dịch chiết ethanol của toàn
cây cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC50 = 0,205
mg/ml [67].
Dịch chiết nước và dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn có tác
dụng chống oxy hóa tương đương với các loại trà xanh và trà đen [25]. Dịch chiết
methanol của các bộ phận (lá, hoa, thân, rễ) của cây cỏ sữa lá lớn ở cùng nồng độ 1
μg/ml được đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH; dịch chiết lá cho tác dụng mạnh
nhất với I% đạt (72,96 %), tiếp theo lần lượt là dịch chiết hoa (52,45 %), rễ (48,59

%), thân (44,42 %), thuốc đối chứng BHT (1 μg/ml) (75,13 %) [19]. Giá trị IC50 của
dịch chiết methanol các bộ phận lá, hoa, rễ, thân và BHT lần lượt là 0,803; 0,972;
0,989; 1,358 và 0,794 mg/ml [19].
1.4.2. Tác dụng hạ đường huyết
Dịch chiết ethanol của các bộ phận (lá, thân, hoa) của cây cỏ sữa lá lớn được
đánh giá tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái tháo đường bởi streptozotocin
[43]. Kết quả đường huyết sau 15 ngày của nhóm chuột dùng dịch chiết lá (500
mg/kg), dịch chiết hoa (500 mg/kg), dịch chiết thân (500mg/kg), glibenclamid (10
mg/kg) có giá trị lần lượt là 77,6; 84,6; 80,3;75,7 mg/dl; các giá trị này đều giảm so
với nhóm chứng gây đái tháo đường bởi streptozotocin (192,5 mg/dl) [43].


11

Dịch chiết ethanol và ether dầu hỏa của lá cỏ sữa lá lớn được đánh giá tác
dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái tháo đường bởi alloxan dùng đường uống [64].
Kết nồng quả độ đường huyết sau 21 ngày của chuột dùng dịch chiết ether dầu hỏa (250
mg/kg), dịch chiết ethanol (250 mg/kg), glibenclamid (10 mg/kg) tương ứng là 98,3, 82,0,
194,75 mg/dl; và các giá trị này đều giảm so với nhóm chứng (192,5 mg/dl) [64].
Phân đoạn dịch chiết ethanol và ethyl acetat của cỏ sữa lá lớn đã được chứng
minh có tác dụng hạ đường huyết theo cơ chế ức chế hoạt tính enzym α-glucosidase,
chống oxy hóa và tăng khả năng tiết insulin ở tế bào β đảo tụy (đảo Langerhans)
[65]. Kết quả nghiên cứu của tác giả Sheliya. MA (2015), cho thấy cấu trúc 5,7,4'trihydroxyflavon có vai trò quan trọng đối với tác dụng ức chế α-glucosidase [68].
Ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Trương Hoàng Kiên và cộng sự [4] cho
thấy trà cỏ sữa lá lớn thể hiện khả năng hạn chế tăng đường huyết rõ nhất chỉ sau 15
phút và 30 phút sau ăn trên bệnh nhân đái tháo đường typ II.
1.4.3. Tác dụng ức chế tế bào ung thư
Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết (ethanol, chloroform, ether dầu hỏa)
BPTMĐ cỏ sữa lá lớn trên dòng tế bào EL-4 trên chuột bạch Swiss ở mức liều 200
mg/kg/ngày dùng đường uống so với mẫu chứng và 5-fluoro uracil (20 mg/kg) cho

thấy dịch chiết ethanol và chloroform có tác dụng kéo dài thời gian sống trung bình
và giảm rõ rệt kích thước khối u [60].
Dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn được đánh giá ảnh hưởng trên
dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở các nồng độ 1,96-250,00 μg/ml cho thấy thể hiện
tác dụng ức chế với giá trị IC50 = 25,26 μg/ml sau 24h [46].
1.4.4. Tác dụng chống viêm
Dịch chiết n-hexan BPTMĐ cỏ sữa lá lớn, thành phần chính được xác định là
các triterpen như β-amyrin, 24-methylenecycloartenol và β-sitosterol thể hiện tác
dụng chống viêm trên mô hình gây viêm bằng 12-O-tetradecanoyl phorbol acetat
trên tai chuột [48], [52]. Dịch chiết nước và ethanol toàn cây của cỏ sữa lá lớn thể
hiện tác dụng chống viêm rõ rệt ở chuột trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng
carrageenan ở các mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg dùng đường uống so với mẫu


12

chứng và natri diclofenac 50 mg/kg, cơ chế có thể do thành phần trong dịch chiết ức
chế một trong những trung gian gây viêm như histamin, 5-HT, kinin hoặc
Prostaglandin [28].
Dịch chiết ethanol của cỏ sữa lá lớn và β-amyrin (một thành phần của cây)
có tác dụng chống viêm vượt trội, có thể phong bế hầu hết các chức năng của
protein iNOS và sự cảm ứng NO; thể hiện tiềm năng ức chế chọn lọc NO để điều trị
viêm khớp [69].
Phân đoạn A (được phân lập từ dịch chiết nước toàn cây cỏ sữa lá lớn bằng
phương pháp sắc ký pha đảo, hệ dung môi rửa giải nước – methanol (1:0  0:1) tác
dụng ức chế PGE2 mạnh nhất tại các nồng độ 0,1, 1 và 10 μg/ml so với dịch chiết
nước và các phân đoạn khác trên nguyên bào sợi hoạt dịch của thỏ (HIG-82) [24].
1.4.5. Tác dụng trên hệ thống thận
Dịch chiết nước và ethanol lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng lợi tiểu trên
chuột Wistar ở mức liều 50 mg/kg tại 24h và 100 mg/kg tại 6h dùng đường tiêm; so

với mẫu chứng và furosemid (5 mg/kg), acetazolamid (5 mg/kg) [41]. Kết quả cho
thấy, dịch chiết nước làm tăng đào thải Na+, K+, HCO3-; trong khi dịch chiết ethanol
làm tăng đào thải HCO3- và K+, ít ảnh hưởng đến đào thải Na+ [41]. Nghiên cứu cho
rằng các thành phần có hoạt tính trong dịch chiết nước lá cỏ sữa lá lớn có cơ chế lợi
tiểu tương tự như acetazolamid [41].
Bên cạnh đó, dịch chiết methanol của lá và thân cỏ sữa lá lớn có tác dụng ức
chế men chuyển angiotensin 90% và 50% ở các mức liều tương ứng 500 μg và 150
μg sử dụng xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzym (ELISA). Nghiên cứu cho
thấy rằng hầu hết các hợp chất ức chế men chuyển angiotensin có mặt trong phân
đoạn phân cực mạnh và phân cực trung bình [76].
1.4.6. Tác dụng chống dị ứng
Dịch chiết ethanol của BPTMĐ cỏ sữa lá lớn có tác dụng ức chế phản ứng
quá mẫn rõ rệt trên chuột Wistar và chuột BALB ở các mức liều 125 mg/kg, 250
mg/kg, 500 mg/kg dùng đường uống so với mẫu chứng và cetirizin (10 mg/kg).
Nghiên cứu in vitro trên tế bào mast phúc mạc chuột cho thấy dịch chiết trên có tác


13

dụng giảm sự giải phóng TNF-α và IL-6 ở các nồng độ 10 µg/ml, 30 μg/ml và 90
μg/ml [82]. Một nghiên cứu khác cũng cho thấy dịch chiết ethanol 95% của
BPTMĐ cỏ sữa lá lớn có tác dụng ngăn chặn phản ứng dị ứng giai đoạn sớm và
muộn do tính kháng viêm và ức chế miễn dịch [71].
1.4.7. Tác dụng ức chế miễn dịch
Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá lớn trên đáp
ứng miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào trên chuột dùng đường uống cho thấy ở
mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg, dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế miễn dịch so
với thuốc đối chiếu cyclosporin (5 mg/kg) và levamisol (2,5 mg/kg) [11].
1.4.8. Tác dụng chống tiêu chảy
Dịch chiết nước lá cỏ sữa lá lớn làm giảm rõ rệt nhu động ruột trên chuột

bình thường và làm giảm tác dụng gây tiêu chảy của dầu thầu dầu trên chuột ở mức
liều 100 mg/kg, 300 mg/kg và 1000 mg/kg dùng đường uống so với mẫu chứng
[35].
Dịch chiết nước được sắc toàn cây cỏ sữa lá lớn ở mức liều 350 mg/kg và
700mg/kg có tác dụng chống tiêu trên mô hình gây tiêu chảy bởi dầu thầu dầu, acid
arachidonic và prostaglandin E2 [31]. Quercitrin được phân lập từ cỏ sữa lá lớn
cũng được chứng minh hoạt động như một hợp chất có tác dụng chống tiêu chảy từ
mức liều 25 mg/kg [31].
1.4.9. Tác dụng làm lành vết bỏng
Dạng kem 2% (kl/kl) được bào chế từ dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá
lớn có tác dụng làm lành vết thương do bỏng trên chuột đối chiếu với mẫu chứng và
thuốc đối chứng là thuốc mỡ nitrofurazon 0,2% (kl/kl) [39]. Khả năng dọn gốc tự do
của các hợp chất phenolic trong cỏ sữa lá lớn như myricitrin, quercitrin, kaempferol,
luteolin và acid gallic có vai trò quan trọng trong quá trình làm lành vết bỏng [58].
1.4.10. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Dịch chiết ethanol của lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng ức chế sự tăng
trưởng của các chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, và Bacillus subtili [40]. Các hợp chất tanin, alcaloid và


14

flavonoid trong cây được cho là có vai trò chính trong tác dụng kháng khuẩn [40].
Dịch chiết ethyl acetat của lá cỏ sữa lá lớn ức chế sự tăng trưởng của Pseudomonas
aeruginosa,

Staphyloccus

aureus,

Candida

albicans

và

Trichopyton

mentagrophytes [30].
1.4.11. Tác dụng khác
Các dịch chiết của cỏ sữa lá lớn còn có tác dụng giảm đau và an thần [15], trị
hen [29], diệt giun sán [10], diệt ký sinh trùng sốt rét [49], diệt ấu trùng [72] và
nhuyễn thể [72], chống viêm khớp [12], bảo vệ gan [23], kháng virus [32].
1.5. Công dụng
Cây cỏ sữa lá lớn theo kinh nghiệm dân gian được dùng để chữa các bệnh
đường tiêu hóa như tiêu chảy, kiết lỵ, giun sán, nhiễm khuẩn đường ruột [8]; dùng
làm thuốc chữa ho, hen, viêm phế quản, khí phế thũng; các bệnh đường niệu, bệnh
lậu [8], viêm thận, viêm bể thận [1]; cao huyết áp, phù nề [36], chữa tắc tia sữa [1].
Bên cạnh đó, nhựa cỏ sữa lá lớn được dùng để chữa mụn cóc, vết thương [8], viêm
giác mạc, loét giác mạc [1].


15

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nghiên cứu là bộ phận trên mặt đất (BPTMĐ) cây cỏ sữa lá lớn được
thu hái tại xã Dĩ An, huyện Thuận An, tỉnh Bình Dương vào tháng 11 năm 2014.
Mẫu cây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng Tiêu bản - Bộ môn Thực

vật - Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là HNIP/18112/15. Căn cứ
vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối chiếu với khóa phân loại của Thực
vật chí Trung Quốc [21], mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu đã được giám định tên khoa
học là Euphorbia hirta L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
BPTMĐ của cây cỏ sữa lá lớn được sấy khô, cắt thành các đoạn 4-6 cm và
được bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát.
Ảnh chụp mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1 và hình
2.2.

Hình 2.1. Ảnh chụp cây cỏ sữa lá lớn nghiên cứu tại thực địa


16

Hình 2.2. Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn
2.1.2. Hóa chất, dung môi
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:
-

Các dung môi: ethanol tuyệt đối, methanol (MeOH), n-hexan, chloroform
(CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), dichloromethan (CH2Cl2), aceton, toluen, acid
formic.

-

Hóa chất: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, Mỹ).

-

Thuốc thử: Dung dịch ammoniac đặc, acid sulphuric 10% trong ethanol.

2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ
-

Sắc ký cột: các loại cột có đường kính từ 1,6-5,5 cm, chiều dài từ 15-50 cm;
với các chất nhồi cột: Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ), silica gel pha
thuận (silica gel 60; 0,040-0,063 mm; 230 - 400 mesh; Merck, Đức), silica gel
pha đảo YMC (30-50 m; Fujisilisa Chemical Ltd., Nhật Bản).

-

Bản mỏng tráng sẵn pha thuận DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Đức) và bản
mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, Đức).

-

Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ,
ống đong, phễu thủy tinh, ống đựng mẫu NMR,…

-

Máy đo độ ẩm MB 25 Ohaus (Mỹ).


17

-

Bộ dụng cụ bình ngâm, bộ dụng cụ chiết Soxhlet.

-

Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200 (Đức).

-

Đèn soi tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm.

-

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AVANCE AM500 FT-NMR
tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

-

Máy đo quang Hitachi U-1900.

-

Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg.

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

-

Máy ảnh Canon.

-

Bể đun cách thủy Memmert (Đức).

-

Đĩa 96 giếng.

2.2. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu để ra, đề tài được tiến hành với các
nội dung sau:
2.2.1. Nội dung 1: Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ
cỏ sữa lá lớn
Chiết xuất dịch chiết methanol từ bộ phận trên mặt đất cỏ sữa lá lớn và tiến
hành chiết phân đoạn dịch chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được
4 phân đoạn tương ứng là phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và nước.
2.2.2. Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và
các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và 4 phân đoạn
dịch chiết trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro. Lựa chọn phân đoạn dịch
chiết có tác dụng mạnh nhất để tiến hành phân lập các hợp chất.
2.2.3. Nội dung 3: Phân lập và nhận dạng 2 hợp chất từ cỏ sữa lá lớn
Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết
có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất của cỏ sữa lá lớn được lựa chọn ở mục 2.2.2.
2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập
được