Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện đồng thời 3 paraben bị cấm sử dụng trong các mẫu son, phấn và kem bôi da mỹ phẩm

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LIÊN
MÃ SINH VIÊN: 1101289

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI 3 PARABEN
BỊ CẤM SỬ DỤNG TRONG CÁC MẪU SON,
PHẤN VÀ KEM BÔI DA MỸ PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LIÊN
MÃ SINH VIÊN: 1101289

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI 3 PARABEN
BỊ CẤM SỬ DỤNG TRONG CÁC MẪU SON,
PHẤN VÀ KEM BÔI DA MỸ PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Thị Hường Hoa

2. GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu
Nơi thực hiện:
Khoa mỹ phẩm
Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin cảm ơn GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu, TS. Lê Thị
Hường Hoa - hai người thầy đã hướng dẫn cho tôi những kỹ năng cần thiết trong quá
trình thực hiện khoá luận.
Khoá luận của tôi được thực hiện tại Khoa Mỹ phẩm- Viện kiểm nghiệm thuốc
Trung ương. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS. Hoàng Thanh Tâm cùng với
sự giúp đỡ, hướng dẫn của cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ phẩm.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Hoá Phân tích và Khoa Mỹ phẩm (Viện
kiểm nghiệm) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo
nhà trường và các thầy cô đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã luôn động viên tôi
trong quá trình học tập cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Liên


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ PARABEN ............................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm chung...................................................................................................... 3
1.1.2. Ứng dụng của paraben. .......................................................................................... 4
1.1.3. Độc tính của paraben .............................................................................................. 5
1.1.4. Hành động đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben ........................................... 6
1.1.5. Một số nghiên cứu về phân tích Paraben trong mỹ phẩm ...................................... 7
1.1.6. Các paraben bị cấm được nghiên cứu xác định trong đề tài. ................................. 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ......................................................... 8
1.2.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................ 8
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ............................................................................ 8
1.2.3. Cấu tạo máy HPLC ................................................................................................ 9
1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký........................................................ 11
1.2.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký ............................................. 12
1.2.6. Ứng dụng HPLC .................................................................................................. 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 16
2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT. ................................................................................ 16
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 16
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................. 17
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 17
2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ........................................... 19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN .................................. 20
3.1. KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU ................................................ 20
3.1.1. Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu .......................................................................... 20
3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu ............................................................................................... 20


3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..................................................... 21
3.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký .................................................................................... 21
3.2.2. Cách tiến hành ...................................................................................................... 21
3.2.3. Cách đánh giá kết quả .......................................................................................... 21

3.3. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH .................................................................................... 21
3.3.1. Đánh giá độ thích hợp hệ thống: .......................................................................... 21
3.3.2. Độ đặc hiệu .......................................................................................................... 22
3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính ................................................................................... 25
3.3.4. Đánh giá độ đúng ................................................................................................. 28
3.3.5. Độ lặp lại .............................................................................................................. 33
3.3.6. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ...................................... 33
3.3.7. Áp dụng kiểm tra các mẫu mỹ phẩm ................................................................... 34
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC: Hight performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao)
UV-VIS: tử ngoại- khả kiến
IPP: Isopropylparaben
IBuP: Isobutylparaben
BenP: Benzylparaben
LOD: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)
GC-MS: Gas Chromatography Mass Spectometry (Phương pháp sắc ký khí khối phổ)
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối
CSSX: cơ sở sản xuất


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tính chất của một số paraben thường gặp ....................................................... 3
Bảng 2.1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích .................. 16
Bảng 3.1. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký .................................................................. 22

Bảng 3.2. Thời gian lưu của các chất nghiên cứu trên các loại mẫu thử khác nhau. ..... 25
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của isopropylparaben ........................... 25
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của isobutylparaben ............................. 26
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của benzylparaben ................................ 27
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben trên
nền son............................................................................................................................ 29
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben trên nền
son .................................................................................................................................. 29
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên nền
son .................................................................................................................................. 30
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben trên
nền kem .......................................................................................................................... 30
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben trên
nền kem .......................................................................................................................... 31
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên nền
kem ................................................................................................................................. 31
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben trên
nền phấn ......................................................................................................................... 32
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben trên
nền phấn ......................................................................................................................... 32
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên nền
phấn ................................................................................................................................ 33
Bảng 3.15. LOD và LOQ của các paraben nghiên cứu.................................................. 33
Bảng 3.16. Kết quả phân tích đồng thời các paraben cấm ............................................. 34


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 3.1. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu kem
so với mẫu chuẩn............................................................................................................ 23
Hình 3.2. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu son

so với mẫu chuẩn. ........................................................................................................... 24
Hình 3.3. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu phấn
so với mẫu chuẩn. ........................................................................................................... 24
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
isopropylparaben ............................................................................................................ 26
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
isobutylparaben .............................................................................................................. 27
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ benzylparaben
........................................................................................................................................ 28
Hình 3.7 Sắc ký đồ phát hiện các paraben trong mẫu khăn ướt Rosy ........................... 36


-1-

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao, nhu
cầu chăm sóc cho bản thân càng trở nên thiết yếu, do đó mỹ phẩm trở thành sản
phẩm tiêu dùng quen thuộc. Mỹ phẩm còn là loại sản phẩm, hàng hóa có lợi nhuận
cao nên vì lợi nhuận mà việc sản xuất, kinh doanh, buôn bán mỹ phẩm kém chất
lượng, không an toàn là khó tránh khỏi, do đó việc đảm bảo chất lượng các sản
phẩm mỹ phẩm cần được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là các cơ quan quản lý.
Ngày 13 tháng 4 năm 2015, dựa trên kết quả kỳ họp Hội đồng mỹ phẩm
ASEAN lần thứ 21, Cục quản lý dược ban hành công văn số 6577/QLD-MP về việc
cập nhật quy định về các chất dùng trong mỹ phẩm, trong đó có công bố danh sách
5 paraben không được dùng trong mỹ phẩm là isopropylparaben, isobutylparaben,
phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben.
Paraben là nhóm chất kháng khuẩn và kháng nấm, được dùng làm chất bảo
quản để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn (do nấm hoặc vi khuẩn) và hạn chế sự phân hủy
của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc, mỹ phẩm [36]. Ước tính có
khoảng 75-90% sản phẩm mỹ phẩm có sử dụng dẫn chất paraben làm chất bảo quản

(thường ở mức rất thấp) [39]. Dù chưa đủ bằng chứng đề khẳng định nhưng nhiều
nghiên cứu chỉ ra rằng các dẫn chất paraben có thể gây ung thư vú cho người sử
dụng [37]. Để đảm bảo lợi ích và an toàn cho người tiêu dùng, Uỷ ban mỹ phẩm
châu Âu đã đưa ra quy định cập nhật năm dẫn chất paraben vào danh mục các chất
không dùng trong mỹ phẩm: isopropylparaben, isobutylparaben, benzylparaben,
phenylparaben, pentylparaben [13].
Do điều kiện chỉ có 3 chất chuẩn isopropylparaben, isobutylparaben,
benzylparaben, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát
hiện đồng thời 3 paraben bị cấm sử dụng trong các mẫu son, phấn và kem bôi da mỹ
phẩm” nhằm 2 mục tiêu sau:


-2-

1. Xây dựng được quy trình phân tích 3 paraben isopropylparaben,
isobutylparaben, benzylparaben trong son, phấn và kem bôi da mỹ phẩm.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra một số mẫu mỹ phẩm trên thị
trường để sơ bộ đánh giá việc lạm dụng các chất này trong mỹ phẩm.


-3-

1. CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ PARABEN
1.1.1. Đặc điểm chung
Paraben được biết đến là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học được
sử dụng rộng rãi nhất trong các loại mỹ phẩm, ngoài ra một số gốc paraben còn
được dùng trong thực phẩm, thậm chí cả dược phẩm [16], [21], [22], [32].

Paraben thường được sử dụng làm chất bảo quản. Paraben có thể tìm thấy
trong dầu gội, các chất dưỡng ẩm, gel cạo râu, chất bôi trơn cá nhân, kem đánh
răng, phấn trang điểm [36]. Chúng cũng được sử dụng như chất phụ gia thực phẩm.
Paraben được tạo ra từ phản ứng ester hóa acid p-hydroxybenzoic [8]. Cấu
trúc hóa học chung của một paraben là para –hydroxybenzoat trong đó R có thể là
một nhóm alkyl hay aryl.

Bảng 0.1. Tính chất của một số paraben thường gặp
Tên paraben
Công thức phân tử
Khối lượng mol
Thể chất
Nhiệt độ nóng chảy/điểm đông
(oC)
Điểm sôi (oC)
Áp suất hơi (10-4 mmHg)
Độ tan trong nước (mg/L)
Hệ số phân tán octanol/nước
(giá trị log)
Hằng số phân ly (pKa)

Methyl

Alkyl 4-hydroxybenzoat
Ethyl
Propyl
C10H12O3
180,20

Butyl

C8H8O3
152,15
Tinh thể không
màu hoặc dạng
bột màu trắng

C9H10O3
166,17
Tinh thể không
màu hoặc dạng
bột màu trắng

131

116

96-97

68-69

270-280
2,37
2,50 x 103

297-298
9,29
8,85 x 102

5,55

5,00 x 102

1,86
2,07 x 102

1,96

2,47

3,04

3,57

8,4

8,34

7,91

8,47

Tinh thể trắng

C11H14O3
194,23
Tinh thể không
màu hoặc dạng
bột màu trắng

-4-

Các paraben đều ít tan trong nước, tan tốt trong methanol, ethanol và các
dung môi hữu cơ khác [3].
1.1.2. Ứng dụng của paraben
Các paraben có tác dụng diệt khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây hại
khác nhau) và chống lại nhiều loại vi nấm nên thường được sử dụng làm chất bảo
quản.
Cơ chế hoạt động của các paraben hiện vẫn chưa được xác định rõ. Paraben
được cho là phá vỡ quá trình vận chuyển chất qua màng [15] hoặc ức chế tổng hợp
ADN và ARN [25] hay một số enzym quan trọng.
Hiệu quả bảo quản kết hợp với chi phí thấp, lịch sử sử dụng lâu dài của các
paraben, cũng như sự không hiệu quả của một số chất bảo quản tự nhiên như các
chất bảo quản chiết xuất từ hạt bưởi [38] có thể giải thích lý do tại sao paraben lại
phổ biến như vậy. Một hỗn hợp paraben có thể bảo vệ sản phẩm khỏi đa dạng các
loại vi sinh vật. Paraben có phổ kháng khuẩn rộng, còn có thể sử dụng trong khoảng
pH môi trường rộng (từ 3 đến 8), có nghĩa là gần như có thể bao quát tất cả các sản
phẩm chăm sóc da trên thị trường [12], [21], [23], [31]. Paraben cũng có khả năng
chịu nhiệt rất tốt và tính ổn định cao. Trong khi đó, các loại chất bảo quản khác thì
có giới hạn về phạm vi vi sinh vật, môi trường pH, và tính ổn định kém hơn nhiều.
Các loại mỹ phẩm không chứa paraben thường có giá thành đắt và hạn sử dụng
ngắn.
Đến nay vẫn chưa có khẳng định paraben là độc chất có thể phát triển tế bào
ung thư [17]. Các hoạt động kháng khuẩn của paraben tăng cùng với tăng chiều dài
chuỗi alkyl. Do đó, thông thường trong sử dụng, người ta phối hợp hai paraben trở
lên để làm chất bảo quản sát khuẩn trong nhiều loại thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm.
Hoạt tính kháng khuẩn của chúng mạnh nhất với vi khuẩn Gram (+) và kém nhất
đối với Pseudomonas [12], [33].
Ở Châu Âu, nồng độ cho phép của paraben trong mỹ phẩm là 0,4% cho mỗi
chất và 0,8% cho cả nhóm.

-5-

1.1.3. Độc tính của paraben
Phản ứng dị ứng
Ở những người có làn da bình thường, paraben hầu như không gây kích ứng.
Tuy nhiên, paraben có thể gây kích ứng da, viêm da và gây bệnh rosacea ở những
người dị ứng paraben (chiếm một tỷ lệ nhỏ trong dân số) [24].
Ung thư vú
Người ta ước tính phụ nữ tiếp xúc với 50mg paraben mỗi ngày từ mỹ phẩm
[11]. Một nghiên cứu của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa bệnh (CDC) đã tìm
thấy 4 paraben khác nhau trong mẫu nước tiểu của con người mặc dù nồng độ trong
sản phẩm là rất thấp [40], [41]. Tuy nhiên, không có bằng chứng cho thấy các sản
phẩm tiêu dùng chứa paraben gây ung thư.
Điều tra của Hiệp hội Ung thư Mỹ và FDA thấy rằng nồng độ hiện tại của
các paraben trong các sản phẩm tiêu dùng là không nguy hiểm. Cũng trong hai năm
2005 và 2007, đứng trước bối cảnh có những dữ liệu mới về mối liên quan giữa
những hóa chất có hoạt tính estrogen có trong các sản phẩm chăm sóc da với việc
gia tăng tỷ lệ ung thư vú, đặc biệt là nghiên cứu phát hiện ra sự có mặt của paraben
trong tế bào ung thư vú của 20 bệnh nhân được công bố bởi Phillippa D.Darbre
[10]. Hội đồng đánh giá các thành phần dùng trong mỹ phẩm của Mỹ đã tiến hành
xem xét, đánh giá lại tính an toàn của 4 paraben phổ biến nhất nêu trên và kết luận
rằng vẫn chưa có bằng chứng xác đáng chứng minh paraben có thể gây ung thư vú
và khuyến cáo người tiêu dùng không nên quá lo lắng vấn đề này.
Nguyên nhân chính gây ra mối lo ngại về tính an toàn của paraben chính là
hoạt tính giả estrogen của nhóm chất này. Hoạt tính giả estrogen của paraben được
mô tả lần đầu tiên bởi Routledge và đồng nghiệp năm 1998 [34] và sau đó được
chứng minh bởi nhiều thử nghiệm in vitro và in vivo [7], [9], [19], [20], [29], [30],
[34]. Phần lớn nghiên cứu đã công bố đều xác nhận hoạt tính giả estrogen của

paraben, chỉ có 1 trong số 25 nghiên cứu in vitro và 7 trong số 30 nghiên cứu in vivo
là báo cáo kết quả âm tính khi đánh giá tác dụng này của paraben[10]. Tuy vậy, đa
số các nghiên cứu in vivo này đều tiến hành trên chuột mà chưa có dữ liệu nghiên


-6-

cứu trên người- trong đó có nghiên cứu đánh giá hoạt tính giả estrogen của paraben
yếu hơn tác dụng của 17 beta-estradiol 104 lần và trong một nghiên cứu khác về sự
gia tăng của tế bào ung thư vú MCF-7, tác dụng của paraben cũng yếu hơn 17 betaestradiol từ 105-106 lần. Nhiều hợp chất hóa học có hoạt tính giống estrogen thì
đồng thời cũng có hoạt tính kháng androgen. Do đó, gần đây đã có những báo cáo
ghi nhận khả năng paraben liên kết với các receptor androgen ở người và ghi nhận
các paraben kháng androgen thể hiện ở sự đối kháng tác dụng với testosteron trên
một số gen được nghiên cứu. Trên chuột trưởng thành uống propylparaben và
butylparaben liên tiếp đã phát hiện ra sự sinh tinh, thải trừ testosteron và khối lượng
mào tinh hoàn của chuột đều biến đổi [26], [27], [28]. Tuy nhiên, sự thay đổi này
cũng có thể do tác dụng kháng androgen của paraben qua những con đường chuyển
hóa trung gian khác góp phần tạo nên và việc quy kết tác dụng kháng androgen của
paraben có liên quan đến rối loạn chức năng sinh sản nam vẫn chưa có bằng chứng
thuyết phục.
Tăng nhạy cảm với ánh nắng mặt trời
Các nghiên cứu chỉ ra rằng methylparaben sử dụng trên da có thể phản ứng
với UVB (tia tử ngoại có bước sóng 290-320nm) dẫn đến tăng quá trình lão hóa da
và tổn thương ADN [18].
1.1.4. Hành động đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben
Ngày 28-7-2015, Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế đã cho biết: “Thực hiện quyết
định của Hội đồng mỹ phẩm ASEAN về việc cập nhật quy định các chất dùng trong
mỹ phẩm, Cục Quản lý Dược đã có thông báo việc đưa 5 dẫn chất paraben vào danh
mục các chất không dùng trong mỹ phẩm. Năm dẫn chất này gồm:
isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben

Công văn số 6577/QLD-MP của Cục Quản lý Dược [4] quy định cụ thể về
việc sử dụng paraben trong mỹ phẩm như sau:
- Butylparaben và các muối, propylparaben và các muối (tham chiếu 12a
Annex V) được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,14% (tính theo acid) và
dạng hỗn hợp các paraben với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid).


-7-

- 05

paraben

(isopropylparaben,

isobutylparaben,

phenylparaben,

benzylparaben và pentylparaben) được bổ sung vào Annex II (các chất không được
dùng trong mỹ phẩm).
Quyết định ngừng lưu hành các sản phẩm mỹ phẩm chứa 5 loại paraben:
(isopropylparaben,

isobutylparaben,

phenylparaben,

benzylparaben

và

pentylparaben) của Cục Quản lý Dược (Bộ Y tế) là một trong nhiều động thái của
các nước ASEAN trong tiến trình xây dựng cộng đồng chung. Dù rằng chưa thể
khẳng định tác hại của paraben trong mỹ phẩm, đây là một nỗ lực bảo vệ sức khỏe
của người dân trong khu vực.
1.1.5. Một số nghiên cứu về phân tích Paraben trong mỹ phẩm
Tham khảo phương pháp hòa hợp của ASEAN (2005) [6] paraben được xác
định bằng phương pháp HPLC với:
- Pha động: tetrahydrofuran:nước:methanol:aceton nitril tỷ lệ 5:60:10:25
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
- Detecter UV-VIS, bước sóng 280nm.
- Nhiệt độ: 25oC.
Cũng có

tác giả đã đưa ra phương pháp xác định methylparaben và

propylparaben trong mỹ phẩm bằng phương pháp HPLC dựa vào phổ hấp thụ UVVIS thu được nhờ detector PAD với thành phần pha động: nước – acetonitril (50 : 50)
[5].
Paraben cũng có thể được xác định bằng phương pháp HPLC với pha động:
methanol: nước (20:80), detector UV-VIS, bước sóng 254nm [14].
Ngoài phương pháp HPLC, cũng đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp GCMS để xác định các paraben trong các tế bào ung thư vú ở người [35].
1.1.6. Các paraben được nghiên cứu trong đề tài
Uỷ ban mỹ phẩm châu Âu đã đưa ra quy định cập nhật 5 dẫn chất paraben
vào danh mục các chất không dùng trong mỹ phẩm bao gồm isopropylparaben,
isobutylparaben, pentylparaben, benzylparaben và phenylparaben [13]. Tuy nhiên,


-8-

do yêu cầu tại cơ sở chỉ có 3 chất chuẩn, do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác
định 3 paraben bị cấm là isopropylparaben, isobutylparaben và benzylparaben.

Isopropylparaben

Isobutylparaben

Benzylparaben

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.2.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.2.1.1. Sắc ký
Sắc ký là một nhóm các phương pháp dùng để tách các thành phần của một
hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp
xúc và không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động [2].
1.2.1.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC (High performance liquid chromatography) là một kỹ thuật tách trong
đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển
khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến
ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất
ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa các chất
phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với
thời gian hợp lý [1], [2].
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố
quyết định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký
trao đổi ion…)
Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua,
chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký.
Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng quan các tương tác:

- Tương tác giữa các chất phân tích với pha tĩnh


-9-

- Tương tác giữa chất phân tích với pha động
- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động
Mẫu phân tích được hoà tan trong pha động. Pha động có thể là một chất
lỏng (có thể ở trạng thái siêu tới hạn) hoặc chất khí được cho qua pha tĩnh một cách
liên tục và không hoà lẫn vào nó. Pha tĩnh được cố định trong cột. Các chất tan sẽ di
chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào tương tác giữa:
chất tan - pha tĩnh - pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần
của mẫu sẽ tách ra riêng biệt.
1.2.3. Cấu tạo máy HPLC
Do bản chất hoá học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ
thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một
máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau.
1.2.3.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thường được chứa trong bình thuỷ tinh. Có hai cách để dùng pha
động rửa giải:
- Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.
- Chương trình hoá dung môi: Pha động là một hỗn hợp của nhiều dung môi,
thường là 2 - 4 dung môi được đựng trong các loại bình khác nhau. Tỷ lệ các thành
phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định. Có hai kiểu thực
hiện chương trình dung môi:
- Chương trình dung môi áp suất thấp: Các dung môi đựng trong các bình
riêng. Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hoà trộn,
sau đó dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
- Chương trình dung môi áp suất cao: Điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có
một bơm riêng, việc hoà trộn được thực hiện ở áp suất cao. Chương trình này có tốn

kém và cồng kềnh hơn so với loại hoà trộn ở áp suất thấp. Tuy nhiên, nó có độ đúng
và độ lặp lại cao hơn.
1.2.3.2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:


-10-

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (với 1 psi=
0.068 atm).
- Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01-5,0 ml/phút.
- Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).
- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn. Khoảng bơm có
lưu lượng dao động từ 2-3ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi.
1.2.3.3. Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay bằng hệ tiêm mẫu tự động.
Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay trong hệ tiêm mẫu
tự động.
1.2.3.4. Cột sắc ký
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh
hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm. Thường có cột
nhồi và cột bảo vệ.
Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm. Gần đây có loại cột nhỏ với đường kính
trong 1-2 mm, dài 3-7,5 cm.
Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc
liên kết hoá học với một chất hữu cơ). Bên cạnh Silicagel người ta còn dùng các hạt
khác: nhôm oxyd, polyme xốp, chất trao đổi ion.
Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động
và trong mẫu phân tích làm tăng tuổi thọ của cột.
1.2.3.5. Detector và bộ phận ghi tín hiệu

Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu
được ghi trên sắc ký đồ. Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại.
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ
thấp.
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng.
- Khoảng hoạt động tuyến tính mạnh.


-11-

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.
1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
1.2.4.1. Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố
K. Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các
chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì việc tách càng dễ dàng
hơn.
1.2.4.2. Thời gian lưu
Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi
là thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian tM của chất
không lưu gọi là thời gian chết.
1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân
tích A qua cột. Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha.
Khác với hệ số phân bố K, hệ số k’ không chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất A
mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích pha tĩnh và thể tích pha động.
1.2.4.4. Hệ số chọn lọc

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B, người ta thường
dùng hệ số chọn lọc α :
α=

KB k'B
=
KA k'A

Để tách riêng hai chất A, B cần α > 1, thường chọn α dao động trong khoảng
1,05 – 2. Nếu α lớn quá, thời gian phân tích sẽ dài.
1.2.4.5. Tính đối xứng của pic sắc ký
- Hệ số bất đối: AF =

b
a

- Hệ số kéo đuôi: As =

a+b
2a

b: nửa chiều rộng phía sau pic.
a: nửa chiều rộng phía trước pic


-12-

1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý

thuyết.
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc ký nhất định. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic
nhỏ.
1.2.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.2.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh)
Phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu là sắc ký phân bố. Trong sắc
ký phân bố có 2 loại:
- Sắc ký phân bố pha thuận.
- Sắc ký phân bố pha đảo.
Trong sắc ký phân bố pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động không
phân cực. Trong sắc ký phân bố pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân
cực, chất phân tích có thể phân cực hay ít phân cực.
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:
- Phải trơ và bền vững trong môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách hỗn hợp chất tan nhất định.
- Tính chất bề mặt ổn định.
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải đồng nhất.
Vì Silicagel là loại pha tĩnh ưu việt nên thường được dùng trong sắc ký.
Một số loại Silica:
- Silica trung tính: trên bề mặt có các nhóm –OH phân cực (ưa nước). Loại
này sử dụng là pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc
phân cực.


-13-

- Silica đã alkyl hóa: được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm –OH trên
bề mặt Silica bằng gốc alkyl của mạch Carbon (C2, C8, C18) hay các gốc Carbon

vòng.
- Silica sulfon hóa hay nitro hóa: để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi cation.
Silica amin hóa dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion.
1.2.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 24 dung môi theo tỉ lệ nhất định. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách
sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách. Pha động có thể ảnh
hưởng tới:
- Độ chọn lọc của hệ pha động.
- Thời gian lưu giữ của chất tan.
- Hiệu lực tách của cột.
- Độ phân giải của chất tan.
- Độ rộng của pic sắc ký.
Do vậy, việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng. Yêu cầu của pha động:
- Phải trơ đối với pha tĩnh.
- Phải hòa tan được chất mẫu.
- Phải bền vững theo thời gian.
- Phải có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với loại detector.
- Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
1.2.5.3. Chọn đệm pH
Trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo người ta thường phải sử
dụng các hệ đệm thích hợp để ổn định pH trong quá trình sắc ký.
1.2.6. Ứng dụng HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: định tính, định
lượng và điều chế.


-14-

1.2.6.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha
động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt
của chất phân tích trong mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang
phổ thường gặp khó khăn. Do vậy, HPLC thường dùng để tách các thành phần trước
khi phân tích bằng quang phổ.
1.2.6.2. Phân tích định lượng
Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích
pic. Chiều cao pic dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối. Diện tích pic
được dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy.
Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:
- Phương pháp chuấn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử
trong cùng điểu kiện. So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu
chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.
Có 2 phương pháp:
 Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử.
 Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa
diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn
để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các
chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu
và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính
dựa vào sự chênh lệch nồng độ C và sự tăng của diện tích pic S.
- Phương pháp nội chuẩn: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong
mẫu phân tích và trong dung dịch đối chiếu. Tỉ số diện tích của chất phân tích và
chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội:
 Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác

-15-

 Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích
được xác định bằng tỉ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích các pic
có trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ
hơn giới hạn phát hiện).


-16-

2

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Dung môi và hóa chất
- Chất chuẩn Isopropylparaben (Canada) số lôLot#2-PLL-65-3 hàm lượng 98%.
- Chất chuẩn Isobutylparaben(Canada) số lô Lot#3SCC165-1 hàm lượng 98%.
- Chất chuẩn Benzylparaben (Canada) số lô Lot#4-JTN-11-1 hàm lượng 98%.
- Methanol HPLC (Merck)
- Nước tinh khiết

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng Shimadzu với 5 module:
 Bơm: Model LC- 10Atvp
 Detector mảng diod: Mode SPD-M10Avp
 Module điều khiển: Model SCL-10Avp

 Degasser: loại DGU- 14A
 Bộ trộn dung môi: loại FCV- 10Alvp
- Cân phân tích chính xác tới 0,1 mg.
- Máy lắc siêu âm.
- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh.
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích
Tên mẫu
Son Phấn Nụ Hoàng
Cung

Nơi sản xuất
CSSX Phấn Nụ Hoàng
Cung- Bà Phương

2

Kem Gladys 45G631

Đài Loan

3

Phấn bôi da Make up
Blusher

Hàn Quốc

STT
1

Thành phần
Không có chất bảo quản
nhóm paraben
Không có chất bảo quản
nhóm paraben
Không có chất bảo quản
nhóm paraben


-17-

- Một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường dùng để xác định sự có mặt của 3
paraben bị cấm (Phụ lục).
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Xây dựng phương pháp phát hiện 3 paraben cấm: isopropylparaben,
isobutylparaben, benzylparaben có mặt trái phép trong mỹ phẩm với hai quy trình:
- Quy trình xử lý mẫu.
- Quy trình phân tích, phát hiện 3 paraben cấm bằng HPLC.
 Đánh giá phương pháp đã xây dựng:
- Tính đặc hiệu
- Độ chính xác của phương pháp (gồm độ đúng và độ lặp lại).
- Khoảng tuyến tính
- Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện.
 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện 3 paraben cấm:
isopropylparaben, isobutylparaben và benzylparaben trong một số chế phẩm mỹ
phẩm đang lưu hành trên thị trường.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Xây dựng phương pháp phân tích với HPLC:
Sử dụng là 3 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm: son, phấn, kem bôi da để

xây dựng và thẩm định phương pháp. Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc
ký thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê.
- Xây dựng quy trình xử lý mẫu:
Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất
phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên
trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm
nền mẫu, phương pháp phân tích).
- Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp: cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha
động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu. Định
tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ
số tương đương của pic nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu