Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy mô cây hà thủ ô đỏ (fallopia multiflora (thunb ) haraldson

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI XUÂN HƢƠNG
Mã sinh viên: 1101240

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP NUÔI
CẤY MÔ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.)
HARALDSON)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢƠC HÀ NỘI

MAI XUÂN HƢƠNG
Mã sinh viên: 1101240

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP NUÔI
CẤY

MÔ

CÂY

HÀ

THỦ

Ô

(FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.))
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật
Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội

HÀ NỘI – 2016

ĐỎ


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa (Bộ môn Thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội) đã tận tình chỉ bảo và trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện
khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các chị kĩ thuật viên trong Bộ
môn Thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt chị Chu Thị Thoa và cô Lê Thị
Thu Về - Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ, chỉ bảo, luôn đồng hành cùng tôi
trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô ở các bộ môn Vật Lý Hóa Lý, Hóa Phân Tích - Độc Chất và toàn thể các thầy cô trong nhà trƣờng đã tạo
điều kiện đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên
cạnh giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng, đặc biệt là thời gian

làm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Mai Xuân Hƣơng


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN

2

1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố và công dụng của Hà thủ ô đỏ

2

1.1.1. Đặc điểm thực vật

2

1.1.2. Phân bố

2

1.1.3. Bộ phận dùng, chế biến, công dụng

3

1.1.4. Thành phần hóa học trong rễ củ của cây

3

1.2. Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

4

1.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào tế bào thực vật

4

1.2.2. Các phƣơng pháp nhân giống in vitro

4

1.2.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

5

1.2.4. Môi trƣờng và các chất kích thích sinh trƣởng

6

1.2.5. Ƣu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro

8

1.2.5.1. Ƣu điểm của nhân giống in vitro

8

1.2.5.2. Hạn chế của vi nhân giống

8

1.3. Các nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ

9

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ từ đỉnh sinh
trƣởng

9

1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ

10

CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

14


2.1.1. Nguyên liệu

14

2.1.2. Điều kiện nuôi cấy

14

2.1.3. Địa điểm tiến hành

14

2.1.4. Thời gian tiến hành

14

2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

14

2.1.6. Thiết bị

14

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

15

2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ

15

2.2.2. Phƣơng pháp khảo sát sơ bộ thành phần hóa học giữa cây mẹ và cây con sau
3 tháng tách bình

19

2.3. Nội dung nghiên cứu

20

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát giai đoạn khử trùng mẫu

20

2.3.2. Khảo sát nồng độ các chất kích thích sinh trƣởng

21

2.3.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học “cây mẹ” và “cây con” sau 3 tháng tách
bình

23

2.2.4. Phân tích số liệu

24

2.2.5. Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu

24

CHƢƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

25

3.1. Kết quả

25

3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát giai đoạn khử trùng mẫu

25

3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ kinetin đến khả năng cảm ứng chồi
của mẫu

26

3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh

26

3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh

27

3.1.5. Khảo sát môi trƣờng ra rễ

28

3.1.6. Chuyển cây ra vƣờn ƣơm

30


3.1.7. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học “cây mẹ” và “cây con” sau 3 tháng tách
bình

31

3.2. Bàn luận

35

3.2.1. Về quy trình khử trùng mẫu ở thí nghiệm 1 (mục 2.3.1)

35

3.2.2. Về giai đoạn cảm ứng mẫu ở thí nghiệm 2 (mục 2.3.2.1)

37

3.2.3. Về giai đoạn nhân nhanh ở thí nghiệm 3 (mục 2.3.2.2) và thí nghiệm 4 (mục
2.3.2.3)

38

3.2.4. Về giai đoạn ra rễ ở thí nghiệm 5 (mục 2.3.2.4)

41

3.2.5. Về giai đoạn chuyển cây ra vƣờn ƣơm

42

3.2.6. Về khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của “cây mẹ” và “cây con” sau 3 tháng
trồng tách bình

42

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải thích

BAP
CH3OH

CW
2,4 D
GACP - WHO

6 - benzylaminopurine
Methanol
Nƣớc dừa
Acid 2,4 Dicloronoxy acetic
Thực hành tốt trồng và thu hái
dƣợc liệu theo tổ chức y tế thế giới
Acid gibberellic
Hà thủ ô đỏ

GA
HTO
IAA
Javel
kinetin
KTST
MS
MT
α - NAA

Acid  indolacetic
Dung dịch natri hypoclorid
N6 - furfuryladenine
Kích thích sinh trƣởng
Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản của
Murashige và Skoog
Môi trƣờng

SKLM

Acid  naphthylacetic
Sắc kí lớp mỏng

SKĐ

Sắc kí đồ

TDZ

1 - phenyl - 3 - (1, 2, 3 - thiadiazol
- 5 - yl) Urê

tb

Trung bình


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trƣờng MS .................................... 7
Bảng 1.2. Thành phần vitamin của Morel (Morel's vitamin) ........................................... 7
Bảng 1.3. Hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng ............................................................. 7
Bảng 2.1. Thành phần trong 1l MS………………………………………………....... 15
Bảng 2.2. Nồng độ các chất KTST bổ sung vào các môi trƣờng MS ở các giai đoạn
nuôi cấy .......................................................................................................................... 16
Bảng 2.3. Các phƣơng pháp khử trùng mẫu .................................................................. 20
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng mẫu nghiên cứu………………………………………

25

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nồng độ kinetin ………………………………………… 26
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ BAP……………………………………………. 27
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát nồng độ NAA …………………………………………

28

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát môi trƣờng ra rễ………………………………………

28

Bảng 3.6. Giá trị Rf của các vết trên SKĐ các dịch chiết HTO……………………… 32
Bảng 3.7. So sánh kết quả khảo sát giai đoạn nhân nhanh của các nghiên cứu trƣớc
đây…………………………………………………………………………………..

40


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cây Hà thủ ô đỏ................................................................................................ 2
Hình 1.2. Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua phƣơng thức tăng
khả năng phát sinh chồi nách) .......................................................................................... 5
Hình 3.1. Mẫu nghiên cứu sau khử trùng thành công………………………………

29

Hình 3.2. Mẫu nghiên cứu ở nồng độ kinetin thích hợp (C3) ........................................ 29
Hình 3.3. Mẫu nuôi cây ở nồng độ BAP thích hợp (C14) ............................................. 29
Hình 3.4. Mẫu nuôi cấy ở nồng độ NAA thích hợp (C1N) ........................................... 29

Hình 3.5. Mẫu nghiên cứu ra rễ ở môi trƣờng R4.......................................................... 30
Hình 3.6. Mẫu cây đƣợc chuyển ra cát .......................................................................... 31
Hình 3.7. Mẫu cây đƣợc chuyển ra bầu ......................................................................... 31
Hình 3.8. Mẫu đƣợc trồng tại vƣờn thực vật của trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ........... 31
Hình 3.9. SKĐ các dịch chiết HTO1 và HTO2 ............................................................. 33
Hình 3.10. Hình ảnh chồng phổ phân tích bằng SKLM của dịch chiết HTO1 và HTO2
(366nm) .......................................................................................................................... 33
Hình 3.11. Hình ảnh chồng phổ phân tích bằng SKLM của HTO1 và HTO2 (254nm) 34
Hình 3.12. Hình ảnh chồng phổ phân tích bằng SKLM của HTO1 và HTO2 (ánh sáng
thƣờng sau phun thuốc thử)............................................................................................ 34


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hà thủ ô đỏ là dƣợc liệu quý đã đƣợc nhân dân các nƣớc châu Á sử dụng với
nhiều tên gọi khác nhau nhƣ dạ hợp, dạ giao đằng… Bộ phận rễ củ có tác dụng bổ
máu, trị di tinh, đới hạ (khí hƣ), thần kinh suy nhƣợc, sốt rét kinh niên, đi ngoài ra máu,
bổ gan thận, đen râu tóc. Bộ phận trên mặt đất có tác dụng dƣỡng tâm an thần, dƣỡng
huyết hoạt lạc…[1].
Ngày 19/04/2011, Bộ Y tế ban hành Thông tƣ 16/2011/TT - BYT quy định đến
31/12/2013 tất cả các doanh nghiệp sản xuất thuốc từ dƣợc liệu phải đạt tiêu chuẩn
GMP dƣợc liệu. Do đó, tiêu chuẩn GACP – WHO cần thiết đƣợc áp dụng rộng rãi để
đáp ứng nhu cầu nguồn nguyên liệu trong cả nƣớc [7]. Tuy nhiên, cho đến nay trong cả
nƣớc chƣa có đơn vị nào cung cấp giống cũng nhƣ tiến hành trồng Hà thủ ô đỏ với quy
mô lớn đạt tiêu chuẩn GACP – WHO đáp ứng nhu cầu nguồn dƣợc liệu cho sản xuất
thuốc đông dƣợc. Dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ vẫn đang đƣợc thu mua từ nhiều nguồn khác
nhau ở cả trong và ngoài nƣớc, do đó xuất xứ cũng nhƣ chất lƣợng còn nhiều lo ngại.
Vì vậy, nhu cầu về nguồn giống Hà thủ ô đỏ đồng nhất, sạch bệnh, số lƣợng lớn đang
là vấn đề cấp thiết đặt ra đối với ngành dƣợc, đồng thời chất lƣợng cây giống nuôi cấy

mô cũng cần đƣợc kiểm tra nghiêm ngặt. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ”
với các mục tiêu:
-

Khảo sát các điều kiện nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ.

-

So sánh sơ bộ thành phần hóa học của phần trên mặt đất cây mẹ và cây con sau

3 tháng tách bình trồng ra đất bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng để khảo sát sơ bộ
chất lƣợng cây giống in vitro.


2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố và công dụng của Hà thủ ô đỏ
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson), họ Rau răm
(Polygonaceae). Tên gọi khác: Polygonum multiflorum (Thunb.) Haraldson. Hà thủ ô
đỏ theo dân gian hay đƣợc gọi là Dạ giao đằng vì ban đêm hai cây quấn thân vào nhau
[2], [5].
Đây là loại dây leo, sống nhiều năm. Mặt ngoài thân màu xanh tía, có vân, nhẵn,
không có lông. Lá mọc so le, có cuống dài, phiến lá hình tim hẹp dài 4 - 8 cm, rộng 2,5
- 5 cm, đầu nhọn, gốc lá hình tim, hoặc hình mũi tên, mép nguyên hoặc hơi lƣợn sóng,
cả 2 mặt đều nhẵn và không có lông. Lá kèm mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa
mọc thành chùm, nhiều nhánh, cánh hoa màu trắng. Hoa nhỏ, đƣờng kính 2 mm, có
cuống ngắn 1 - 3 mm. Bầu nhụy hình 3 cạnh, vòi nhụy 3, rời, ngắn. Quả đóng hình thấu

kính [5]. (Hình 1.1)

Hình 1.1. Cây Hà thủ ô đỏ

1.1.2. Phân bố
Hà thủ ô đỏ phân bố rộng khắp ở các quốc gia Trung Quốc, Nhật Bản, Việt
Nam. Ở Việt Nam, cây mọc hoang từ Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang vào Ninh
Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Tây Nguyên. Thƣờng gặp dƣới tán tráng cây bụi, trong


3

các rừng thƣa ven suối hay ven đƣờng râm mát ở chân núi hoặc khe đá. Cây cũng đƣợc
trồng nhỏ lẻ phục vụ nhu cầu nhân dân ở nhiều nơi từ bắc chí nam nhƣ Vĩnh Phúc, Phú
Thọ… đến Lâm Đồng, Đắc Lắc, Phú Yên, Bình Định... [2].

1.1.3. Bộ phận dùng, chế biến, công dụng
-

Bộ phận dùng là rễ củ phơi khô của cây Hà thủ ô đỏ.

-

Chế biến:
Rễ củ to, đƣờng kính trên 6 cm, vỏ nâu sẫm, cứng chắc, nhiều bột, ít xơ. Mùa

thu hoạch vào tháng 8. Đào củ về, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ
đôi, phơi hay sấy khô tới độ ẩm dƣới 13%.
Có thể chế biến bằng cách đồ với nƣớc đậu đen. Tiến hành đồ và phơi đƣợc chín
lần (cửu chƣơng cửu sái) thì càng tốt.

-

Vị đắng, chat, hơi ngọt; tính ấm.

-

Quy kinh: can, thận.

-

Tác dụng: ích khí trừ phong, mạnh gân cốt.

-

Công dụng: bổ máu, trị di tinh, đới hạ (khí hƣ), thần kinh suy nhƣợc, sốt rét kinh
niên, đi ngoài ra máu, bổ gan thận, uống lâu làm đen râu tóc.

-

Liều dùng: ngày dùng từ 12 – 20 g dƣới dạng thuốc sắc, thuốc bột hay ngâm
rƣợu.

-

Kiêng kị: tỳ hƣ, đại tiện lỏng, kể cả táo bón nhiều

-

Tƣơng kị: hành, tỏi, củ cải, đồ bằng sắt [1], [5].
Tuy nhiên, phần thân leo của cây Hà thủ ô đỏ cũng đƣợc sử dụng nhiều với tác

dụng dƣỡng tâm an thần, dƣỡng huyết hoạt lạc; dùng trị chứng thần kinh suy nhƣợc,
thiếu máu, đau mỏi toàn thân [1].

1.1.4. Thành phần hóa học trong rễ củ của cây
Thành phân hóa học trong rễ củ của cây gồm:
Anthranoid tỷ lệ 1,7%, chủ yếu chrysophanola, emodin và rhein có tác dụng làm
tăng nhu động ruột, kích thích tiêu hóa và cải thiện dinh dƣỡng.


4

Chất đạm 1,1%, tinh bột 45,2%, chất béo 3,1%, chất vô cơ 4,5%, chất tan trong
nƣớc 26,4% và lecithin.
Lecithin bản chất là phospholipid đƣợc cấu tạo từ acid glycerophosphoric với
một phân tử choline và hai phân tử acid béo, đƣợc dùng trong trƣờng hợp thiếu dinh
dƣỡng, thần kinh suy nhƣợc [5].

1.2. Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù các khái niệm chỉ ra tất cả các quy
trình nuôi cấy mà đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lí thực
vật. Mặc dù phôi thai từ đầu thế kỉ 20, khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào vào
chọn giống và nhân giống cây trồng chỉ rõ nét vào khoảng 20 năm gần đây do các phát
hiện sau:
- Tính toàn thể của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh cây hoàn chỉnh từ
mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời.
- Khả năng nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ nuôi cấy vi sinh vật và có khả năng
ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác chọn tạo giống.

- Khả năng dùng chồi nách để nhân giống vô tính tốc độ cực nhanh một số cây
nông nghiệp.
- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng
trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dƣới dạng cây nuôi trong ống nghiệm [12],
[14].

1.2.2. Các phƣơng pháp nhân giống in vitro
Có 3 phƣơng pháp tạo cây con trong nhân giống in vitro:


Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (Hình 1.2).



Mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi


5



Mẫu mô phát sinh callus, callus phát triển phôi (hoặc nuôi cấy dịch

huyền phù tế bào phát sinh phôi) và từ phôi thu đƣợc cây hoàn chỉnh [11], [14].

Cây

cắt đỉnh phân sinh và
chồi bên

Cấy mẫu
vào MT
dinh dưỡng
thích hợp

cấy chuyển lặp
lại nhiều lần

Chồi in vitro

nhân nhanh
Tạo
rễ

Cây
giống

đƣa ra
vƣờn ƣơm

Cây in vitro
hoàn chỉnh

Hình 1.2. Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua phƣơng thức
tăng khả năng phát sinh chồi nách)

1.2.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro
Quá trình vi nhân giống thông thƣờng gồm năm giai đoạn chính:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thƣờng là cây ƣu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao.

Chọn cơ quan để lấy mẫu thƣờng là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá
non … có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ đƣợc các đặc tính sinh học quý của cây
mẹ và ổn định. Tùy điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng.
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy.
Cấy mẫu vô trùng vào môi trƣờng nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi,
gọi là cấy mẫu in vitro, đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trƣởng
nhanh.


6

Giai đoạn này kéo dài 2 - 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển (tùy thuộc loại
cây nghiên cứu).
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Thành phần và điều kiện môi trƣờng phải đƣợc tối ƣu hóa nhằm đạt mục đích
nhân nhanh.
Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 - 2 tháng tùy loại cây. Hệ số
nhân nhanh là 2 - 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn này thƣờng yêu cầu 10 - 36 tháng
và cũng không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma.
Tăng tỷ lệ auxin/ cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngƣợc lại sẽ kích
thích phát sinh chồi.
Giai đoạn 4: Ra rễ
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhƣng
thông thƣờng các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trƣờng khác để kích
thích tạo rễ. Giai đoạn này thƣờng cần 2 - 8 tuần.
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu tiên cây đƣợc chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí
nghiệm ra ngoài tự nhiên nên cần đƣợc chăm sóc đặc biệt: giá thể trồng cây có thể là
đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo. Cây đƣợc che phủ bằng nilon, tƣới phun sƣơng

đảm bảo cung cấp độ ẩm và làm mát
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần [10], [12], [17].

1.2.4. Môi trƣờng và các chất kích thích sinh trƣởng
Các nghiên cứu nuôi cấy mô cây tế bào thực vật đều sử dụng môi trƣờng nuôi
cấy cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962), bổ sung thêm vitamin theo Morel, các
chất kích thích sinh trƣởng và 1 số thành phần khác [14], [16] đƣợc trình bày ở bảng
1.1, bảng 1.2 và bảng 1.3.


7

Bảng 1.1. Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trƣờng MS
( Murashige và Skoog, 1962)
Các loại Skoog
Skoog I: Đa lƣợng

Skoog II: Sắt

Skoog III: Vi lƣợng

Thành phần
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
MnSO4.4H2O

H3BO3
ZnSO4.7H2O
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O

Hàm lƣợng
1650 mg/l
1900 mg/l
170 mg/l
370 mg/l
440 mg/l
37,3 mg/l
27,80 mg/l
22,30 mg/l
6,200 mg/l
8,600 mg/l
0,830 mg/l
0,250 mg/l
0,025 mg/l
0,025 mg/l

Bảng 1.2. Thành phần vitamin của Morel (Morel's vitamin)
Pirydoxine
(B6)
1 mg/ L

Biotin (H) Meso Inositol
0,01 mg/l 100 mg/l

Acid
Nicotinic
1 mg/l

Thiamin
HCl (B1)
1 mg/l

Canxi
Pantotate
1 mg/l

Bảng 1.3. Hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng
Các nhóm

Auxin

Các chất
IAA, NAA,
2,4D

Hoạt tính
ứng dụng
- kích thích ra rễ*
- kích thích tạo rễ trong
- điều chỉnh ƣu thế nhân giống vô tính.
ngọn**.
- điều chỉnh sự rụng
lá

- tạo callus


8

Cytokinine

kinetin, BAP, - phân hóa chồi.
- nhân nhanh trong nuôi
TDZ, zeatin
- điều chỉnh ƣu thế cấy mô tế bào thực vật.
ngọn.

Chú thích:
*: quá trình ra rễ gồm 3 giai đoạn: phản phân hóa tế bào vùng xuất hiện rễ, xuất hiện
mầm rễ, rễ xuyên vỏ ra ngoài.
**: chồi ngọn sinh trƣởng thì chồi bên ngừng sinh trƣởng, ngắt chồi ngọn thì chồi bên
phát triển.

1.2.5. Ƣu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro
1.2.5.1. Ƣu điểm của nhân giống in vitro
- Đƣa ra sản phẩm nhanh, hệ số nhân giống cao: từ 1 cây trong vòng 1 đến 2
năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất.
- Tiết kiệm không gian vì các vật liệu khởi đầu có kích thƣớc nhỏ và sản xuất
hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết.
- Nâng cao chất lƣợng cây giống, là một phƣơng pháp hữu hiệu để loại trừ virus,
nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh.
- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn, lợi thế về vận chuyển, sản
xuất quanh năm [12], [17].

1.2.5.2. Hạn chế của vi nhân giống
- Không phải tất cả cây trồng thƣơng phẩm đều có thể nhân giống bằng nhân
giống in vitro do nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực
vật in vitro vẫn chƣa đƣợc giải đáp.
- Đối với nhân giống in vitro một số cây, chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm
còn khá cao so với các phƣơng pháp truyền thống nhƣ chiết, ghép và nhân giống bằng
hạt.


9

- Hiện tƣợng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình do biến dị tế bào soma. Kết quả là
“cây con” không giữ đƣợc các đặc tính quý của “cây mẹ” [12], [17].

1.3. Các nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô
đỏ
Các nghiên cứu nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ trong và ngoài nƣớc đều sử dụng
môi trƣờng nuôi cấy cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962), bổ sung thêm vitamin
theo Morel và các chất kích thích sinh trƣởng cùng 1 số thành phần khác [14], [16]
(đƣợc trình bày ở bảng 1.1, bảng 1.2 và bảng 1.3).

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ từ đỉnh
sinh trƣởng
Năm 2003, Chang Lin và cộng sự đã phát hiện môi trƣờng MS có bổ sung NAA
với nồng độ 0,2 mg/l và BAP với nồng độ 2,0 mg/l kích thích đoạn thân tách từ chồi in
vitro của cây Hà thủ ô đỏ phát triển và tạo cụm chồi tốt nhất, tỷ lệ mẫu tạo chồi khoảng
97% và số chồi cao nhất đạt trung bình 4,7 chồi trên một mẫu sau 6 tuần nuôi cấy.
Đồng thời, môi trƣờng MS có bổ sung NAA với nồng độ 0,2 mg/l và BAP với nồng độ
4,0 mg/l thì có 95% mẫu nuôi cấy tạo cụm chồi và số chồi trung bình trên một mẫu là

3,3 chồi [13].
Năm 2015, nhóm nghiên cứu Park W. T đã khảo sát các môi trƣờng MS có bổ
sung với 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 và 4,0 mg/l BAP, kinetin, TDZ, zeatin để tìm môi trƣờng
nhân nhanh thích hợp. Kết quả 0,5 mg/l BAP bổ sung vào MS cho hệ số nhân chồi đạt
cao nhất (2,0 chồi/ mẫu) trong tất cả các chất nhóm cytokinin đƣợc khảo sát [15].
Để cải thiện tái sinh chồi, nhóm nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát ảnh
hƣởng nồng độ (0,0; 0,1; 0,5 và 1,0 mg/l) của IAA, IBA và NAA. Kết quả thu đƣợc là
phối hợp BAP nồng độ 0,5 mg/l và IAA nồng độ 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt cao
nhất (3,1 chồi/ mẫu). Các kết hợp khác của BAP và auxin khác nhau gây ra sự khác
biệt nhỏ về hệ số nhân chồi nhƣng gây ra sự khác nhau lớn về chiều dài chồi [15].


10

Các nghiên cứu này đƣợc thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 1°C, thời gian
chiếu sáng 16 giờ dƣới ống huỳnh quang trắng trong 6 tuần [15].

1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ
1.3.2.1. Các nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
1.3.2.1.1. Giai đoạn lấy mẫu, xử lí mẫu, khử trùng
Các tác giả Hoàng Thị Kim Hồng (2011) và Nguyễn Xuyến Thành Thắng
(2012) đã sử dụng nguyên liệu khởi đầu trong nghiên cứu này là những đoạn thân (1,0
- 1,5 cm) mang một mắt lá của cây Hà thủ ô đỏ trƣởng thành trồng ngoài tự nhiên, rửa
sạch bằng xà phòng dƣới dòng nƣớc chảy. Khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 30
giây [4], [8].
Sau đó, nhóm nghiên cứu Hoàng Thị Kim Hồng (2011) không khảo sát giai
đoạn khử trùng mà dùng Javel 20% trong 10 phút, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần.
Rồi cấy trên môi trƣờng cơ bản MS bổ sung 0,5 mg/l BAP để tạo chồi in vitro làm
nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau 10 ngày 100% mẫu tạo chồi, với 1 chồi/
mẫu, kích thƣớc trung bình của chồi khoảng 1 cm [4].

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Xuyến Thành Thắng lại khử trùng bằng kháng
sinh peniciline trong 1 giờ, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Sau đó khảo sát thời
gian khử trùng bằng Javel 20%, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Rồi cấy trên môi
trƣờng cơ bản MS, mẫu tạo chồi in vitro làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả thu đƣợc là 10 phút khử trùng bằng Javel 20% cho tỉ lệ sống không nhiễm cao
nhất (77%) sau 3 tuần [8].
Nhƣ vậy, hai nghiên cứu này đều sử dụng Javel 20% trong 10 phút để khử trùng
mẫu, đều cho tỉ lệ mẫu sống và phát triển lên sạch, không nhiễm khuẩn và nấm cao.

1.3.2.1.2. Giai đoạn nhân nhanh
Nhìn chung, các nghiên cứu đều sử dụng môi trƣờng cơ bản MS có bổ sung
cytokinin, auxin và tiến hành khảo sát nồng độ tối ƣu của chất kích thích sinh trƣởng


11

trong hai nhóm đó để cho hệ số nhân chồi cao nhất, có thể bổ sung một số thành phần
khác nhƣ nƣớc dừa trong nghiên cứu của Hoàng Thị Kim Hồng (CW 10%) [4].
Nguyễn Xuyến Thành Thắng (2012) khảo sát điều kiện tối ƣu cho sự tái sinh
chồi bằng việc sử dụng môi trƣờng MS, bổ sung kết hợp các chất kích BAP có nồng độ
từ 1,0 đến 5,0 mg/l và kinetin có nồng độ từ 0,2 đến 2,0 mg/l; BAP có nồng độ từ 1,0
đến 5,0 mg/l và NAA có nồng độ từ 0,2 đến 2,0 mg/l. Kết quả là môi trƣờng MS có
BAP 4,0 mg/l và kinetin 1,5 mg/l cho tỉ lệ tạo chồi cao nhất 88,88%.
Sau đó nhóm nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát điều kiện tối ƣu tái sinh cụm
chồi, nhận thấy môi trƣờng MS có bổ sung BAP với nồng độ 4,0 mg/l và NAA có nồng
độ 0,5 mg/l cho tỷ lệ tạo chồi trung bình trên mỗi mẫu cấy cao nhất là 8,11 chồi [8].
Hoàng Thị Kim Hồng (2011) đã khảo sát điều kiện tối ƣu cho việc tái sinh cụm
chồi bằng việc sử dụng MS có bổ sung 10% CW và BAP có nồng độ từ 2,0 đến 7,0
mg/l, kết hợp với NAA có nồng độ 0,1 mg/l. Sau 5 tuần nuôi cấy, kết quả thu đƣợc là
môi trƣờng MS có bổ sung BAP nồng độ 4,0 mg/l và NAA nồng độ 0,1 mg/l cho hệ số

nhân cao nhất là 8,54 chồi/ mẫu, không có hiện tƣợng tạo callus, các chồi con có thân
và lá màu xanh, phát triển to và khỏe [4].
Trong cả hai nghiên cứu trên, nồng độ BAP tối ƣu đƣợc xác định là 4,0 mg/l ở
cả 2 nghiên cứu. Tuy nhiên trong nghiên cứu của Hoàng Thị Kim Hồng dùng NAA
nồng độ 0,1 mg/l là thấp hơn so với nồng độ NAA sử dụng trong nghiên cứu của
Nguyễn Xuyến Thành Thắng mà vẫn cho hệ số nhân của chồi cao hơn. Điều này có thể
giải thích do Hoàng Thị Kim Hồng luôn sử dụng 10% nƣớc dừa trong môi trƣờng nuôi
cấy. Nghiên cứu trƣớc đây của Trần Thị Kim Thu (2008) cũng đã cho thấy nƣớc dừa
có tác động tốt đến sinh trƣởng của đoạn thân tách từ chồi in vitro của cây Hà thủ ô đỏ.
Môi trƣờng MS có bổ sung nƣớc dừa cho cụm chồi phát triển tốt hơn so với môi
trƣờng cơ bản MS không có nƣớc dừa, do trong thành phần nƣớc dừa có chứa
cytokinin kích thích phát sinh chồi [9].


12

Tiếp tục khảo sát khả năng tạo cụm chồi trên các môi trƣờng nhân chồi có bổ
sung BAP nồng độ từ 2,0 đến 7,0 mg/l kết hợp với NAA ở nồng độ cao hơn từ 0,2 đến
0,4 mg/l. Khả năng tạo cụm chồi đạt tốt nhất ở môi trƣờng MS có bổ sung NAA 0,2
mg/l kết hợp với BAP 4,0 mg/l: hệ số nhân đạt cao nhất và có hiện tƣợng tạo callus.
Tuy nhiên, nếu bổ sung cố định 0,2 mg/l NAA vào môi trƣờng nhân chồi, nhƣng tăng
nồng độ BAP lên mức cao hơn từ 5,0 đến 7,0 mg/l thì khả năng tạo cụm chồi bị giảm ở
hầu hết các mô nuôi cấy, đồng thời các mô nuôi cấy này đều có khả năng tạo callus ở
mức trung bình, trong đó trƣờng MS có bổ sung 0,3 mg/ml NAA và BAP 5,0 mg/l cho
hệ số nhân chồi cao nhất [4].
Khi thay BAP bởi kinetin và sử dụng tổ hợp môi trƣờng nhân chồi MS có bổ
sung kinetin nồng độ từ 2,5 đến 5,0 mg/l kết hợp NAA nồng độ từ 0,1 đến 0,5 mg/l,
nhận thấy đoạn thân tách từ chồi in vitro cây Hà thủ ô đỏ có khả năng phân hóa thành
cụm chồi. Tuy nhiên, số chồi tạo thành trên một mẫu nuôi cấy lại ít hơn nhiều so với
môi trƣờng nhân chồi tƣơng tự có bổ sung BAP; thời gian, tốc độ nảy chồi và khả năng

sinh trƣởng và tạo cụm chồi có xu hƣớng yếu hơn so với môi trƣờng tƣơng ứng có bổ
sung BAP. Cụm chồi in vitro tạo thành trên các môi trƣờng MS bổ sung BAP thƣờng
có lá to, màu xanh và thân to khỏe. Trên các môi trƣờng tƣơng ứng nhƣng thay BAP
bởi kinetin thì cụm chồi in vitro tạo thành thƣờng có lá bé hơn, thân nhỏ hơn, đồng thời
tạo callus nhiều và rõ hơn [4].

1.3.2.1.3. Giai đoạn ra rễ
Cả hai nghiên cứu đều sử dụng các chồi in vitro (3 – 6 cm) đƣợc tách ra từ cụm
chồi và đƣa lên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng nhóm auxin,
cytokinin để tái sinh rễ.
Hoàng Thị Kim Hồng (2011) sử dụng môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA
để tái sinh rễ. Kết quả rễ tạo ra nhiều, sinh trƣởng và phát triển tốt, nghiên cứu này
không khảo sát môi trƣờng ra rễ [4].


13

Nguyễn Xuyến Thanh Thắng (2012) khảo sát các môi trƣờng MS có bổ sung
NAA có nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l để tái sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả thu
đƣợc là môi trƣờng MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l, cây tạo rễ, sinh trƣởng và phát triển
tốt sau 4 tuần nuôi cấy [8].
Cả 2 nghiên cứu này đều đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 250 C ± 20C,
cƣờng độ chiếu sáng là 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ ngày [4], [8].

1.3.2.2. Nghiên cứu nhân giống thông qua tạo mô sẹo
Năm 2009, nhóm tác giả Huỳnh Thị Đan San đã nghiên cứu sự phát sinh phôi
soma từ mô sẹo lá cây Hà thủ ô đỏ [6]. Nghiên cứu đã tiến hành cắt ngang gân chính
tạo vết thƣơng, đặt úp trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4D với nồng độ 1,0 mg/l. Sau 2
tuần mô sẹo đã hình thành khắp bề mặt mẫu cấy. Sự nuôi cấy đƣợc đặt dƣới ánh sáng
2500 ± 500 lux, nhiệt độ 22 ± 20 C [6]. Tiếp theo, chuyển mô sẹo sang môi trƣờng MS

cơ bản và các môi trƣờng MS có bổ sung các chất chất KTST khác nhau với các nồng
độ khác nhau nhƣ 2,4D nồng độ 2,0 mg/l; NAA nồng độ 2,0 mg/l; IAA nồng độ 2,0
mg/l; tổ hợp NAA 0,5 mg/l và BAP 2,0 mg/l để theo dõi sự tăng sinh mô sẹo sau 8 tuần
nuôi cấy. Kết quả thu đƣợc ở môi trƣờng MS cơ bản mô sẹo tăng sinh chậm; các môi
trƣờng MS có bổ sung đơn lẻ một chất KTST là 2,4 D; NAA; IAA cho rễ nhiều, sự gia
tăng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo không đáng kể; môi trƣờng MS có bổ sung tổ hợp
NAA nồng độ 0,5 mg/l và BAP nồng độ 2,0 mg/l mô sẹo tăng sinh nhanh, trắng, hơi
vàng, mềm, vách tế bào mỏng và tế bào chất đậm đặc, thích hợp để cảm ứng sinh phôi.
Do đó môi trƣờng MS có bổ sung tổ hợp NAA nồng độ 0,5 mg/l và BAP nồng độ 2,0
mg/l đƣợc lựa chọn là môi trƣờng tối ƣu tạo mô sẹo cho mẫu Hà thủ ô đỏ nghiên cứu.
Sau đó, mô sẹo đƣợc cảm ứng tạo tế bào sinh phôi trên môi trƣờng MS có bổ
sung 2,4D nồng độ 1,0 mg/l sau 1 tuần và chuyển sang môi trƣờng MS cơ bản sau 2
tuần đã có sự xuất hiện của phôi hình cầu. Phôi hình cầu chuyển sang môi trƣờng MS
có bổ sung NAA, BAP và nƣớc dừa 10% phát triển qua các giai đoạn phôi hình tim và
phôi tử diệp [6].


14

CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là giống Hà thủ ô đỏ đƣợc thu tại huyện Phố Cáo - Hà
Giang trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2014. Tiêu chí chọn mẫu: chọn cây
trƣởng thành, khỏe mạnh, xanh tốt, không sâu bệnh. Mẫu này đƣợc đem về trồng lƣu
giữ tại vƣờn thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Thân thu hái về đƣợc giữ tƣơi,
không ẩm ƣớt đảm bảo điều kiện vệ sinh để làm thí nghiệm. Cây đã đƣợc giám định lại
tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, họ Polygonaceae.

2.1.2. Điều kiện nuôi cấy
- Phòng nuôi cấy: nhiệt độ phòng 250C - 270C, cƣờng độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, độ
ẩm < 70%.
- Thời gian chiếu sáng: 8 - 12 h/ ngày.
- Các dụng cụ buồng cấy đƣợc khử trùng bằng cồn, nhiệt, tia UV.
- Độ pH của môi trƣờng nuôi cấy: 5,6 - 5,8.

2.1.3. Địa điểm tiến hành
Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô của Bộ môn Thực vật - Trƣờng đại học Dƣợc
Hà Nội.

2.1.4. Thời gian tiến hành
Từ tháng 8/2015 - 5/2016

2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất khử trùng: Ethanol 700, H2O2, HgCl2, các chất để pha môi trƣờng cơ
bản MS, các chất kích thích sinh trƣởng: BAP, kinetine, α - NAA, IAA.

2.1.6. Thiết bị
- Thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô:


15

Máy khuấy từ, cân kĩ thuật , máy đo pH Eutech Instruments pH 510, tủ sấy, nồi hấp vô
trùng Hyrayama HV50, box cấy vô trùng.
- Thiết bị cho khảo sát sơ bộ thành phần hóa học:


Máy siêu âm Ultrasonic LC60H.



Bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck).



Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký

Linomat 5, buồng triển khai ADC2, máy nhúng thuốc thử CAMAG, buồng phát hiện
TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ
2.2.1.1. Các công thức môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng cơ bản (MS): Muối đa lƣợng, vi lƣợng, sắt theo Murashige and
Skoog (Murashige and Skoog, 1962), vitamin theo Morel có bổ sung chất kích thích
sinh trƣởng và 1 số thành phần phần khác đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 và bảng 1.2.
Cách pha 1l MS nhƣ bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần trong 1l MS
STT
1
2
3
4
5
6
7
8

Thành phần
Đa lƣợng
Vi lƣợng
Vitamin
Sắt
MyO
Đƣờng saccarose
Thạch agar
Chất KTST: auxin, cytokinin

Lượng lấy
100 ml
5 ml
5 ml
2 ml
100 mg
30 g
4,5 - 5 g
Tùy trƣờng hợp khảo sát (Bảng
2.2)


16

Bảng 2.2. Nồng độ các chất KTST bổ sung vào các môi trƣờng MS ở các giai đoạn
nuôi cấy
Kí hiệu Nồng độ
STT Nhóm thí môi
Kinetin
nghiệm

trƣờng
(mg/l)
nuôi cấy
1
Khảo sát
giai đoạn MS7
0,25
khử trùng
2
C1
0,1
Tái sinh C2
3
0,25
chồi tạo C3
4
0,5
vật liệu C4
5
1,0
khởi
đầu
6
C5
1,5
7
C6
2,0
8
C7

2,5
9
C8
X
10
C9
X
11
C10
X
12
C11
X
13
C12
X
Nhân
14
C13
X
nhanh
15
C14
X
16
C15
X
17
C1N
X

18
C2N
X
19
C3N
X
20
C4N
X
21
R1
Ra rễ
22
R2
23
R3
24
R4

BAP
(mg/l)

NAA
(mg/l)

IAA
(mg/l)

0,1
0,2

0,3
0,4
0,5
0,25
0,5
1,0

1,0
0,25
0,5
0,5

1,0

0,1
0,25
0,5
0,75
1,0
1,5
2,0
2,5
Y
Y
Y
Y

Chú thích:
X (mg/l): Nồng độ kinetin thích hợp xác định đƣợc ở nhóm thí nghiệm tái sinh chồi tạo
vật liệu khởi đầu (mục 2 – 8).

Y (mg/l): Nồng độ BAP thích hợp xác định đƣợc ở nhóm thí nghiệm nhân nhanh (mục
9 – 16).