Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của hai loài thuộc chi gynostemma thu hái tại yên bái và bắc kạn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HỒNG
MSV 1101217

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA HAI LOÀI THUỘC CHI
GYNOSTEMMA THU HÁI TẠI YÊN BÁI
VÀ BẮC KẠN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HỒNG
MSV 1101217

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA HAI LOÀI THUỘC CHI
GYNOSTEMMA THU HÁI TẠI YÊN BÁI
VÀ BẮC KẠN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Thân Thị Kiều My
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược Liệu

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp
đỡ dù nhiều hay ít, dù trực tiếp hay gián tiếp. Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc
nhất, tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn Ths. Thân Thị Kiều My, người thầy đã tận
tình chỉ bảo, động viên và hướng dẫn cho tôi những kiến thức và phương pháp nghiên
cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Dược sĩ Phạm Đức Vịnh đã giúp đỡ, chỉ bảo và hướng
dẫn tôi trong quá trình tôi thực hiện một phần khóa luận tại bộ môn Dược lý.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên trong bộ
môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất nhiều trong
thời gian tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, các phòng ban và
các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên
cứu trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, anh chị, bạn bè
trong suốt thời gian qua đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc của
tôi.
Do thời gian và điều kiện có hạn, khóa luận không thể tránh những thiếu sót, rất
mong được sự góp ý của thầy cô và các bạn.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
VŨ THỊ HỒNG


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1. 1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume ........................................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume .............................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................................. 2
1.1.3. Đặc điểm thực vật của hai loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino và
Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. ................................................................ 3
1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................................ 4
1.1.5. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 9
1.1.6. Độc tính ............................................................................................................ 13
1.1.7. Chiết xuất, tinh chế ........................................................................................... 13
1.2. Quá trình oxy hóa trong cơ thể, các phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính
chống oxy hóa. ........................................................................................................... 14
1.2.1. Gốc tự do và quá trình oxy hóa ......................................................................... 14
1.2.2. Cơ chế chống oxy hóa ....................................................................................... 15
1.2.3. Các chất chống oxy hóa .................................................................................... 16
1.2.4. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa..................................... 19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị ................................................................. 23
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 23
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 23
2.1.3. Hóa chất ........................................................................................................... 24


2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 24
2.3.1. Định tính các nhóm chất ................................................................................... 24
2.3.2 Chiết cao các phân đoạn .................................................................................... 25
2.3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in-vitro .................................... 25
2.4. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 27

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 28
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân Giảo cổ lam nghiên cứu .......... 28
3.1.1. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ......................................................... 28
3.1.2. Kết quả định định tính bằng sắc kí lớp mỏng các phân đoạn ............................. 32
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ................................................ 41
BÀN LUẬN ............................................................................................................... 44
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CUPRAC

Cupric ion reducing antioxidant capacity

DMPD

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine dihydrochloride

DPPH

1,1- diphenyl-2-picryhydrazyl

EC50

Nồng độ ức chế 50 % DPPH

EtOAc

Ethylacetat

EtOH

Ethanol

FRAP

Ferric reducing-antioxidant parameter

G.

Gynostemma

Glu

Glucose

Rham

Rhamnose

RP

Reducing power method

Xyl

Xylose

HORAC

Hydroxyl radical absorbance capacity

LPO

Lipid peroxidation assay

MDA

Maloydialdehyd

n-BuOH

n-Butanol

NXB

Nhà xuất bản

PL

Phụ lục

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

STT

Số thứ tự

UV

Ánh sáng tử ngoại

UV254

Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm

UV365

Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm

TRAP

Total radical-trapping antioxidant parameter

ORAC

Oxygen radical absorbance capacity


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1. Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của saponin trong

7

G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
2

Bảng 1.2. Các chất chống oxy hóa tự nhiên

16

3

Bảng 1.3. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

19

4

Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng

27

5

Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân Giảo cổ

28

lam thu hái tại Yên Bái và Bắc Kạn
6

Bảng 3.2. Các thông số chạy nhựa D101 của 2 loài giảo cổ lam

35

7

Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc dọn gốc tự do DPPH của loài

41

G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
8

Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của
G. burmanicum ex King ex Chakrav

42


DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ
Tên hình

Trang

Hình 1.1. Công thức trong mặt phẳng của khung dammaran

5

Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum

6

Hình 1.3. Các cấu trúc của R7

6

Hình 1.4. Cấu trúc epoxy dammaran từ G. pentaphyllum (Thunb.) Makino

8

Hình 1.5. Các cơ chế chống oxy hóa trong cơ thể

15

Hình 2.1. G. pentaphyllum tại Yên Bái

23

Hình 2.2. G. burmanicum tại Băc Kạn

23

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn trong lá, thân của cây Giảo cổ lam

33

thu hái tại Yên Bái và Bắc Kạn
Hình 3.2. Quy trình tách Saponin bằng nhựa hấp phụ D101

36

Hình 4.1. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài giảo cổ lam khi quan sát

37

dưới ánh sáng thường
Hình 4.2. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài Giảo cổ lam khi quan sát

38

dưới UV254
Hình 4.3. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài Giảo cổ lam khi quan sát

38

dưới UV366
Hình 4.4. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài Giảo cổ lam sau khi phun

39

thuốc thử vanillin/H2SO4 10 %
Hình 5.1. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cao toàn phần của
G. pentaphyllum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)

PL 2


Hình 5.2. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cao toàn phần của

PL 2

G. burmanicum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 5.3. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cao tách qua nhựa

PL 2

D101 của G. pentaphyllum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH –
H2O (4 : 1 : 0,1)
Hình 5.4. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cao tách qua nhựa

PL 2

D101 của G. burmanicum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH –
H2O (4 : 1 : 0,1)
Hình 5.5. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cắn Ethylacetat của

PL 2

G. pentaphyllum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 5.6. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cắn Ethylacetat của

PL 2

G. burmanicum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 5.7. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cắn butanol của

PL 2

G. pentaphyllum khải triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 5.8. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cắn butanol của

PL 2

G. burmanicum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 6.1: Đồ thị kết quả dọn gốc tự do DPPH các phân đoạn của

42

G. pentaphyllum
Hình 6.2: Đồ thị kết quả dọn gốc tự do DPPH các phân đoạn của
G. burmanicum

43


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở Việt Nam cũng như thế giới, do sự thay đổi về môi trường tự nhiên và kinh tế- xã
hội, mô hình bệnh tật có xu hướng ngày càng tăng tỉ lệ với các bệnh mãn tính như béo
phì, đái tháo đường, tim mạch, ung thư và các bệnh do tuổi già như Parkinson,
Alzeimer,… Một trong những nguyên nhân của các bệnh này là quá trình oxy hóa do các
gốc tự do gây ra trong cơ thể. Các gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có mức
độ hoạt động mạnh. Trong cơ thể, chúng có thể oxy hóa các thành phần tạo tế bào như
protein, DNA, lipid,.. do đó có thể phá hủy các tế bào sống. Việc nghiên cứu các thành
phần hóa học có tác dụng chống oxy hóa của cây cỏ thiên nhiên, trước hết là cây cỏ làm
thuốc có thể sẽ giúp tìm ra chất dẫn đường cho tìm kiếm các thuốc điều trị mới.
Giảo cổ lam còn có tên gọi là Cổ yếm, Thất diệp đởm, Ngũ diệp sâm đã được nhiều
nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu chứng minh có tác dụng hạ cholesterol, hạ đường
huyết, chống oxy hóa, giải tỏa stress... Tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên
loài Gynostemma pentaphyllum, có rất ít các nghiên cứu trên các loài khác thuộc chi
Gynostemma Blume. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng và góp phần định hướng phát
triển cũng như định hướng sử dụng các loài giảo cổ lam tại Việt Nam, đề tài : “ Đánh
giá tác dụng chống oxy hóa của 2 loài thuộc chi Gynostemma thu hái tại Yên Bái và
Bắc Kạn ’’ được thực hiện với các mục tiêu sau:
1

Xác định các nhóm chất hữu cơ chính trong hai loài giảo cổ lam Gynostemma
pentaphyllum (Thunb.) Makino và Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.

2

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro dịch chiết các phân đoạn của hai loài Giảo
cổ lam nghiên cứu.


2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1. 1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume
1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume
Theo các tài liệu [3], [13], [49], Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, một chi nằm
trong họ bầu bí (Cucurbitaceae), và có vị trí phân loại được tóm tắt như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Sổ (Dilleniidale)
Liên bộ Hoa tím (Violanae)
Bộ Bí (Cucurbitales)
Họ Bầu bí ( Cucurbitaceae)
Chi Gynostemma
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam [3] và Thực vật chí Trung Quốc [49], các loài
thuộc chi Gynostemma có những đặc điểm chung sau:
Cây thảo lâu năm, khác gốc, ít khi cùng gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc lông mịn.
Lá kép, ít khi là lá đơn, lá có cuống, phiến lá chân vịt có 3-9 lá chét. Tua cuốn chẻ đôi,
đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa
đực. Hoa đực: nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa
hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn
liền thành cột. Bao phấn một ô, nhưng nhìn có vẻ như hai ô. Hoa cái: đài và tràng giống
hoa đực. Nhụy 1 hoặc 2, bầu hình cầu nhỏ, 2-5 ngăn, thường 3 ngăn, ít khi 2,4,5, đầu
nhụy chia 2-3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở. Quả có 2-3 hạt hình
trứng, hơi dẹt hai bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi [3], [49].
Các loài thuộc chi Gynostemma chủ yếu được phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Á
và Đông Nam Á: từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và đảo New Guinea.


3

Hiện nay trên thế giới có khoảng 21 loài thuộc chi Gynostemma. Ở Trung Quốc
đã ghi nhận được 14 loài ( với 9 loài đặc hữu) [49].
Tại Việt Nam đã công bố 5 loài thuộc chi Gynostemma Blume [7]:
1. Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino – Giảo cổ lam. Gồm có 2
thứ:
-

Gynostemma pentaphyllum var. pentaphyllum ( với 6 biến thể khác
nhau) – Giảo cổ lam, thư tràng, cổ yếm.

-

Gynostemma pentaphyllum var. dasycarpum C. Y. Wu – Giảo cổ lam
quả lông cứng

2. Gynostemma laxcum (Wall.) Cogn – Cổ yếm lá bóng.
3. Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. – Giảo cổ lam Miến Điện
4. Gynostemma longipes C. Y. Wu – Giảo cổ lam bảy lá.
5. Gynostemma compressum X.X. Chen & D. R. Liang – Giảo cổ lam quả
dẹt.
1.1.3. Đặc điểm thực vật của hai loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
và Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.
1.1.3.1. Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
Tên gọi khác: Cổ yếm, giảo cổ lam, thư tràng 5 lá, thất diệp đởm,…[3]
Đặc điểm thực vật :
Cây thảo mọc leo yếu, không lông hoặc lông thưa thớt không mấu. Lá kép có
cuống chung dài 3-4 cm; phiến lá 5-7 lá chét với mép có răng dài 3-9 cm, rộng 1,5-3 cm.
Tua cuốn mảnh xé đôi ở đỉnh [3], [4], [49].
Cụm hoa đực dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn,

thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0.7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi
mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5, bao phấn đính thành đĩa. Cụm hoa cái dạng chùy ngắn
hơn hoa đực. Hoa có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, ngắn
[49].


4

Quả khô, tròn, đường kính 5-9 mm, khi chín màu đen, hạt 2-3, treo, hình trứng
hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu [3],[ 49].
Hoa tháng 7-8. Quả tháng 9-10.
Thu hái dây lá vào mùa thu, phơi khô [3], [4], [6].
Phân bố: cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao
2000m [3], [49]. Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Nhật Bản, Việt Nam và
bán đảo Malayxia. Tại Việt Nam, cây mọc nhiều nơi như Lào Cai, Hòa Bình, Lạng Sơn,
Kon Tum, Đồng Nai [3], [4], [6].
1.1.3.2. Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.
Theo khóa phân loại chi Gynostemma Blume có đặc điểm thực vật như sau:
Cây thảo, mảnh, thân leo có góc-rãnh. Toàn thân có nhiều lông mịn bao gồm cả mấu,
chiều dài mỗi lóng thân 5-15cm. Lá kép chân vịt với cuống chung hình trụ có vân dọc ở
giữa; cuống chung dài 3-7cm; phiến lá do 3 lá chét tạo thành. Lá chét ở giữa hình thoi,
gốc hình nêm, mép khía tai bèo, đầu và gốc lá nhọn, cả hai mặt đều có nhiều lông, kích
thước mỗi phiến lá chét ở giữa 5-12cm × 3-6cm. Lá chét bên có hình trái xoan, kích
thước 4-9cm ×3-4cm. Gân lá hình lông chim với 8-9 gân bên. Cuống lá chét ở giữa dài
5-6mm, cuống lá chét bên ngắn hơn, đôi khi gần như không có cuống. Trên cây còn có
cả lá đơn hoặc lá kép hai lá chét. Tua cuống chia đôi ở phía ngọn và có nhiều lông ngắn
bao phủ. Cụm hoa đơn tính khác gốc. Quả mọng không tự mở khi chín, màu xanh, hình
cầu, đường kính 5-6 mm, bề mặt có lông, bên trong chứa 3 hạt. Hạt màu nấu, hình trứng
rộng, kích thước trung bình 3-5 × 3mm, dày khoảng 2mm, cả hai mặt đều có gai nhú,
bên rìa có nếp nhăn.

1.1.4. Thành phần hóa học
Theo Võ Văn Chi [3], trong Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường.
1.1.4.1. Nghiên cứu về saponin
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện phần aglycon của saponin trong Giảo cổ
lam thuộc nhóm dammaran [29], [41].


5

Hình 1.1. Công thức trong mặt phẳng của khung dammaran
Dammaran là một nhóm saponin thuộc loại saponin 4 vòng (saponin triterpenoid
tetracyclic). Khung cấu trúc có 4 vòng và một mạch nhánh 8 carbon. 4 vòng gồm 3 vòng
6 cạnh, 1 vòng 5 cạnh. Do có nhóm OH đính vào C-20 nên khi tác dụng bởi acid, mạch
nhánh dễ bị đóng vòng tetrahydropyran. Phần đường nối vào OH ở carbon C-3 hoặc C20 để tạo thành glycosid [2], [5].
1.1.4.2. Saponin trong Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino.
Các nghiên cứu về phân lập saponin từ chi Gynostemma chủ yếu tập trung vào
loài G. pentaphyllum. Saponin trong G. pentaphyllum còn được gọi là gynosaponin hay
gypenosid, hàm lượng gypenosid toàn phần chiếm khoảng 2,4 % khối lượng dược liệu
khô và đã có hơn 100 loại gypenosid được phân lập [41].
Số lượng gypenosid đã phân lập gấp khoảng 5-6 lần các ginsenosid ( thành phần
có hoạt tính chính của Nhân sâm Panax ginseng). Hơn nữa đã phân lập được 8 gypenosid
có cấu trúc giống như loại protonanaxadiol trong ginsenosid là Rb1 (gypenosid III) [28],
Rc [32], Rb3 (gypenosid IV), Rd (gypenosid III), F2, Rg3 [41], malonyl – Rb1, malonylRd [28], và 1 loại protopanaxatriol là ginsenosid Rf. Những ginsenosid này chiếm 25%
lượng gynosaponin toàn phần trong cây và cũng là ví dụ đầu tiên về ginsenosid được tìm
thấy ngoài họ Araliaceae [30].


6

Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino được trình bày qua hình

và bảng như sau:

R6
R4

20

R5

18

R7

17

a

b

CH2OH

c

OH

OH

R3

R2

1

OOH

9

O

e

d

f

30

R1

O
28

OCH3

29

g

Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum

OH
CH2O Glu

h

O
Rha

i

Hình 1.3. Các cấu trúc của R7


7

Bảng 1.1. Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của saponin trong
G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các nhóm thế

Hoạt chất

Đường glu, rham, xyl, có thể 1 hoặc

R1

2,3 đường kết hợp với nhau
R2

R3

-H

Gypenosid I, Rb1

- OH

Gynos TN1, gynos TN2

- CH3

Gypenosid I, Rb1

- CH2OH

R4

- CHO

Gylongiposid I

- OH

Rb1

-H

Gylongiposid I

- =O

Gypentonosid A

- OH

Rg3, Rf

- Đường đôi; thường là glu hết hợp Rb1, gymnemasid II

R5

với rha hoặc xyl
- CH3
R6

- CH2OH

Rb1

- CH2O-glu hoặc –CH2O-xyl
R7

Có thể là a,b,c,d,e,f,g,h hoặc i

Các ginsenosid đều có cấu trúc a

Loại đường chính trong gypenosid ( hầu hết là loại pyranose) là β- D- glucose, βD-xylose, α-L-arabinose và α-L-rhamnose nối ở C-3(β) và C-20. Nhóm chức tiêu biểu
là hydroxyl, methyl, aldehyd, alcol và ít phổ biến nhất là aceton ở vị trí C-19 (R3). Nhóm
–OH cũng có vị trí C-2 (α) và C-12 (β) [41].

8

Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được phát hiện
với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxyl-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [30].

Hình 1.4. Cấu trúc epoxy dammaran từ G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các saponin trong Giảo cổ lam đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở
dạng tinh thể gypenosid A [30], Gynogenin II [33] và gynosaponin TN1 [40] .
G. pentaphyllum có số lượng các loại saponin dammaran nhiều nhất trong các loài
thực vật đã được nghiên cứu [41].
1.1.4.3. Nghiên cứu về flavonoid
Flavonoid là một thành phần chính có mặt trong các loài thuộc chi Gynostemma
nhưng ít được nghiên cứu hơn saponin.
Đã xác định được trong G. pentaphyllum có ombuin, ombuoside, rutin, quercitindi-(rhammo)-hexosid, quercetin- hrammo-hexosid,kaempferol- rhammo-hexosid và
kaempferol-3-O-rutinosid [26].


9

1.1.4.4. Một số thành phần hóa học khác
-

Sterol: được xác định là có mặt trong G. pentaphyllum và chiếm một lượng nhỏ
(khoảng 0,0001 %) bao gồm ergostanol, sitosterol, stigmasterol [27], [41].

-

Carotenoid: năm 2004, H.L.Liu và các cộng sự đã xác định 25 carotenoid có mặt
trong G. pentaphyllum bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là trans- Lutein,
kế đến là cis-Lutein [31].

-

Polysarcharid: Đã phân lập được heteropolysaccharid phi tinh bột điển hình với
thành phần chính là glucose (23,2%), tiếp theo là galactose (18.9%), arabinose
(10,5%), rhamnose (7.7%),…[46]

-

Cholorophyll và dẫn chất: bằng phương pháp HPLC-MS, đã tách xác định được
trong G. pentaphyllum có 15 chlorophyll và dẫn chất [25].

-

Alcaloid: được báo cáo là không có mặt trong G. pentaphyllum [18].

-

Acid hữu cơ: đã xác định được sự có mặt của một số loại acid hữu cơ là acid malonic,
acid benzoic, acid vanilic.

1.1.5. Tác dụng sinh học
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các tác dụng dược lý, đa số các nghiên cứu
trên loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino và tập trung vào thành phần
gypenosid. Do tính chất đa tác dụng, loài cây này đã được đặt tên là cây trường sinh "the immortality herb".
Có rất nhiều các tác dụng sinh học của loài Gynostemma pentaphyllum đã được
nghiên cứu chứng minh, trong đó nổi bật là các tác dụng trên chuyển hóa.
1.1.5.1. Tác dụng trên chuyển hóa
Tác dụng hạ đường huyết
Khả năng hạ đường huyết được chứng minh qua các nghiên cứu sau:

- Các gypenosid từ G. pentaphyllum đã làm giảm được đáng kể lượng đường huyết khi
điều trị cho chuột được kích thích tăng đường huyết bởi streptozocin [41].


10

- Năm 2004, Norberg và cộng sự tìm ra phanoside có tác dụng kích thích insulinrelase
từ tụy chuột cống cô lập. Khi cho chuột uống, phanoside đã cải thiện sự dung nạp glucose
và tăng insulin huyết tương, từ đó làm hạ đường huyết [41].
- Các gypenosid cũng làm giảm glucose ngoại sinh trên chuột tiểu đường béo phì bằng
cách cải thiện sự nhạy cảm của các receptor insulin [36].
Tác dụng hạ lipid máu
Tác dụng của gypenosid trên chuyển hóa lipid đã được nghiên cứu rộng rãi trên
cả người lẫn động vật. Các kết quả cho thấy sử dụng các dịch chiết thô và các gypenoside
ở các liều khác nhau đều có khả năng làm giảm mức triglyceride và cholesterol trên động
vật thí nghiệm và người. Những thành phần mang lại hoạt tính này được báo cáo là
gynosaponin E, G, K, progypenoside A2, I, M, N và O [41].
Saponin toàn phần của giảo cổ lam có thể làm giảm cholesterol huyết tương bằng
cách tăng đào thải cholesterol và tác động thông qua các gen liên quan đến sự hấp thu
cholesterol và sự trao đổi chất [53].
1.1.5.2. Tác dụng chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa của gypenoside đã được báo cáo trong hoạt động thực
bào, tế bào nội mô và hệ thống vi thể ở gan. Các nghiên cứu tiếp theo đã khám phá ra
những tác dụng của gypenoside trên tế bào nội mô bị phá hủy bởi hydrogen peroxide.
Các nghiên cứu trên động vật của dịch chiết thô gypenoside cũng cho thấy các tác dụng
tương tự [17].
Giảo cổ lam làm tăng enzym SOD superoxide dismutase - một chất chống oxy
hóa nội sinh mạnh, giảm mức malondialdehyde (MDA). Các nghiên cứu cũng cho thấy
khả năng làm tăng hoạt động của thực bào, lympho T và tế bào diệt tự nhiên, ức chế khối
u [17].

Các thử nghiệm trên người cho thấy, mức SOD trở về mức cao khi uống 20mg
gypenoside hàng ngày trong một tháng [17].


11

Thông qua các thử nghiệm in-vitro và in-vivo cho thấy Gypenoside của G.
pentaphyllum có tác dụng chống lão hóa. Tăng khả năng tổng hợp procollagen 43 % so
với nhóm đối chứng, tăng 2,0 và 2,66 lần so với N-Acetylglucosamine tại các mức 5 và
10 μg/g dịch chiết gypenoside [52].
Các hợp chất phenolic từ Gynostemma pentaphyllum có khả năng chống oxy hóa
và đóng góp đáng kể vào hoạt động chống oxy hóa của G. pentaphyllum . Dịch chiết
nước và methanol có khả năng chống oxy hóa mạnh, có thể dùng để phòng chống bệnh
tiểu đường và bệnh tim mạch [42].
Một số nghiên cứu trên các mẫu G. pentaphyllum chỉ ra rằng, dịch chiết G.
pentaphyllum có khả năng dọn gốc tự do DPPH và gốc tự do hydroxyl . Khả năng dọn
gốc tự do DPPH của các mẫu dao động từ 5,7 -148,7 μmol Trolox Equivalents (TE)/g
đối với dịch chiết Methanol và 33,6- 416,8 μmol TE/g với dịch chiết 50% aceton. Khả
năng dọn gốc tự do hydroxyl dao động từ 122,1- 1618,3 μmol TE/g với methanol và
223,7- 4113,0 μmol TE/g với dịch chiết aceton 50 %. Kết quả này cũng gợi rằng aceton
50 % là dung môi thích hợp cho việc đánh giá khả năng dọn gốc tự do hơn so với
methanol [55].
1.1.5.3. Các tác dụng sinh học khác
Tác dụng trên hệ tim mạch
G. pentaphyllum có khả năng ảnh hưởng tới hoạt động của hệ tim mạch, cụ thể là
tác dụng làm giảm áp lực máu, làm giảm nhịp tim, làm tăng độ bền mạch ngoại vi, động
mạch não và động mạch vành [38]. Có nhiều nghiên cứu đã minh chứng cho điều này
như cải thiện chứng loạn nhịp tim ở lợn [23], làm giảm phạm vi nhồi máu cơ tim và co
thắt mạch vành ở thỏ, bảo vệ cơ tim ở chuột, tăng cường lưu thông trên mạch vành của
chó đã gây tê [41],…

Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
Nhiều thử nghiệm trên động vật cho thấy các gypenoside có tác dụng rõ rệt trên hệ
thần kinh trung ương.


12

Gypenosid toàn phần ( tiêm tĩnh mạch liều 50mg/kg trên thỏ) có tác dụng bảo vệ
não thỏ khỏi bị thiếu máu khi co thắt 2 động mạch cảnh [41]
Cao Gynostemma (450mg/kg) có tác dụng ức chế các hoạt động tự phát của chuột
khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột bằng cách sử dụng tấm kim loại nóng.
Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu, gypenosid liều 100mg/kg hạn chế
rõ rệt sự phá hủy AND và ARN [47].
Ảnh hưởng tới chức năng miễn dịch
Các gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300mg/kg trong 7 ngày gây tăng
chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh và
giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng trong thời gian
sống sót của chuột được ghép cơ tim [41].
Tác dụng tới tế bào ung thư
Một số hợp chất tinh khiết phân lập được từ G.pentaphyllum có tác dụng gây độc
tính với các dòng tế bào ung thư in-vitro: SGC-7901 (dạ dày), BEL – 7402 (gan), A549
(phổi) [29], [44], [45], HT-29 (ruột kết) [33], MCF-7 (ung thư vú), SK-OV-3 (ưng thư
buồng trứng) [29],…
Các gypenoside cũng ngăn chặn tác nhân gây đột biến cyclosphosphamid ở chuột
nhắt và đẩy mạnh quá trình hồi phục AND [31].
Dịch chiết polysaccharid của pentaphyllum (CGPP) có khả năng ức chế sự phát
triển của khối u rắn H22 - ung thư biểu mô gan cấy ở chuột tại mức liều 50 và 200mg/kg.
Đồng thời mức độ các cytokine như IL-2, TNF-α và IFN-γ, cũng như các hoạt động của
các tế bào diệt tự nhiên (NK) và lympho độc tế bào T (CTL) ở chuột mang khối u được
phát huy rõ rệt khi uống CGPP [54].

Tác dụng bảo vệ gan
Gypenosid cũng cho thấy tác động bảo vệ gan. Với liều 50 mg/kg tt tiêm dưới da
theo dõi trong 6 ngày hạn chế tác động của CCl4 lên γ-glutamine transaminase ở chuột
cống thí nghiệm. Gypenosid cũng có tác dụng kích thích phục hồi gan sau khi cắt bỏ 1


13

phần. Sử dụng cao thu được từ dịch chiết nước G. pentaphyllum (Thunb.) Makino với
liều 100, 300 và 500 mg/kg tt làm tăng sự phục hồi tổn thương gan bằng việc giảm sự
hoại tử, sự xung huyết, sự thấm của tế bào lympho và của tế bào Kupffer qua tĩnh mạch
trung tâm.
Tác dụng chống loét dạ dày
Gypenosid cũng có tác dụng chống loét . Gần đây đã nghiên cứu thấy dịch chiết
butanol có khả năng chống loét dạ dày. Điều trị bằng phân đoạn butanol từ G.
pentaphyllum (Thunb.) Makino bảo vệ màng nhày dạ dày và lượng hexosamin trong liệu
pháp gây loét bằng ethanol ở chuột cống. Chuột cống gây loét bằng H. pylori điều trị
bằng gypenosid dấu hiệu bệnh được cải thiện rõ rệt.
1.1.6. Độc tính
Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino là khá an toàn và không có tác dụng phụ, không độc tính [19], [22],
[48].
1.1.7. Chiết xuất, tinh chế
-

Chiết xuất: Theo nghiên cứu về phương pháp chiết xuất dược liệu Giảo cổ lam bằng
dung môi hữu cơ, chiết xuất bằng EtOH 70 % cho khối lượng cao toàn phần lớn nhất,
bước loại tạp bằng dung môi không phân cực trước khi chiết xuất gần như không ảnh
hưởng đến hiệu quả và khả năng chiết xuất của dung môi [10], [11].

-

Tinh chế Saponin từ dịch chiết:
Saponin là nhóm chất được quan tâm nhiều nhất trong Giảo cổ lam, đã có một số

phương pháp nghiên cứu về loại tạp, tinh chế saponin như sau:
Phương pháp 1: Loại tạp bằng ethanol tuyệt đối, saponin từ dịch lọc được tính chế
bằng phương pháp kết tủa trong aceton. Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có thể triển
khai trên quy mô công nghiệp [11].
Phương pháp 2: Tinh chế saponin từ dịch chiết bằng phương pháp chiết lỏng- rắn sử
dụng nhựa hấp phụ D101, rửa bằng EtOH 80%. Đây là phương pháp có quy trình đơn


14

giản, dễ thực hiện, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc hại, loại được nhiều
tạp mà không hao hụt saponin [9], [15].
Phương pháp 3: Tinh chế saponin bằng phương pháp chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa
hấp phụ Diaion HP-20, rửa bằng nước và MeOH 20 % để loại tạp và rửa giải trong
khoảng nồng độ MeOH từ 50-80% để thu saponin. Phương pháp loại được hết
chlorophyll và phần lớn flavonoid [12].
1.2. Quá trình oxy hóa trong cơ thể, các phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt
tính chống oxy hóa.
1.2.1. Gốc tự do và quá trình oxy hóa
Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với electron chưa ghép cặp rất không
ổn định và phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của gốc tự do:
ROS, RNS, RSS [1], [14], [34].
Bản chất của các gốc tự do là có khả năng phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn
phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [8], [34].
Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể

-

Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể.

-

Từ quá trình peroxyd hóa lipid.

-

Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể.

Đích phân tử chỉnh của các gốc tự do là các protein, DNA (acid
deoxyrybonucleic), RNA ( acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của gốc
tự do có liên quan đến nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch bao gồm cả xơ
vữa động mạch và đột quỵ, rối loạn vữa xơ động mạch, rối loạn thận, rối loạn gan, tăng
huyết áp, viêm khớp dạng thấp, hội chứng suy hô hấp người lớn, miễn dịch, viêm, rối
loạn thoái hóa gắn liền với quá trình lão hóa, đái tháo đường, biến chứng tiểu đường, đục
thủy tinh thể, bệnh béo phì, bệnh tự kỷ, bệnh Alzheimer, Parkinson và bệnh


15

Hungtingtons, viêm mạch, viêm cầu thận, lupus ban đỏ hệ thống, loét dạ dày,
hemochromatosis,…[34], [50].
1.2.2. Cơ chế chống oxy hóa

Hình 1.5. Các cơ chế chống oxy hóa trong cơ thể [20].
Các cơ chế chống oxy hóa khác nhau [20]:
1. Ức chế các enzyme xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS.

2. Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đấy quá trình chống oxy hóa
của tế bào.
3. Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính.


16

1.2.3. Các chất chống oxy hóa
1.2.3.1. Chất chống oxy hóa nội sinh
Các chất chống oxy hóa trong cơ thể người được chia thành 2 loại, các chất chống
oxy hóa có bản chất là enzyme và các chất chống oxy hóa không phải enzyme. Các
enzym có bản chất là protein thường được tổng hợp trong cơ thể.
Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzyme quan trọng ngăn chặn sự hình
thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathione peroxidase, catalase,
superoxide dismutase. Các chất chống oxy hóa không phải enzym cũng được tổng hợp
trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu là từ nguồn thức ăn bổ sung [34].
Bảng 1.2. Các chất chống oxy hóa tự nhiên
Các chất chống oxy hóa tự nhiên
Các enzym
Các chất không phải enzym
Glutathione peroxidase
Các chất chống oxy hóa nội sinh
Catalase

Co-Enzyme: Q10

Superoxide dismutase

Vitamin A

Glutathione reductase

Hợp chất chứa nitro (non- protein): uric

Glucose-6-phosphatedehydrogentase

Hợp chất chứa S: glutathione
Các chất chống oxy hóa ngoại sinh
Flavonoids
Flavonols: quercetin, kaempferol
Flavanols: catechin, pelagonidin
Anthocyanins: cyanidin, perlagonidin
Isoflavonoids:

Genistein,

Hesperidin,

Chrysin
Khoáng chất: kẽm, selen
Vitamin và dẫn chất : Vitamin A, E, K,
acid ascorbic