Nghiên cứu chiết xuất chọn lọc và tinh chế asiaticosid từ cây rau má (centella asiatica (l ) urb)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH PHƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101396

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHỌN LỌC
VÀ TINH CHẾ ASIATICOSID TỪ CÂY RAU
MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH PHƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101396

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHỌN LỌC
VÀ TINH CHẾ ASIATICOSID TỪ
CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Tuấn Anh.
2. PGS. TS. Đỗ Quyên.
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dƣợc Liệu.

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tận
tình của rất nhiều thầy cô, gia đình, bạn bè.
Với lòng cảm ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Ths. Phạm Tuấn Anh
Ts. Đỗ Quyên
đã tận tình hướng dẫn về lý thuyết và thực hành, tạo điều kiện thuận lợi để
tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
- Ths. Nghiêm Đức Trọng – Giảng viên Bộ môn Thực Vật, trường Đại Học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ trong việc giám định tên khoa học của dược liệu.
- Ds. Lê Xuân Kỳ - Giảng viên Bộ môn Vật lý – Hóa lý, trường Đại Học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ trong việc định lượng bằng HPLC.
- Các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược Liệu đã tạo điều kiện
và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các thầy cô trường
Đại Học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt và dạy bảo tôi suốt thời gian
học đại học.
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Lê Đình Phương


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 2

1.1. Tổng quan về cây rau má ........................................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Centella (L.) trong hệ thống phân loại thực vật ...... 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây rau má................................................................ 2
1.1.3. Phân bố và sinh thái ................................................................................ 3
1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến .......................................................... 3
1.1.5. Thành phần hóa học ................................................................................ 4
1.1.6. Tác dụng dược lý..................................................................................... 6
1.1.7. Công dụng ............................................................................................... 8
1.2. Tổng quan về asiaticosid........................................................................ 10
1.2.1. Công thức hóa học, tính chất hóa lý...................................................... 10
1.2.2. Định tính................................................................................................ 11
1.2.3 Định lượng ............................................................................................. 11
1.2.4. Tác dụng dược lý và công dụng ............................................................ 12
1.2.5. Một số nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid từ rau má ...... 13
1.3. Tổng quan về tối ƣu hóa và áp dụng trong chiết xuất tối ƣu ............. 15
1.3.1. Tối ưu hóa ............................................................................................. 15
1.3.2. Áp dụng trong nghiên cứu chiết xuất tối ưu ......................................... 17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 18
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ..................................................................... 18
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất .................................................................. 18
2.1.2. Máy móc, thiết bị .................................................................................. 19
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ................................................. 19


2.2.1. Khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má ....... 19
2.3.2. Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid ................................... 21
2.3.3. Phương pháp đánh giá ........................................................................... 23
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 26
3.1. Khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ƣu asiaticosid từ rau má ... 26
3.1.1. Thiết kế mô hình chiết xuất................................................................... 26

3.1.2. Áp dụng phần mềm INForm trong tối ưu hóa ...................................... 27
3.1.3. Thực nghiệm kiểm chứng ..................................................................... 27
3.2. Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid trong cao rau má .. 28
3.2.1. Phương pháp chiết phân đoạn ............................................................... 28
3.2.2. Phương pháp tinh chế dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn .......................... 29
3.2.3. Định tính các mẫu cao thu được……………………………………....32
3.2.4. Định lượng các mẫu cao thu được………………………………….…33
3.3. Bàn luận .................................................................................................. 35
3.3.1. Về khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má ... 35
3.3.2. Về nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid .............................. 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 38
1. Kết luận ...................................................................................................... 38
2. Đề xuất ........................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- BV: Bed volume.
- HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng
cao).
- NXB: Nhà xuất bản.
- TT: Thuốc thử.
- SKLM: Sắc ký lớp mỏng.
- STT: Số thứ tự.


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các nhóm chất khác trong cây rau má

5

3.1

Mô hình thí nghiệm và kết quả thực nghiệm chiết xuất

26

dược liệu
3.2

Kết quả thực nghiệm chiết xuất rau má ở điều kiện tối

28

ưu
3.3

Kết quả khảo sát dung môi rửa giải nhựa hấp phụ resin

30

D101
3.4

Hàm lượng cắn theo phương pháp chiết phân đoạn

34

3.5

Hàm lượng asiaticosid trong các mẫu cao theo phương

34

pháp chiết phân đoạn
3.6

Hàm lượng cắn theo phương pháp dùng nhựa hấp phụ

35

lỗ xốp lớn
3.7

Hàm lượng asiaticosid trong các mẫu cao khô theo
phương pháp dùng nhựa lỗ xốp lớn

35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của asiaticosid

10

1.2

Lý thuyết hệ thống và hộp đen

16

2.1

Dược liệu rau má

18

2.2

Sơ đồ chiết xuất dược liệu rau má

20

2.3

Sơ đồ làm giàu saponin trong cao rau má bằng

22

phương pháp chiết phân đoạn
3.1

Sơ đồ tinh chế saponin trong cao rau má dùng

31

nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn.
3.2

Sắc ký đồ của các mẫu cao thu được

33


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nước ta có nguồn dược liệu phong phú và nền y học cổ truyền lâu đời.
Cùng với sự phát triển của ngành dược Việt Nam, nghiên cứu sử dụng các
dược liệu sẵn có dựa trên sự kết hợp giữa y học cổ truyền với y học hiện đại

đóng vai trò rất quan trọng.
Cây rau má (Centella asiatica (L.) Urb.) là cây thuốc mọc hoang và được
trồng ở khắp nước ta, được sử dụng với nhiều tác dụng quý như giải nhiệt,
giải độc, thông tiểu, dùng để chữa sốt, rôm sảy, mẩn ngứa, các bệnh về
gan,…Trong y học hiện đại, cao rau má với hoạt chất chính là asiaticosid
được ứng dụng nhiều trong điều trị bỏng, làm lành vết thương, điều trị lao,
phong,…[10] Với sự phát triển của công nghệ bào chế, rau má được sử dụng
làm thuốc dưới nhiều dạng bào chế khác nhau, trong đó dạng cao khô được sử
dụng phổ biến. Tuy nhiên, việc chiết xuất các hoạt chất trong rau má, đặc biệt
là asiaticosid hiện nay chưa đạt hiệu suất cao. Với hàm lượng rất thấp trong
dược liệu, cùng với công nghệ chiết xuất truyền thống, các sản phẩm cao khô
trên thị trường hiện nay có hàm lượng asiaticosid thấp. Vì vậy, chúng tôi thực
hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất chọn lọc và tinh chế asiaticosid từ cây
rau má (Centella asiatica (L.) Urb.)” với các mục tiêu:
- Khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má.
- Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid.


2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây rau má
Cây rau má (còn gọi là tích tuyết thảo, liên tiền thảo) thuộc chi Centella (L.)
họ Hoa tán (Apiaceae).
1.1.1. Vị trí phân loại chi Centella (L.) trong hệ thống phân loại thực vật
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan, chi Centella (L.) thuộc họ Hoa tán
(Apiaceae). Vị trí phân loại của loài Centella asiatica (L.) Urb. trong hệ thống
phân loại thực vật có thể tóm tắt như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Thù du (Cornidae)
Bộ Nhân sâm (Hoa tán) (Apiales)
Họ Hoa tán (Apiaceae)
Chi Centella (L.)
- Tên khoa học cây rau má: Centella asiatica (L.) Urb., còn có tên khoa học
khác như Hydrocotyle asiatica L., Trisanthus cochinchinesis Lour.
- Tên gọi khác: Tích tuyết thảo, liên tiền thảo.
- Tên nước ngoài: Phanok (Lào), Rachiek kranh (Campuchia)[1], [16].
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây rau má
Rau má là loài cỏ mọc bò trên mặt đất, cho thân đứng ngắn, phân nhánh
nhiều, có rễ ở các mấu, thân gầy, nhẵn, chia thành các đốt dài, thân non phủ
lông mềm. Lá mọc thành chụm, phiến lá đơn, hình tròn, gần tròn hoặc hình
thận, rộng 1-7 cm, mép khía tai bèo, gân chân vịt, góc rộng, chóp tròn, gân từ
đáy 5, gân phụ 1-2 cặp, mặt dưới có lông ở gân chính. Cuống lá dài 10-12 cm
hoặc cuống dài bằng phiến lá. Cụm hoa hình tán đơn mọc ở kẽ lá, gồm 2-3
hoa nhỏ không cuống, hoặc hoa ở giữa gần như không cuống, các hoa ở bên


3

cạnh có cuống ngắn. Hoa lưỡng tính, mẫu 5, đài tiêu giảm. Cánh hoa gần tròn
hoặc hình trứng, dài 1-1,5 mm màu xanh nhạt, hồng nhạt hoặc đỏ. Nhị xen
giữa các cánh hoa. Bầu nhụy một ô, vòi nhụy xẻ 2. Quả gần hình cầu với
nhiều rãnh dọc. Hạt dẹp. Lá mầm hình trứng rộng hoặc hình bầu dục [3], [4],
[5], [6], [10].
1.1.3. Phân bố và sinh thái
Chi Centella (L.) có khoảng 40 loài, phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, còn
loài rau má kể trên chỉ thấy ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam châu Á, các
tỉnh nam Trung Quốc, bao gồm cả đảo Hải Nam [10], [16].

Ở Việt Nam, cây rau má mọc tự nhiên khắp nơi. Cây ưa ẩm, hơi chịu bóng,
thường mọc thành đám ở vườn, bãi sông suối, nương rẫy, bờ ruộng cao và ven
rừng [4], [16].
Rau má sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, đến mùa đông (ở miền Bắc)
hay mùa khô (ở miền Nam), cây có hiện tượng bán tàn lụi. Cây ra hoa và quả
nhiều vào cuối mùa hè hoặc đầu mùa thu, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Do
có khả năng đẻ nhánh khỏe, cây rau má thường mọc thành từng đám dày đặc
nên lấn áp các loài cỏ khác [16].
Do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng ở nhiều nước như Madagasca, Srilanka,
Philippin và cả miền Nam Việt Nam, người ta đã tiến hành trồng rau má để
làm thuốc hoặc nước giải khát. Ở Việt Nam, cây rau má chủ yếu mới được
khai thác sử dụng tại chỗ, chưa trở thành mặt hàng thương mại hóa [16].
1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
Bộ phận dùng của rau má là toàn cây. Rau má có thể thu hái quanh năm. Để
làm thuốc, rau má thường dùng tươi hoặc sao vàng [10].
Ngoài ra, rau má cũng được sử dụng như loại rau thường ngày. Rau má
được dùng xay nhỏ hay giã nát, lọc lấy nước, thêm đường làm nước giải khát,
tiêu độc [4].


4

1.1.5. Thành phần hóa học
Rau má chứa những hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau.
Triterpenoid
Đây là thành phần chính và quan trọng nhất của rau má, được dùng làm chất
đối chiếu hay “dấu vân tay” của rau má trong lĩnh vực kiểm nghiệm. Các
triterpenoid có cấu trúc là dẫn chất pentacyclic nhóm ursan và oleanan, gồm 4
chất chính là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic và acid madecassic, ngoài
ra còn có triterpenoid khác như asiaticosid (B, C, D, E, F), brahmosid,

brahminosid,

thankunisid,

isothankunisid,

indocentellosid,

centellosid,

scheffurosid B, scheffurosid A, acid 3-o-[α-1-arabinopyransyl] -2α, 3β, 6β,
23-α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic,

23-o-acetyl

madecassosid,

23-o-

acetylasiaticosid B, acid brahmic, acid isobrahmic, acid madasiatic, acid
centic, acid canellic, acid centoic, acid betulinic, acid betulic, acid indocentic,
acid indocentoic, acid terminolic, acid 6β-hydroxyasiatic, centellasapogenol
A [16], [22] .
Flavonoid
Bên cạnh nhóm chất chính triterpenoid, một số tác giả đã chứng minh trong
rau má có chứa nhiều hợp chất flavonoid.
Zainol và cộng sự (2003) đã phân lập thành công 5 flavonoid từ rau má, đó
là quercetin, kaempferol, catechin, rutin và naringin. Đây là các chất chính
thuộc nhóm polyphenolic, có vai trò quan trọng trong tác dụng chống oxy hóa
và hoạt động ngăn chặn gốc tự do của dịch chiết rau má [47].

Matsuda và cộng sự (2001) đã phân lập được một flavonol có tên là
petuletin và kaempferol 3-O-β-D-glucuronid từ phần trên mặt đất của rau má
trồng ở Việt Nam [30].


5

Một số flavonoid khác tồn tại trong loài này như castilliferol, castillicetin,
quercetin 3-O-β-D-glucuronid, quercetin 3-O-glucosid, keampferol 3-Oglucosid và kaempferol 7-O-glucosid [22].
Tinh dầu
Theo Quin và cộng sự (1998), thành phần tinh dầu của rau má tương tự như
những loài Hydrocotyle sp. của họ Apiaceae. Bằng phương pháp GC-MS, đã
xác định được 45 thành phần từ tinh dầu rau má, trong đó caryophyllen,
farnesol và emelen là các thành phần chính [37].
Nghiên cứu của Nor Azah Mohd Ali và cộng sự tại Malaysia (2002) và
nghiên cứu của Oyedeji và cộng sự tại Nam Phi (2005) cho thấy βcaryophyllen là thành phần chính trong tinh dầu của rau má [33], [35]. Như
vậy, qua các nghiên cứu về tinh dầu được thực hiện bởi nhiều tác giả khác
nhau, mẫu thu hái ở các thời gian và địa điểm khác nhau thì kết quả đều cho
thấy β-caryophyllen là thành phần chính có mặt trong các bộ phận của rau má.
Nhóm chất khác
Bên cạnh 3 nhóm chất triterpenoid, flavonoid và tinh dầu, thành phần hóa
học của cây rau má rất phong phú. Bảng 1.1 trình bày các nhóm chất khác
trong cây rau má [16], [22].
Bảng 1.1. Các nhóm chất khác trong cây rau má
Nhóm chất

STT

Tên hợp chất

1

Alcaloid

Hydrocotylin

2

Tanin

Phlobatanin

3

Sterol

Stigmasterol, sitosterol, campesterol,
sitosterol 3-o-β-glucosid, stigmasterol
3-o-β-glucosid

4

Phenolic

Acid rosmarinic, acid chlorogenic, acid
isochlorogenic, acid 3,4-di-o-caffeoyl


6

quinic, acid 1,5-di-o-caffeoyl quinic,
acid 3,5-di-o-caffeoyl quinic
5
6

Monosaccharid Glucose, mesoinositol
Carbohydrat

7

Oligosaccharid Centellose
Polysaccharid

Pectin, arabinogalactan

8

Vitamin

Vitamin C, vitamin B2, β-caroten

9

Chất khoáng

Ca, P, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na, Cu

10

Acid amin

Alanin, ariginin, acid aspartic, acid
glutamic, leucin, isoleucine, valin,
methionine, lysine, histidin, tyrosin,
phenylalanine, threonine, glycin, serin,
prolin, cystin

11

Polyacetylen

8-acetoxycentellynol, acid dotriacont8-en-1-oic,

11-oxoheneicosanyl

cyclohexan, cadiyenol
1.1.6. Tác dụng dƣợc lý
Tác dụng làm lành vết loét dạ dày
Dịch chiết rau má có tác dụng ngăn chặn ổ loét dạ dày ở chuột thí nghiệm bị
stress do bị gò bó và hạ nhiệt, hoặc gây loét bằng tác nhân acid acetic [21].
Ngoài ra, rau má còn có tác dụng tốt trong việc ngăn chặn tác hại của ethanol
lên niêm mạc dạ dày thông qua tăng cường hàng rào niêm mạc và giảm tác
động của gốc tự do [20].
Tác dụng lên da và làm lành vết thƣơng
Dịch chiết toàn phần và phân đoạn triterpenoid từ rau má tác động lên giai
đoạn khác nhau của quá trình khôi phục tổn thương da. Dịch chiết rau má có
tác dụng tăng sinh tế bào, tăng quá trình tổng hợp, trưởng thành, liên kết chéo


7

của collagen và tăng biểu mô hóa tế bào, tạo mạch ở vị trí tổn thương; qua đó
có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình làm lành vết thương [40].
Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung bƣớu và gây độc tế bào
Một số nghiên cứu thử nghiệm trên chuột cho thấy rau má và các thành
phần hoạt tính của nó có tác dụng điều hòa miễn dịch rất tốt [42].
Uống chế phẩm Brahma Rasayana có chứa rau má làm tăng đáng kể số
lượng tế bào máu, tế bào tủy xương, tế bào NK trên chuột bị tiếp xúc với bức
xạ gamma. Bên cạnh đó, thuốc còn làm giảm tác động của tia bức xạ gây ra
sự peroxide hóa ở gan, mà cơ chế có thể là giúp tăng sinh tế bào gốc và ngăn
chặn gốc tự do gây tổn thương [42].
Tác dụng lên thần kinh trung ƣơng
Dịch chiết nước từ rau má có tác động tốt lên khả năng học tập, giúp tăng
cường trí nhớ và khả năng nhận thức trên chuột và trẻ em [32].
Rau má có tác dụng bảo vệ và phục hồi tế bào thần kinh thông qua thúc đẩy
tái tạo tế bào thần kinh thông qua thúc đẩy tái tạo tế bào thần kinh, làm dài sợi
trục trên in vitro. Hoạt chất acid asiatic cũng được chứng minh hiệu quả điều
trị tổn thương neuron do ngăn chặn sự oxy hóa tế bào thần kinh [28].
Tác dụng trên tim mạch
Rau má có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim khỏi tác động của chất gây tổn
thương cơ tim (adryanmycin) [23] và cải thiện tình trạng tổn thương tái tưới
máu và thiếu máu cục bộ cơ tim (nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim) ở chuột
thí nghiệm [36].
Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng và mù đôi trên các bệnh
nhân mắc chứng tăng huyết áp tĩnh mạch cho thấy rau má và các saponin từ
rau má giúp cải thiện tình trạng phù mắt cá chân, cải thiện vi tuần hoàn, tăng
hiệu quả lọc ở mao mạch và tác dụng phụ thuộc vào liều sử dụng [18], [19].


8

Tác dụng bảo vệ gan
Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng bảo vệ gan của rau má. Thực tế lâm
sàng đã sử dụng cao rau má chuẩn hóa giúp cải thiện rối loạn chức năng gan
mạn tính ở người [48].
Tác dụng chống viêm và chống oxy hóa
Rau má và các hoạt chất saponin của nó thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt
trên thực nghiệm. Cơ chế kháng viêm được cho là do giảm sự sản sinh NO và
ngăn chặn tác động của tin xạ có hại lên cơ thể, nhờ đó giúp tổn thương dễ
dàng hồi phục [29].
Tác dụng chống oxy hóa của rau má được nghiên cứu trên các mô hình khác
nhau. Dịch chiết methanol rau má còn thể hiện tác dụng chống oxy hóa trên
chuột có khối u lympho [25]. Dịch chiết còn cho thấy hoạt tính bảo vệ tế bào
thần kinh chuột khỏi các tổn thương do oxy hóa gây nên, giúp chống lão hóa
hiệu quả.
Các tác dụng khác
Rau má còn có nhiều tác dụng dược lý khác đã được chứng minh trong các
thủ nghiệm in vivo và in vitro như tác dụng tăng đồng hóa, chống lao và
phong, chống vẩy nến, chống giun sán và đơn bào, chống virus, chống co thắt,
chống sinh sản quá nhanh ở chuột [13], [16].
1.1.7. Công dụng
Theo y học cổ truyền
Cây rau má là vị thuốc mát, vị ngọt, hơi đắng, tính bình, không độc, có tính
chất giải nhiệt, giải độc, thông tiểu, dùng chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch
đới, lợi sữa [10].
Rau má dùng trị cảm mạo phong nhiệt, thủy đậu, sởi, sốt da mặt vàng, viêm
họng, viêm khí quản, ho, viêm đường tiết niệu, đái dắt, đái buốt, còn dùng trị


9

thổ huyết, chảy máu cảm, tả lỵ, giải độc lá ngón và nhân ngôn. Dùng ngoài trị
rắn cắn, mụn nhọt, lở ngứa và vết thương chảy máu [4].
Rau má ngày dùng 30 đến 40 (g) tươi, vò nát vắt lấy nước uống hoặc sắc
uống. Thuốc rau má không độc, phụ nữ có thai vẫn dùng được [10].
Một số bài thuốc có rau má:
+ Chữa bệnh da thể phong nhiệt: Chàm khô, tổ đỉa khô, á sừng, viêm da thần
kinh, viêm nang lông và vảy nến thể khô:
Rau má 16g; chi tử, huyền sâm, đậu đen, thiên môn, ngưu tất, thạch cao,
mỗi vị 20g; hoài sơn, lá dâu, mỗi vị 16g; hoàng liên 8g: thiền thoái 6g. Sắc
uống ngày một thang.
Thuốc xông, ngâm, bôi, chườm: Rau má 16g; khổ sâm nam, quyết minh tử,
hoàng đằng, mỗi vị 20g; hà thủ ô, cỏ mực, mỗi vị 16g; kinh giới, phèn chua,
mỗi vị 12g [16].
+ Chữa viêm loét dạ dày tá tràng:
Rau má 12g; đảng sâm 16g; hoài sơn, ý dĩ, hà thủ ô, huyết dụ, kê huyết
đằng, cam thảo dây, đỗ đen sao mỗi vị 12g. Sắc uống ngày một thang [16].
Theo y học hiện đại
Trong y học hiện đại, rau má ít được dùng trực tiếp, mà thường ở dạng cao
đã tiêu chuẩn hóa bằng đường uống, tiêm bắp hoặc dưới da [16].
Cao rau má điều trị bỏng độ hai và độ ba có tác dụng dự phòng sự co rúm
và sưng do nhiễm khuẩn và ức chế tạo sẹo lồi. Kem chứa 1% cao rau má điều
trị nhiễm khuẩn mạn tính. Viên nang chứa cao rau má hoặc asiaticosid và kali
clorid có hiệu quả như dapson trong điều trị bệnh nhân phong. Cao rau má
tiêu chuẩn hóa được dùng trong điều trị bệnh loét dạ dày tá tràng có tác dụng
tốt cải thiện các hiệu ứng chủ quan và làm lành các vết loét ở 73% bệnh nhân
qua xét nghiệm bằng nội soi và chụp tia Rơngen [16].
Ở một số nước, người ta chế rau má dưới dạng:

10

+ Viên nén chứa 0.01 g cao rau má để chữa các chứng giãn tĩnh mạch, chứng
nặng chân do máu ở các tĩnh mạch chân chậm trở về tim. Ngày uống 3 – 6
viên vào bữa ăn [10].
+ Thuốc tiêm 1 ml chứa 0,02 g cao rau má. Cách 1 ngày tiêm bắp 1 ống phối
hợp bôi thuốc mỡ (1% cao rau má) hoặc thuốc bột chứa 2% cao rau má để
chữa các vết bỏng, vết thương do chấn thương hoặc vết phẫu thuật, các tổn
thương ở da và niêm mạc (tai, mắt, mũi, họng) hoặc sản phụ [10].
1.2. Tổng quan về asiaticosid
Asiaticosid là một saponin thuộc nhóm saponin triterpenoid ursan được tìm
thấy lần đầu tiên từ loài Centella asiatica (L.) Urb. tại đảo Madagasca bởi
Boiteau [10], [31].
1.2.1. Công thức hóa học, tính chất hóa lý
Tên đồng nghĩa: Madecassol, emdecassol.
Tên khoa học của asiaticosid: [6–[[3,4–dihydroxy–6–(hydroxymethyl)–5–
(3,4,5–trihydroxy–6–methyloxan–2–yl) oxyoxan–2–yl] oxymethyl] – 3,4,5 –
trihydroxyoxan–2–yl] 10,11–dihydroxy–9–(hydroxymethyl)–1,2,6a,6b,9,12a–
hexamethyl–2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b–tetradecahydro–1H–picene–
4a–carboxylate.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của asiaticosid.
Công thức phân tử: C48H78O19. Khối lượng phân tử: 959, 12152 g/mol [34].


11

Khi thủy phân tạo ra phần aglycon là acid asiatic và phần đường gồm 1
phân tử rhamnose và 2 phân tử glucose.
Asiaticosid là chất kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, dễ tan trong

nước, alcol, pyridin, glycol, glycerin, có độ chảy 230 – 233°C [10] [34].
1.2.2. Định tính
- Phản ứng tạo bọt:
Asiaticosid có một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước, vì vậy có tính chất đặc
trưng là tạo bọt. Khi dùng dung dịch cồn chiết có asiaticosid thực hiện phản
ứng tạo bọt với ống nghiệm chứa HCl 0,1N và ống nghiệm chứa NaOH 0,1N,
cột bọt trong 2 ống nghiệm tạo ra bền và cao bằng nhau [13].
- Phản ứng định tính:
Asiaticosid có các phản ứng màu của saponin triterpenoid:
+ Phản ứng Rosenthaler: Asiaticosid cho tác dụng với vanillin 1% trong HCl
và hơ nóng sẽ có màu hoa cà.
+ Asiaticosid phản ứng với antimoin triclorid trong dung dịch chloroform rồi
soi dưới đèn phân tích tử ngoại thì có huỳnh quang xanh.
+ Phản ứng Liebermann – Burchardt: Lấy vài milligram asiaticosid hòa nóng
vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, sản phẩm thu được
có màu từ hồng đến tía [13].
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng:
+ Bản mỏng: Bản mỏng silicagel G.
+ Hệ dung môi khai triển:
Chloroform : Methanol : Nước = 7 : 3 : 0,5.
+ Thuốc thử hiện màu: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT).
Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 105°C, đến khi hiện rõ vết [2].
1.2.3 Định lƣợng
- Phương pháp cân:


12

Nguyên tắc: Chiết asiaticosid rồi cân. Tính hiệu suất asiaticosid thu được
dựa vào khối lượng asiaticosid thu được và khối lượng dược liệu [13].

- Phương pháp đo quang:
Nguyên tắc: Các saponin triterpenoid có thể dùng thuốc thử tạo màu là
vanillin – sulfuric [13].
- Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Pha tĩnh thường sử dụng là pha đảo PR – 18. Pha tĩnh theo cơ chế rây phân
tử cũng có thể được dùng.
Pha động là hệ acetonitril : nước với các tỷ lệ khác nhau. Chương trình chạy
là gradient nồng độ.
Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ số khúc xạ (RI), hay tán xạ
bay hơi (ELSD), detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ
(MS hay MS/MS với kỹ thuật ion hóa ESI hay APCI). Asiaticosid không có
nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 – 195 nm, do
vậy rất khó khăn trong việc phát hiện. Tuy nhiên, nếu định lượng ở bước sóng
thấp quá (200 – 195 nm) thì dung môi rửa giải cũng bị hấp thụ tử ngoại, gây
khó khăn cho quá trình định lượng. Vì vậy, asiaticosid thường được định
lượng ở bước sóng 206 nm [12].
1.2.4. Tác dụng dƣợc lý và công dụng
Asiaticosid có tác dụng làm tăng sinh tổng hợp collagen và fibronectin, vì
vậy có tác dụng làm nhanh liền sẹo [44]. Các saponin trong rau má, trong đó
có asiaticosid có tác dụng tới mô liên kết, giúp các mô tái tạo nhanh chóng, do
đó làm vết thương mau lành và lên da non [10].
Asiaticosid có tác dụng làm nhanh liền vết thương (đặc biệt là vết thương
chậm liền) do chấn thương hoặc phẫu thuật, vết lở do bệnh phong, vảy nến,
các tổn thương da và niêm mạc ở người bệnh khi dùng thuốc mỡ 1% hoặc
thuốc bột 2% [10], [44]. Hiện nay, asiaticosid dùng chủ yếu để làm thuốc


13

chóng lành sẹo, các vết thương, vết mổ, chữa loét, bỏng, eczema dưới dạng

thuốc bột, thuốc mỡ hoặc thuốc tiêm dưới da [13].
Asiaticosid có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh nhân bỏng độ hai hoặc độ
ba.Thuốc dùng ngoài asiaticosid được dùng trong điều trị bỏng khẩn cấp [44].
Năm 1956, Boiteau và Ratsimamanga dùng asiaticosid điều trị hủi và lao da
[13]. Asiaticosid làm tan bao bằng chất giống sáp của trực khuẩn phong, trực
khuẩn trở nên mong manh và dễ bị phá hủy [16].
Inhee M. J. và cộng sự (1999) đã công bố công trình nghiên cứu về tác dụng
bảo vệ thần kinh, chống lại các độc tố beta – amyloid của các dẫn xuất của
asiaticosid. Asiaticosid kích thích hệ reticuloendothelial nên sức đề kháng của
cơ thể mạnh hơn [24].
Trong nghiên cứu của Wijeweera P. và cộng sự (2006) đã chứng minh tác
dụng giải lo âu của dịch chiết rau má và asiaticosid trên mô hình thí nghiệm
trên chuột [43]. Nghiên cứu của Si W. C. và cộng sự (2006) cũng đã chứng
minh được tác dụng tương tự của asiaticosid [39].
Công trình nghiên cứu của Xin L. và cộng sự (2008) cho thấy asiaticosid có
tác dụng chống trầm cảm trên chuột thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy
asiaticosid có tác dụng chống trầm cảm, trong nghiên cứu so sánh với
clomipramine [45].
Ngoài ra, asiaticosid có tác dụng chống ung thư vì nó gây chết tế bào theo
chương trình và làm tăng hoạt động kháng khối u của vincristine với tế bào
ung thư [46].
1.2.5. Một số nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid từ rau má
Những nghiên cứu về phương pháp chiết xuất và tinh chế asiaticosid đã
được nghiên cứu và công bố rộng rãi bởi các nhà khoa học nước ngoài. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu chiết xuất asiaticosid từ rau má tại Việt Nam vẫn chưa
được quan tâm và chú trọng.


14

Những nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid còn chưa thống nhất
về nhiều điều kiện, đặc biệt là dung môi chiết xuất. Các dung môi thường
được sử dụng trong chiết xuất dược liệu rau má là các dung môi phân cực như
nước, ethanol, methanol.
Năm 2008, Jia G. và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu chiết xuất và
làm giàu asiaticosid bằng macroporous gồm HPD100, HPD300, X – 5, AB –
8 và D101. Kết quả thu được cho thấy nhựa HPD100 có khả năng hấp phụ và
tốc độ rửa giải asiaticosid và medecassosid cao hơn so với các loại nhựa khác.
Sau khi rửa giải bằng nhựa HPD100, hàm lượng madecassosid tăng 3,9 –
39,7%, hiệu suất thu hồi 70,4%; hàm lượng asiaticosid tăng 2,0 – 21,5%, hiệu
suất thu hồi 72,0% [26].
Trong nghiên cứu của Kim J. W. và cộng sự (2009) đã thực hiện chiết xuất
asiaticosid và acid asiatic từ dược liệu rau má bằng nước dưới tới hạn. Với
điều kiện tối ưu là 40 MPa và 250°C, hiệu suất của acid asiatic là 7,8 mg/g
dược liệu và của asiaticosid là 10 mg/g dược liệu. Hiệu suất thu được khi
chiết xuất với nước dưới tới hạn cao hơn so với khi chiết xuất thông thường
với dung môi ethanol và methanol [27].
Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế
asiaticosid còn hạn chế. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Vân Anh
(2010) đã công bố, điều kiện tách chiết asiaticosid tốt nhất trên hệ thống
Soxhlet, với hệ dung môi ethanol : nước trong quy mô phòng thí nghiệm là:
- Nhiệt độ: 81°C.
- Tỷ lệ dung môi: Ethanol : nước = 85 : 15.
- Thời gian: 4h.
- pH của nước: 6.
Định lượng asiaticosid bằng phương pháp HPLC với pha động là methanol :
nước (1% triflouroacetic acid) = 60 : 40, bước sóng phát hiện 220 nm, tốc độ


15

dòng 1,5 ml/phút. Hàm lượng asiaticosid thu được theo nghiên cứu là 9,803
mg/g [1].
Những nghiên cứu về chiết xuất rau má tại Việt Nam vẫn đang còn hạn chế,
chỉ có một số nghiên cứu về tác dụng dược lý, thành phần hóa học của rau má
và asiaticosid, mặc dù rau má là dược liệu dễ kiếm, dễ trồng và có thể mang
lại hiệu quả kinh tế cao tại Việt Nam.
1.3. Tổng quan về tối ƣu hóa và áp dụng trong chiết xuất tối ƣu
1.3.1. Tối ƣu hóa
- Định nghĩa tối ƣu hóa
Tối ưu hóa một công thức hay quy trình là việc tìm công thức, thông số (hay
điều kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt nhất
trong giới hạn mong muốn của người làm thí nghiệm [9].
- Các khái niệm
+ Biến đầu vào còn gọi là biến độc lập hay yếu tố: Là những biến mà người
làm thí nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thí nghiệm và sự
thay đổi này sẽ kéo theo sự thay đổi giá trị của biến đầu ra.
+ Biến đầu ra còn gọi là biến phụ thuộc hay đáp ứng: Là kết quả của thí
nghiệm mà người làm thí nghiệm thấy cần phải đo đạc và đánh giá [9].
- Phƣơng pháp tối ƣu hóa
Theo lý thuyết hệ thống, một hệ thống có thể xem như một quá trình chuyển
đổi từ đầu vào (input) thành đầu ra (output).
Việc xem xét hệ thống từ phương diện bằng thực nghiệm được coi như là
việc tiếp cận một hộp đen. Hộp đen là một hệ thống với cấu trúc bên trong
chưa biết nhưng biết được giá trị của đầu vào và đầu ra. Trên thực tế, chất
lượng của đầu ra không những bị ảnh hưởng bởi đầu vào mà còn có nhiều yếu
tố khác có thể không được biết. Do đó, có thể sử dụng các yếu tố được biết,


16

điều khiển được và có ảnh hưởng đến quá trình tối ưu hóa. Như vậy, để tối ưu
hóa cần phải thể hiện được mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào.
Yếu tố
Quá trình
(Hộp đen ?)

Đầu vào

Đầu ra

Hệ thống
Hình 1.2. Lý thuyết hệ thống và hộp đen.
Có 2 cách để mô tả mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào:
+ Cách 1: Dùng mô hình (phương trình) toán học. Đây là cách mô tả đơn giản
và dễ hiểu nhất. Phương trình thường có dạng đa thức có bậc ≤ 2 và được gọi
là phương trình hồi quy.
+ Cách 2: Dùng mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network – ANN).
Dù sử dụng phương pháp nào đi nữa, để mô tả chính xác mối quan hệ trên,
cần phải tiến hành trước một số thí nghiệm và các thí nghiệm này phải được
thiết kế một cách khoa học.
Sự vận hành của mạng neuron nhân tạo (ANN) dựa trên sự mô phỏng quá
trình thần kinh sinh học diễn ra trong bộ não con người. Sự vận hành này có
thể xác định mối tương quan giữa những cặp biến đầu vào – biến đầu ra [9].
ANN rất hữu ích đối với những mô hình hệ thống mà ở đó mối quan hệ giữa
các biến đầu vào và biến đầu ra phức tạp (phương trình hồi quy dạng đa thức
bậc 2 không thể mô tả đầy đủ mối quan hệ này) [41].
Công việc tính toán khi tiến hành thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá khá phức
tạp và tốn nhiều thời gian. Tuy nhiên, hiện nay đã có rất nhiều chương trình

17

máy tính hỗ trợ người làm thí nghiệm trong công việc này. Một số chương
trình thông dụng:
- Dựa trên phương trình hồi quy đa thức bậc ≤ 2: MODDE, DESIGN
EXPERT, STATGRAPHICS.
- Dựa trên mạng neuron nhân tạo: INFORM, ANNA & OPTIM, TRAJAN
[9].
1.3.2. Áp dụng trong nghiên cứu chiết xuất tối ƣu
Việc chiết xuất và phân lập các hoạt chất từ dược liệu thường bị ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố: Dung môi, thiết bị, điều kiện chiết xuất (tỷ lệ dược liệu/dung
môi, nhiệt độ, áp suất, thời gian, pH,…) [7], [11]. Vì vậy, cần thực hiện tối ưu
hóa để hiệu suất của quá trình chiết xuất lớn nhất.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Lập và cộng sự (2014), đã tối ưu hóa quy
trình chiết xuất phospholipid từ đậu nành với các điều kiện thực nghiệm:
- Giai đoạn 1: t = 40°C, p = 360 bar, thời gian 120 phút.
- Giai đoạn 2: t = 56°C, p = 398 bar, thời gian 120 phút.
Hiệu suất trung bình đạt 0,72% so với nguyên liệu ban đầu [8].
Theo nghiên cứu của Hồ Bá Vương và cộng sự (2015), đã tối ưu hóa quy
trình chiết xuất polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với các
điều kiện thực nghiệm:
- Nhiệt độ: 90°C.
- Thời gian chiết: 76,5 phút.
- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 70/1 (ml/g).
- Nồng độ dung môi chiết: Ethanol 44,3%.
Hiệu suất của quá trình chiết đạt 233,76 mg GAE/g chất khô [17].