nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của một số cây thuốc hướng tác dụng trên gan

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




NGUYỄN NGỌC HỒNG






NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC
HƯỚNG TÁC DỤNG TRÊN GAN





Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 62 42 30 15



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. TRẦN HÙNG
2. PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG







TP.HCM-2010
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả tấm lòng, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy PGS.TS. Trần
Hùng. Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những những kinh nghiệm
quý báu cũng như đã động viên, hỗ trợ em về mọi mặt trong quá trình thực hiện luận
án. Thầy là tấm gương sáng về sự tận tụy trong công việc và khoa học mà em sẽ mãi
noi theo.
Em xin chân thành cảm ơn Cô PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương đã hướng dẫn và
đóng góp ý kiến quý báu để luận án được hoàn thiện hơn.
Em xin bày tỏ lòng ngưỡng mộ và lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS. Huỳnh Ngọc Thụy,
cô đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ cho em rất nhiều về phần thực nghiệm sinh học cũng
như truyền đạt cho em những kinh nghiệm, động viên em những lúc khó khăn nhất
trong quá trình thực hiện luận án.
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Trần Hợp đã định hướng, dẫn
dắt em đến với luận án, động viên em những lúc gặp khó khăn, giúp đỡ em về phần
định danh mẫu.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Hồ Thị Cẩm Hoài, người đã giúp đỡ em rất nhiều
trong thời gian thực hiện phần chiết tách chất, thử nghiệm phần ức chế enzym xanthin
oxidase, hỗ trợ thuốc thử… cũng như động viên em trong những lúc khó khăn khi thực
hiện luận án.

Em rất cảm ơn Thầy TS. Võ Văn Lẹo, Thầy TS. Nguyễn Viết Kình đã cho em những
lời khuyên hữu ích, những kinh nghiệm và kiến thức trong thời gian em thực hiện luận
án tại bô môn Dược liệu.
Em xin cảm ơn PGS.TS. Võ Phùng Nguyên đã giúp đỡ cho em mua chuột bạch tại
viện Pasteur và Sinh phẩm Nha Trang
Xin chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và cán bộ công nhân viên bộ môn Dược liệu
và bộ môn Dược lý - khoa Dược - trường ĐH Y Dược TP. HCM đã tạo điều kiện
cho em thực hiện luận án này.
Em xin cảm ơn thầy Phan Kim Ngọc và các bạn giảng viên trẻ, nghiên cứu viên
trường Đại học Khoa học tự nhiên đã quan tâm, góp ý, tạo điều kiện thuận lợi để em
có thể thực hiện phần tách tế bào trong phòng thí nghiệm “Tế bào gốc” trong giai
đoạn thử nghiệm đầu tiên về phần ex vivo của luận án.
Em chân thành cảm ơn các Thầy, Cô khoa Sinh học-trường Đại học Khoa học tự
nhiên đã hết lòng truyền đạt kiến thức cho em.
Xin cảm ơn ThS-DS. Trần Thị Vân Anh, DS. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và các bạn
làm đề tài cao học, nghiên cứu sinh đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời
gian làm việc tại Bộ môn Dược liệu.
Xin cảm ơn các em sinh viên của trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Y
Dược TP. HCM và Đại học Tôn Đức Thắng đã phụ giúp tôi rất nhiều trong thời gian
làm luận án.
Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp, ban lãnh đạo trường Đại học Tôn
Đức Thắng đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận án này.
Xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện cho tôi học tập, là động lực lớn giúp tôi vượt qua
mọi khó khăn.
Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô,
các bạn sinh viên và gia đình đã quan tâm, động viên và giúp đỡ để tôi có thể hoàn
thành luận án này.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2010
Nguyễn Ngọc Hồng

II

MỤC LỤC

Lời cam đoan I
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VII
Danh mục các bảng X
Danh mục các hình XII
Danh mục sơ đồ XIV
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HĨA 6
1.1.1. Gốc tự do 6
1.1.1.1. Khái niệm về gốc tự do 6
1.1.1.2. Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể 6
1.1.1.3. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể 10
1.1.2. Các chất chống oxy hóa 16
1.1.2.1. Chất chống oxy hóa có bản chất enzym 16
1.2.2.2. Chất chống oxy hóa khơng có bản chất enzym 18
1.2. TỔNG QUAN VỀ GAN VÀ BỆNH LÝ CỦA GAN DO OXY HĨA 23
1.2.1. Cấu trúc gan và các loại tế bào có trong gan 23
1.2.2. Vai trò của các gốc tự do trong phát sinh bệnh trong gan 24
1.2.2.1. Vai trò của gốc tự do trong sự gây tổn thương gan do thiếu máu cục bộ 24
1.2.2.2. Vai trò của gốc tự do trong bệnh gan nhiễm mỡ khơng do cồn 26
1.2.2.3. Vai trò của gốc tự do trong bệnh xơ hóa gan 28
1.2.2.4. Stress oxy hóa trong bệnh viêm gan siêu vi C 28
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC SÀNG LỌC DƯỢC LIỆU CĨ KHẢ NĂNG
CHỐNG OXY HĨA VÀ BẢO VỆ GAN 29
1.3.1. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hố 30
1.3.1.1. Phương pháp phân tích FRAP 30

1.3.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng loại gốc tự do DPPH
•
31
1.3.1.3. Phương pháp đo MDA 31
1.3.1.4. Phương pháp đánh giá khả năng antioxidant với hệ thống
β
-caroten- acid linoleic 32
III

1.3.1.5. Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase 33
1.3.2. Phương pháp xác dịnh hoạt tính bảo vệ gan trên gan bị gây độc bởi CCl
4
gây
độc tế bào 33
1.3.3. Phương pháp phân tích hoạt tính bảo vệ gan do galactosamin gây độc tế bào
nuôi cấy 34
1.3.4. Phương pháp phân tích hoạt tính bảo vệ gan in vivo 34
1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CÂY THUỐC TRỊ BỆNH GAN 34
1.4.1. Râu mèo 36
1.4.2. Chi Polygonum 40
1.4.3. Giới thiệu về cây Cúc gai…………………………………………………… 44
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 47
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 47
2.1.2. Trang thiết bị 49
2.1.3. Hóa chất 50
2.1.3.1. Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất 50
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học 50
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50
2.2.1. Xác định mẫu 50

2.2.2. Nghiên cứu hóa học 51
2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa 51
2.2.2.2. Sơ bộ khảo sát thành phần hóa học 52
2.2.2.3. Chiết xuất cho nghiên cứu hóa học và sinh học 52
2.2.2.4. Sắc ký lớp mỏng 54
2.2.2.5. Phân tách các phân đoạn và phân lập các hợp chất 54
2.2.3. Nghiên cứu xác định cấu trúc của các chất tinh khiết 54
2.2.4. Các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa 54
2.2.4.1. Phương pháp FRAP 54
2.2.4.2. Phương pháp đo MDA 55
2.2.4.3. Phương pháp sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH 56
2.2.4.4. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzym xanthin oxidase 56
2.2.5. Thử tác dụng sinh học bảo vệ tế bào gan ex vivo 57
IV

2.2.5.1. Quy trình rửa và phân tách tế bào gan 57
2.2.5.2. Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng thuốc nhuộm Trypan blue 59
2.2.5.3. Phương pháp đo hoạt độ enzym alanin aminotransferase (ALT/GPT) 59
2.2.5.4. Cách chuẩn bị mẫu và dịch tế bào gan 60
2.2.5.5. Bố trí nhóm thí nghiệm 60
2.2.5.6. Thiết kế thí nghiệm 61
2.2.6. Phương pháp thử tác dụng sinh học trên mô hình in vivo 62
2.2.6.1. Bố trí nhóm thí nghiệm 62
2.2.6.2. Phương pháp tiến hành 62
2.2.6.3. Thiết kế thí nghiệm 63
2.2.7. Thử nghiệm độc tính cấp diễn 63
2.2.8. Phương pháp xử lí số liệu 64
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 65
3.1. KẾT QUẢ SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA IN VITRO
CỦA CÁC DƯỢC LIỆU 65

3.1.1. Chiết xuất các dược liệu thu cho thử nghiệm in vitro 65
3.1.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp FRAP 67
3.1.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp MDA 71
3.1.4. Kết quả chống oxy hóa in vitro theo phương pháp loại gốc tự do DPPH 74
3.1.5. Khảo sát khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của một số dược liệu 79
3.1.6. So sánh kết quả chống oxy hóa in vitro của 4 phương pháp FRAP, MDA,
DPPH và ức chế xanthin oxidase
81
3.2. XÁC ĐỊNH DƯỢC LIỆU CHO PHÂN TÍCH HÓA HỌC VÀ SINH HỌC 84
3.2.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của 4 dược liệu trên sắc ký lớp mỏng 84
3.2.2. Sơ bộ phân tích thành phần hóa học của Nghể và Râu mèo 856
3.2.2.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cây Râu mèo 86
3.2.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cây Nghể 87
3.3. KHẢO SÁT HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ TÁC DỤNG
BẢO VỆ TẾ BÀO GAN EX VIVO CỦA CÂY RÂU MÈO 88
3.3.1. Chiết xuất, phân tách các phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan ex vivo của cây Râu mèo 88
3.3.1.1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp FRAP 89
V

3.3.1.2. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 89
3.3.1.3. Chuẩn hóa qui trình thử tác dụng bảo vệ gan ex vivo 90
3.3.2. Tách phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan từ OA-Et-F 96
3.3.2.1. Tách phân đoạn OA-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột 96
3.3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn sắc ký cột 97
3.3.2.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của 8 phân đoạn sắc ký cột OA-Et-F 100
3.3.3. Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết
từ OAE3 102
3.3.3.1. Phân lập chất tinh khiết từ OAE3 102
3.3.3.2. Xác định cấu trúc của hợp chất A1. 103

3.3.3.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của acid rosmarinic từ cây Râu mèo 105
3.3.3.4. Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của acid rosmarinic 106
3.4. KHẢO SÁT HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ TẾ
BÀO GAN EX VIVO CỦA CÂY NGHỂ POLYGONUM TOMENTOSUM WILLD. 106
3.4.1. Chiết xuất, phân tách các phân đoạn, thử nghiệm chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan ex vivo của cây Nghể 106
3.4.1.1. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp FRAP 107
3.4.1.2. Kết quả sàng lọc các phân đoạn chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 107
3.4.1.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của các phân đoạn của cây Nghể 108
3.4.2. Tách PT-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột, thử hoạt tính chống oxy hóa và
bảo vệ tế bào gan ex vivo của các phân đoạn thu được 110
3.4.2.1. Tách phân đoạn PT-Et-F bằng phương pháp sắc ký cột 110
3.4.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn PTE1-PTE11 111
3.4.2.3. Kết quả bảo vệ tế bào gan của các phân đoạn sắc ký PT- Et-F 114
3.4.3. Phân lập, xác định cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan ex
vivo của các chất từ phân đoạn PTE8-PTE9 116
3.4.3.1. Phân lập các chất tinh khiết 116
3.4.3.2. Xác định cấu trúc các chất tinh khiết 118
3.4.3.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các chất tinh khiết 128
3.4.3.4. Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo của các chất tinh khiết 129
3.5. THỬ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN CHUỘT BỊ NHIỄM ĐỘC CCl
4
CỦA 2
CÂY RÂU MÈO VÀ NGHỂ
130
VI

3.5.1. Kho sỏt phng phỏp 130
3.5.2. ỏnh giỏ tỏc dng bo v gan ca phõn on, cht tinh khit ca cõy Rõu mốo 131
3.5.2.1. So sỏnh hot tớnh bo v gan in vivo ca OA-Et-F 131

3.5.2.2. Hot tớnh bo v gan in vivo ca cht tinh khit ca cõy Rõu mốo 1323
3.5.3. ỏnh giỏ tỏc dng bo v gan ca cỏc phõn on, cỏc cht tinh khit ca cõy
Ngh 134
3.5.3.1. ỏnh giỏ hot tớnh bo v gan ca PT-Et-F trờn chut 134
3.5.3.2. Hot tớnh bo v gan in vivo ca cỏc cht tinh khit ca cõy Ngh 136
3.6. XC NH C TNH CP DIN CA CC PHN ON V CC CHT
TINH KHIT CA 2 CY RU MẩO V NGH
138
3.6.1. Xỏc nh c tớnh ca phõn on v cht tinh khit ca cõy Rõu mốo 138
3.6.2. Kho sỏt c tớnh ca cao chit v cht tinh khit ca cõy Ngh 139
CHNG 4- KT LUN V KIN NGH 142
Danh Muùc Coõng Trỡnh 146
TAỉI LIEU THAM KHAO 146
PH LC A - Phn in vitro 161
PH LC B - Phn ex vivo v in vivo 182
PH LC C Phn ph 195



VII

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa
A Absorbance Độ hấp thu, mật độ quang
ADN Acid deoxyribonucleic
ALT Alanine transaminase Enzym alanin transaminase
ADP Adenosine diphosphate Adenosin diiphosphat
ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphosphat
Bu-F Phân đoạn n-buthanol
CCl

4
Carbon tetrachloride Carbon tetrachlorid
CHCl
3
Cloroform Dung môi cloroform
CHCl
3
-F Phân đoạn cloroform
C-NMR Carbon nuclear magnetic resonance Phổ cacbon
COSY Correlation spectroscopy Phổ COSY
d
Doublet Đỉnh đôi
D Dichloromethane Dichloromethan (cao chiết
dichloromethan)
dd
Doublet of doublet Đỉnh đôi kép
DEPT Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer
Phổ DEPT
DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid
DMSO-d6 Deuterated dimethyl sulfoxide DMSO deuteri-hóa
DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl Thuốc thử 1,1-diphenyl-2-picryl-
hydrazyl
E’MEM Eagle's minimal essential medium Môi trường Eagle
EDTA Ethylendiamin tetraacetate Ethylendiamin tetraacetat
Et-F Phân đoạn ethyl acetat
EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetat
FRAP Ferric ion Reducing Antioxidant
Power
Năng lực chống oxy hóa bằng việc

khử ion sắt (chống oxy hóa)
GPT Glutamat pyruvat transaminase Enzym glutamat pyruvat
transaminase
VIII

GSH Glutathione Glutathion (dạng khử)
GSH-Px Glutathion peroxydase Enzym glutathion peroxydase
GSSG Glutathiondisulfide Glutathione (dạng oxy hóa)

H Cao chiết nước
H
2
O Nước
HCV Hepatitis C Virus Virus viêm gan C
HMBC Heteronuclear multiple bond
correlation
Phổ HMBC (kỹ thuật phổ NMR)
H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng proton
HSC Hepatic Stellate Cell Tế bào hình sao
HSQC Heteronuclear singlet quantum
coherence spetroscopy
Phổ HSQC (kỹ thuật phổ NMR)
IC Inhibitory concentration Nồng độ ức chế
IR Infrared spetroscopy Phổ hồng ngoại
J
Coupling constant Hằng số ghép
LC-MS Liquid chromatography-mass
spectrometry
Sắc ký lỏng-khối phổ
LDL Low density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng thấp

M Cao chiết metanol
M
Multiplet Đỉnh đa
MDA Malonyldialdehyde Malonyldialdehyd
MeOH Methanol Dung môi metanol
MS Mass spetrometry Khối phổ
NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate

n-BuOH n-buthanol n-butanol
NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân
OA
Orthosiphon aristatus
Râu mèo
OAE

Phân đoạn sau khi sắc ký cột phân
đoạn ethyl acetat của cây Râu mèo
IX

PBS Phosphate buffered saline Đệm phosphat
ppm Part per million Phần triệu
PT
Polygonum tomentosum
Nghể
PTE

Phân đoạn sau khi sắc ký cột phân
đoạn ethyl acetat của cây Nghể
RNS Reactive nitrogen species Các dạng hoạt động của nitrogen

ROS Reactive oxygen species Các dạng hoạt động của oxygen
s
Singlet Đỉnh đơn (kỹ thuật phổ NMR)
SOD Superoxide dismutase Enzym superoxide dismutase
TBA Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric
TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazine Thuốc thử 2,4,6-tripyridyl-s-
triazine
U Unit Đơn vị (enzym)
UV Ultraviolet Tử ngoại
δ
C
Carbon chemicalshift Chuyển dịch hóa học của cacbon
δ
H
Proton chemicalshift Chuyển dịch hóa học của hydro

X

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số dược liệu thường được dùng để trị bệnh gan 34
Bảng 1.2. Các gốc hóa học trong các chất flavon của cây Râu mèo 37
Bảng 1.3. Một số các flavonoid thường gặp trong chi Polygonum 41
Bảng 2.1. Các mẫu thử nghiệm và bộ phận sử dụng 47
Bảng 3.1. Hiệu suất cao chiết D, M, H từ các dược liệu 65
Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của 180 cao chiết trong phương pháp FRAP 68
Bảng 3.3. Kết quả chống oxy hóa của 180 cao chiết trong thử nghiệm MDA 71
Bảng 3.4. Kết quả chống oxy hóa của 180 cao chiết trong phương pháp DPPH 75
Bảng 3.5. Giá trị IC
50
của 19 cao chiết mạnh nhất và chất đối chứng acid ascorbic 78

Bảng 3.6. Kết quả ức chế enzym xanthin oxidase của 90 cao chiết 80
Bảng 3.7. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cây Râu mèo 86
Bảng 3.8. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật cây Nghể 87
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn cây Râu mèo bằng
phương pháp FRAP 89
Bảng 3.10. Kết quả thử hoạt tính loại gốc tự do DPPH của các phân đoạn cây Râu mèo89
Bảng 3.11. Kết quả tách tế bào đơn bằng enzym collagenase loại I 91
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát hiệu quả bảo vệ tế bào gan chống lại CCl
4
của các phân đoạn
cây Râu mèo và silymarin 95
Bảng 3.13. Giá trị IC
50
của 8 phân đoạn cây Râu mèo và acid ascorbic 99
Bảng 3.14. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký
của cây Râu mèo bằng phương pháp FRAP 100
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát hiệu quả bảo vệ tế bào gan ex vivo chống lại CCl
4
của OAE1-
OAE8 101
Bảng 3.16. Dữ liệu phổ carbon, proton và các tương tác trong COSY, HMBC của A1 so
sánh với acid rosmarinic 104
Bảng 3.17. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn cây Nghể bằng phương
pháp FRAP 107
Bảng 3.18. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH của các phân đoạn cây Nghể 108
Bảng 3.19. Hiệu quả bảo vệ tế bào gan ex vivo chống lại chất độc CCl
4
của các phân đoạn
cây Nghể và silymarin 109
XI

Bảng 3.20. Giá trị IC
50
của 11 phân đoạn của cây Nghể và acid ascorbic 113
Bảng 3.21. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn sắc ký của cây Nghể
bằng phương pháp FRAP 114
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát hiệu quả bảo vệ tế bào gan ex vivo chống lại CCl
4
của các
phân đoạn sắc ký của cây Nghể 115
Bảng 3.23. Chuyển dịch hóa học của proton của A2 so với với quercitrin 120
Bảng 3.24. Chuyển dịch hóa học của carbon của A2 so với với quercitrin 120
Bảng 3.25. Chuyển dịch hóa học của proton của A4 so với với quercetin glucuronic 123
Bảng 3.26. Chuyển dịch hóa học của carbon của A4 so với với quercitrin và quercetin
glucuronic. 123
Bảng 3.27. Chuyển dịch hoá học và tương tác của A3 so sánh với quercitrin-3-O-β-D-
galactopyranosid và quercitrin-3-O-β-D-glucopyranosid (isoquercitrin) 126
Bảng 3.28. Hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết bằng phương pháp FRAP .
128
Bảng 3.29. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH của các chất tinh khiết của cây Nghể và Râu
mèo 129
Bảng 3.30. Kết quả xác định hiệu quả bảo vệ tế bào gan chống lại CCl
4
của các chất tinh
khiết và silymarin 129
Bảng 3.31. Kết quả gây độc của CCl
4
trên các nhóm chuột thử nghiệm sau 24h 130
Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độc tính của các cao chiết và các chất tinh khiết của cây Râu
mèo và Nghể trên các nhóm chuột thử nghiệm sau 48h 139

XII

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sự phát sinh ROS trong tế bào và hệ thống quét sạch nó trong suốt quá trình
thiếu máu cục bộ-tái tưới máu lại 18
Hình 1.2. Phản ứng của quercetin với gốc tự do superoxid 22
Hình 1.3. Cấu trúc của gan 23
Hình 1.4. Cơ chế tổn thương tế bào gây ra bởi peroxid lipid trong bệnh gan nhiễm mỡ
không do cồn 27
Hình 1.5. Quá trình hình thành xơ trong gan 28
Hình 1.6. Phản ứng FRAP 31
Hình 1.7. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 31
Hình 1.8. Phản ứng tạo sản phẩm MDA-TBA 32
Hình 2.1. Kết quả của quá trình phân lập và tách tế bào gan chuột 58
Hình 3.1
. Biểu đồ kết quả thử tác dụng chống oxy hóa in vitro trên phương pháp FRAP
của 18 dược liệu có cao chiết tác dụng mạnh 70
Hình 3.2. Biểu đồ kết quả thử hoạt tính ức chế sự peroxid hóa của 18 dược liệu có các
cao chiết tác dụng mạnh 73
Hình 3.3. Biểu đồ kết quả thử tác dụng chống oxy hóa in vitro trên phương pháp DPPH
của 13 dược liệu có các cao chiết tác dụng mạnh 77
Hình 3.4. Đồ
thị kết quả thử hoạt tính loại gốc tự do DPPH của 19 cao chiết có hoạt
tính mạnh nhất so sánh với acid ascorbic 78
Hình 3.5. Sắc ký đồ của 4 cao M của 4 cây sau khi nhúng thuốc thử DPPH 0,2% trong
dung môi methanol 85
Hình 3.6. Đồ thị kết quả ảnh hưởng của nồng độ CCl
4
và thời gian ủ đến sự thay đổi

hoạt độ enzym gan của môi trường nuôi tế bào 94
Hình 3.7. Sắc ký đồ 8 phân đoạn thu được từ cao OA-Et-F của cây Râu mèo phát hiện
bằng UV
254
và UV
365
nm 97
Hình 3.8. Sắc ký đồ 8 phân đoạn từ cao OA-Et-F của cây Râu mèo phát hiện bằng
thuốc thử FeCl
3
. 97
XIII

Hình 3.9. Sắc ký đồ 8 phân đoạn thu được sau khi qua cột của cây Râu mèo với thuốc
thử DPPH 98
Hình 3.10. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH của 8 phân đoạn so sánh với acid ascorbic
99
Hình 3.11. Các tương tác H-H và tương tác xa H-C của acid rosmarinic 105
Hình 3.12. Sắc ký đồ 11 phân đoạn thu được sau khi qua cột của cây Nghể ở bước
sóng 254 nm và 365 nm 111
Hình 3.13. Sắc ký đồ 11 phân đoạn của cây Nghể sau khi phát hiện bằng thuốc thử
FeCl
3
111
Hình 3.14. Sắc ký đồ 11 phân đoạn sắc ký cột của PT-Et-F với thuốc thử DPPH 112
Hình 3.15. Đồ thị kết quả hoạt tính loại gốc tự do DPPH của 9 phân đoạn (PTE3-
PTE11) của cây Nghể so sánh với acid ascorbic 113
Hình 3.16. Các tương tác H-H và tương tác xa H-C của A2 (quercitrin) 121
Hình 3.17. Tương tác quan sát được trong phổ COSY và HMBC của A4 124
Hình 3.18. Các tương tác H-H và tương tác xa H-C của quercetin-3-O-β-D-

galactopyranosid 127
Hình 3.19. Biểu đồ hiệu quả của OA-Et-F và silymarin trên hoạt độ c
ủa ALT trong
huyết tương do CCl
4
cảm ứng tổn thương gan chuột in vivo 132
Hình 3.20. Biểu đồ kết quả đánh giá tác dụng của acid rosmarinic và silymarin trên
hoạt độ của ALT trong huyết tương chuột 134
Hình 3.21. Biểu đồ hiệu quả của PT-Et-F và silymarin trên hoạt độ của ALT trong
huyết tương do CCl
4
cảm ứng tổn thương gan chuột in vivo 136
Hình 3.22. Biểu đồ hiệu quả của các chất tinh khiết của cây Nghể và silymarin trên
hoạt độ của ALT trong huyết tương do CCl
4
cảm ứng tổn thương gan chuột in vivo
137
XIV

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1. Quá trình perixide hóa lipid 13
Sơ đồ 1.2. Sự tạo thành ROS bởi hệ thống xanthin/xanthin oxidase trong thiếu máu
cục bộ 26
Sơ đồ 2.1. Chiết tách dược liệu tạo cao D, M, H 52
Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết xuất để thu các phân đoạn có độ phân cực tăng dần của
cây Râu mèo và Nghể 53
Sơ đồ 3.1. Chuẩn hóa qui trình rửa và tách tế bào gan chuẩn bị cho thử nghiệm bảo
vệ gan ex vivo 92
1

MỞ ĐẦU
Gốc tự do là một tác nhân độc hại gây ra nhiều bệnh như bệnh về đường tim mạch,
các bệnh về gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, ung thư,… Về mặt hóa học, gốc tự do
rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học với các hợp chất như
protein, lipid, carbohydrat, DNA, … trong cơ thể. Điều này dẫn đến sự rối loạn và
mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây nên các bệnh
[16], [76]. Do đó, việc tìm ra những hợp chất chống oxy hóa có khả năng ức chế các
gốc tự do hoặc ức chế các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do là điều cần thiết để
ngăn ngừa nhiều loại bệnh tật. Các chất chống oxy hóa có thể có nguồn gốc từ thiên
nhiên hoặc được tổng hợp hóa học. Tuy nhiên, những hợp chất chống oxy hóa được
tổng hợp hóa học có th
ể gây ung thư nên việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ
tự nhiên có thể hạn chế được nguy cơ này [
105], [137].
Nguồn thực vật ở Việt Nam khá phong phú và đa dạng vì Việt Nam là quốc gia nằm
trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú (trên 12.000 loài thực
vật bậc cao) với nguồn dược liệu dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có
nguồn gốc tự nhiên từ lâu đời (gần 4000 loài cây thuốc). Đây là một nguồn nguyên
liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như nhữ
ng
nghiên cứu về hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại.
Nguồn dược liệu tự nhiên không chỉ bổ sung thuốc cho hóa trị liệu, mà còn góp
phần không nhỏ vào việc khắc phục các tác dụng phụ do các hóa chất tổng hợp gây
nên. Nguồn tài nguyên đa dạng của sinh giới kết hợp với sự phát triển không ngừng
của khoa học công nghệ và tiến bộ của các thiết bị nghiên cứu là cơ sở
khoa học
giúp con người tìm ra thuốc mới đề phòng và chống lại các loại bệnh tật.
Ngày nay, các chứng bệnh về gan đang trở thành một trong số bệnh phổ biến và có
nguy cơ tử vong cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức

Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 2 tỉ người nhiễm viêm gan B và có
khoảng một triệu người tử vong do biến chứ
ng của viêm gan B như xơ gan, ung thư
gan, chưa kể số người bị nhiễm viêm gan A, C và những bệnh lý khác về gan như
gan bị nhiễm độc, nhiễm mỡ, loạn chức năng gan, xơ gan do môi trường sống, do sử
2

dụng kháng sinh và thói quen ăn uống (sử dụng dầu bị peroxid hóa, uống rượu bia
…) [
48], [138], [143].
Gan có vai trò quan trọng trong quá trình sinh lý học của cơ thể sống do gan tham
gia trong quá trình trao đổi chất, tổng hợp và dự trữ. Ngoài ra gan còn giải độc
những hoá chất gây độc cho cơ thể và tiết ra mật để tiêu hoá lipid. Những bệnh lý
khác nhau của gan phần lớn do sự peroxid hóa và stress oxy hóa. Các bệnh về gan
gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ và giảm tuổi thọ. Người bị bệnh gan nặng
như xơ gan, ung thư gan, áp xe gan… có th
ể dẫn đến tử vong [48].
Thuốc chữa bệnh gan chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật. Những loại thuốc này có
tác dụng trị bệnh gan chủ yếu là do khả năng chống oxy hóa, phục hồi tế bào gan,
tăng tiết mật… đã được sử dụng lâu đời trong dân gian dưới dạng thuốc sắc và trong
y học hiện đại sử dụng dưới dạng cao chiết toàn phần hay hoạt chất tinh khiết.
Nhiều loại thuốc chữa bệnh hiện nay của y học hiện đại được phát triển từ những
dược liệu, bài thuốc cổ truyền bằng các nghiên cứu theo định hướng của các thử
nghiệm sinh học, từ đó, thu được hoạt chất tinh khiết có tác dụng đáp ứng được yêu
cầu của y học hiện đại. Các nhà nghiên cứu đã phân lập và xác định được cấu trúc
c
ủa hơn 160 chất từ 101 loài thực vật khác nhau có hoạt tính bảo vệ gan. Những loại
chất này thuộc các nhóm hợp chất là phenyl propanoid, terpenoid, flavonoid, các
loại acid hữu cơ và chất béo, hợp chất có nitơ [
78], [143]. Ngày nay, những nghiên

cứu theo định hướng của các thử nghiệm sinh học đã được chứng minh là hướng đi
đúng đắn có thể giúp tìm ra được các dược liệu, các hoạt chất từ dược liệu có tác
dụng điều trị. Hướng đi này hiện được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới áp dụng
để nghiên cứu các chất có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan.
Mục tiêu đề tài
Trên cơ sở k
ế thừa những tinh hoa của y học cổ truyền kết hợp với những tiến bộ
của khoa học hiện đại, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống
oxy hóa của một số cây thuốc hướng tác dụng trên gan” được thực hiện với mục
tiêu sàng lọc, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của một số cây thuốc trong
nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú của Việt Nam,. góp phầ
n vào việc tìm ra
3

những dược liệu và các chất có trong dược liệu có khả năng sử dụng trong phòng
ngừa và điều trị một số bệnh gan hiện nay.
Những nội dung nghiên cứu của đề tài
- Sàng lọc một số cây thuốc được sử dụng điều trị bệnh liên quan đến gan trên
một số mô hình thử nghiệm sàng lọc chống oxy hóa. Từ đó chọn ra một hoặc
mộ
t vài cây có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng
sinh học.
- Nghiên cứu chiết xuất, phân tách các phân đoạn và phân lập các hợp chất tinh
khiết từ các dược liệu đã chọn theo định hướng của các thử nghiệm sinh học để
tìm ra các phân đoạn đơn giản và các chất tinh khiết có hoạt tính chống oxy hóa
và tác dụng bảo vệ tế bào gan.
- Xác định cấu trúc hóa học c
ủa các hoạt chất đã phân lập được.
- Đánh giá tác dụng sinh học của một số phân đoạn của dược liệu và các chất tinh
khiết phân lập được trên các mô hình thử nghiệm dược lý và độc tính trên gan.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Những đóng góp của luận án:
- Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các dược liệu: Đã đánh giá tác
dụng chố
ng oxy hóa của 180 cao chiết của 56 dược liệu trên các mô hình thử
nghiệm chống oxy hóa in vitro FRAP, MDA, DPPH và xanthin oxidase, đã tìm ra
được một số dược liệu và phân đoạn chiết của dược liệu có tác dụng chống oxy hóa
tốt giúp định hướng cho các nghiên cứu cũng như việc sử dụng các dược liệu sau
này. Đề tài đã xác định được tác dụng chống oxy hóa của 10 dược liệu và 4 bộ phận
dùng của dược liệu mà ch
ưa có nghiên cứu trong và ngoài nước đề cập đến là
Bupleurum sinense, Crescentia cujete, Carica papaya (lá), Datura metel,
Desmodium heterophyllum, Dolichos lablab, Durio zibethinus, Milletia sp.,
Momordica charantia (rễ), Morinda persicaefolia, Oroxylum indicum (vỏ thân),
Oxalis corniculata, Polygonum tomentosum. Trong các dược liệu đã khảo sát có 4
dược liệu có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất là Polygonum tomentosum, Durio
4

zibethinus (rễ), Orthosiphon aristatus, Milletia sp. Hai dược liệu Orthosiphon
aristatus (Râu mèo) và Polygonum tomentosum (Nghể) đã được nghiên cứu sâu hơn
về hóa học và tác dụng sinh học trên gan.
- Nghiên cứu về hóa học: Đã định tính sơ bộ thành phần hóa học của cây Nghể
(P.tomentosum) mà chưa có bất cứ tài liệu nào công bố. Cây Nghể có nhiều các hoạt
chất polyphenol như flavonoid và tanin là những chất được biết có tính chống oxy
hoá mạnh. Ba flavonoid được phân lậ
p và định danh từ cây Nghể (quercitrin,
quercetin-3-O-D-glucuronic và hyperin) là các flavonoid lần đầu tiên được báo cáo
là thành phần của loài này.
- Nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của Râu mèo và Nghể:
Phân đoạn chiết ethyl acetat của hai cây Râu mèo và Nghể, acid rosmarinic.

quercitrin, quercetin-3-O-D-glucuronic đều có tác dụng chống oxy hóa mạnh và bảo
vệ gan khá tốt. Phân đoạn chiết ethyl acetat của 2 cây có tác dụng bảo vệ gan gần
tương đương với silymarin. Trong đó tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân
đo
ạn ethyl acetat của 2 cây Râu mèo và Nghể và tác dụng bảo vệ gan của acid
rosmarinic, quercetin-3-O-D-glucuronic chưa thấy được công bố trong bất kỳ tài
liệu nào trong và ngoài nước.
Các kết quả nghiên cứu của luận án đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng của cây
Râu mèo và Nghể trong bảo vệ và điều trị bệnh gan nói riêng và trong việc phòng
ngừa nhiều loại bệnh tật nói chung. Cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus) là một
loài cây thuốc đã được sử dụng r
ộng rãi trên thế giới để làm thuốc lợi tiểu, lợi mật.
Kết quả nghiên cứu của luận án đã mở ra hướng sử dụng dược liệu này trong điều
trị bệnh lý của gan với tác dụng chống oxy hóa, góp phần tăng thêm giá trị sử dụng
của cây thuốc này. Riêng với cây Nghể (Polygonum tomentosum) - một loài cây
mọc hoang dại, gặp ở nhiều vùng trong nước nhưng việc sử
dụng làm thuốc vẫn còn
giới hạn; các kết quả nghiên cứu cho thấy đây là một loài cây thuốc có giá trị trong
chống oxy hóa, dập tắt gốc tự do, bảo vệ gan và mở ra hướng nghiên cứu cho các đề
tài tiếp theo về cả hóa học và tác dụng sinh học theo hướng sử dụng loài thực vật
này trong sử dụng làm thuốc trị bệnh gan.
5

Các kết quả nghiên cứu cũng chứng minh tính đúng đắn của hướng nghiên cứu cây
thuốc theo định hướng của tác dụng sinh học. Với định hướng này tác dụng bảo vệ
gan của Râu mèo đã được phát hiện với acid rosmarinic là một trong những thành
phần chính có tác dụng.
6

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA
1.1.1. Gốc tự do
1.1.1.1. Khái niệm về gốc tự do
Trong hóa học, gốc tự do được khái niệm là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc
phân tử ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi. Gốc tự do có thể tồn
tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự do thường rất ngắn (khoảng
một phần triệu đến một phần nghìn giây) [115]. Các electron này có năng lượng
cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng
oxy hóa – khử, phản ứng polymer hóa…
Các gốc tự do hình thành khi có sự đứt nối đồng ly các liên kết cộng hóa trị. Quá
trình này cần năng lượng. Quá trình phản ứng oxy hóa khử một điện tử cũng tạo
thành gốc tự do. Ví dụ như phản ứng Fenton tạo gốc tự do HO
•
từ H
2
O
2
dưới sự xúc
tác của ion sắt là một ví dụ điển hình của phản ứng oxy hóa khử một điện tử [
23],
[151].
Fe
2+
+ H
2
O
2
Æ Fe
3+
+ HO

•
+ HO
-
(1.1)
Fe
3+
+ H
2
O
2
Æ H
+
+ HOO
●
+ Fe
2+
(1.2)
1.1.1.2. Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể
Các gốc tự do trong cơ thể sinh vật có 2 nguồn gốc, đó là nguồn nội sinh và nguồn
ngoại sinh. Gốc tự do có nguồn nội sinh là các gốc tự do được chính cơ thể tạo ra.
Gốc tự do có nguồn ngoại sinh được hình thành trong cơ thể do các yếu tố ngoại lai
như ô nhiễm môi trường, tác động của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời, thuốc lá,
rượu, thuốc chữa bệnh
a) Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh
Gốc tự do được hình thành trong cơ thể do những quá trình chuyển hóa tự nhiên
như hô hấp tế bào, quá trình trao đổi chất của tế bào. Ti thể là nguồn tạo ra nhiều
các gốc tự do nội bào. Trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp tế bào một số điện tử
bị rò rỉ khỏi chuỗi dẫn đến hậu quả là chúng tương tác với phân tử oxy để hình
7

thành gốc superoxid. Khoảng 2-5% oxy sử dụng cho sự trao đổi chất hiếu khí trong
ti thể bị chuyển thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species:
ROS). Các gốc tự do khác được hình thành trong cơ thể như là vũ khí sinh học
chống lại virus, vi khuẩn, tế bào ung thư, [9].
Các cơ quan tử của tế bào
Các cơ quan tử của tế bào như ti thể, lạp thể, vi thể, peroxisom và nhân tế bào sinh
ra gốc O
2
·
⁻
.

Ti thể là nơi các phản ứng oxy hóa khử trong tế bào xảy ra, việc rò rỉ
trong hệ thống truyền điện tử trên màng ti thể sẽ chuyển O
2
thành O
2
·
⁻
. O
2
·
⁻
tăng
trong 2 trường hợp: Nồng độ oxy cao hoặc chuỗi hô hấp trở nên bị khử (trong
trường hợp thiếu máu cục bộ/ tưới máu lại).
Vi thể tạo ra 80% H
2
O
2

khi hoạt động tế bào diễn ra bình thường và tạo ra 100%
H
2
O
2
trong tình trạng tăng oxy. Trong điều kiện sinh lý bình thường peroxisom tạo
H
2
O
2
nhưng không tạo ra O
2
·
⁻
. Sự oxy hóa acid béo của peroxisom tạo ra một lượng
lớn H
2
O
2
khi cơ thể bị đói kéo dài [165].
Các enzym oxy hoá
Nhiều hệ thống enzym có thể tạo ra các gốc tự do bao gồm: Xanthin oxidase (được
hoạt hoá trong thiếu máu cục bộ/tưới máu lại) prostaglandin synthase, NADPH
oxidase, nitric oxide synthase (NOS), lipoxydase, aldehyd oxidase, và amino acid
oxidase. Enzym myeloperoxidase được tạo ra do sự hoạt hoá bởi bạch cầu trung
tính, sử dụng hydrogen peroxid để oxy hóa ion Cl
-
thành hợp chất HOCl có khả
năng oxy hóa mạnh [72], [84], [108].
Bùng phát hô hấp

Bùng phát hô hấp (respiratory burst) là thuật ngữ được dùng để mô tả những tế bào
bạch cầu sử dụng một lượng lớn oxy trong suốt quá trình thực bào, 70-90% oxy tiêu
thụ được dùng để tạo superoxid. Màng tế bào bạch cầu đa nhân có enzym NADPH
oxidase tồn tại ở thể bất hoạt. Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào
cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này
enxym NADPH oxidase ở màng bạch cầu sẽ được hoạt hóa. Việc hoạt hóa này khởi
8

động cho sự bùng phát hô hấp tại màng tế bào, NADPH oxidase xúc tác phản ứng
giữa O
2
và NADPH tạo nên gốc tự do superoxid O
2
●
, từ đó tạo nhiều gốc tự do
khác nhằm tiêu diệt vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ. Tuy nhiên, một phần các gốc tự
do sẽ thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm. Như vậy trong các hội
chứng viêm đã hình thành các gốc tự do dưới xúc tác của enzym NADPH oxidase
[32].
Ion kim loại chuyển tiếp
Ion sắt và đồng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành gốc tự do. Các ion
kim loại này tham gia trong phản ứng Haber-Weiss tạo ra OH· từ O
2
·⁻ và H
2
O
2


(phản ứng 1.1 và 1.2). Phản ứng này làm tăng thêm sự oxy hóa những phân tử

không phải là enzym như epinephrin và glutathion hình thành O
2
·⁻ và H
2
O
2
từ OH·
[20], [151].
Bên cạnh đó, ion sắt và đồng còn gây nguy hiểm cho tế bào do khả năng oxy hóa và
peroxid hóa lipid. Chúng phân hủy lipid hydroperoxid thành peroxyl và alkoxyl, các
gốc này tham gia vào phản ứng dây chuyền peroxid hóa lipid gây nguy hiểm cho tế
bào [73]. Ion đồng là nhân tố quan trọng gây ra sự oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp
(LDL) [56].
Hội chứng thiếu máu cục bộ - tái tưới máu
Thiếu máu cục bộ là sự tưới máu bị gián đoạn và giảm oxy trong tế bào và mô. Khi
mô bị cung cấp thiếu oxy tạm thời (trong nhồi máu hoặc trong quá trình phẫu thuật)
sau đó máu được cung cấp lại bình thường có thể là nguyên nhân tạo ra các gốc tự
do. Bản chất của thiếu máu cục bộ/tưới máu lại là để chỉ một loạt những ảnh hưởng
góp phần vào việc tạo các gốc tự do. Thông thường xanthin oxidase xúc tác phản
ứng hypoxanthin thành xanthin và cuối cùng là acid uric. Phản ứng này đòi hỏi chất
nhận điện tử như là một cofactor. Trong quá trình thiếu máu cục bộ có 2 yếu tố xuất
hiện, thứ nhất là sản phẩm xanthin và xanthin oxidase được tăng cường. Thứ hai là
mất cả hai chất chống oxy hóa là superoxid dismutase và glutathion peroxidase.
9

Phân tử oxy như là chất nhận điện tử và cofactor của xanthin oxidase là nguyên
nhân tạo ra O
2
·⁻và H
2

O
2
(sơ đồ 1.2).
Việc vận động gắng sức được cho là hoạt hóa phản ứng xúc tác bởi xanthin oxidase
và phát sinh nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim [92], [165].
b) Gốc tự do ngoại sinh
Thuốc
Nhiều loại thuốc chữa bệnh có thể tạo ra nhiều gốc tự do khi có sự hiện diện của
oxy. Những loại thuốc này gồm có kháng sinh có nhóm quinoid, thuốc chống ung
thư như bleomycin, anthracyclin (adriamycin) và loại thuốc cản trở sự phát triển tế
bào có hoạt động của chất tiền oxy hoá. Những gốc là dẫn xuất của penicillamin,
phenylbutazon, acid fenamic và aminosalicylat, hợp chất của sulphasalazin có thể
ức chế protease, làm giảm acid ascorbic và làm tăng nhanh sự peroxid hóa lipid.
Sự bức xạ
Xạ trị làm tổn thương mô mà nguyên nhân là do các gốc tự do. Bức xạ điện từ (tia
X, tia gamma) và những bức xạ hạt (electron, photon, neutron, alpha và hạt beta)
tạo ra những gốc tự do nguyên thủy bằng việc chuyển năng lượng của chúng cho
thành phần của tế bào như nước. Những gốc này có thể phản ứng với oxy hòa tan
trong dịch tế bào để hình thành ROS [9].
Khói thuốc
Những chất oxy hóa trong khói thuốc đóng vai trò chính gây tổn thương đường hô
hấp. Những chất này làm giảm các chất chống oxy hóa trong tế bào phổi in vivo bởi
cơ chế liên quan đến stress oxy hóa. Khói thuốc có một lượng lớn những chất như
aldehyd, epoxid, peroxid và những gốc oxy hóa khác mà chúng có khả năng tồn tại
trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công phế nang. Bên cạnh đó khói thuốc
chứa các gốc tự do bền trong nhựa thuốc như semiquinon có dẫn xuất từ quinon và
hydroquinon. Sự vi xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm
thấy ở mô phổi của những người hút thuốc. Sắt trong thể này phản ứng với
hydrogen peroxid hình thành gốc hydroxyl gây nguy hiểm cho tế bào [58]. Những