nghiên cứu tạo dòng tế bào chodg44 mang gen sản xuất kháng thể đơn dòng tái tổ hợp kháng thụ thể her2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Họ tên HVCH: NHÓM 1-CAO HỌC SINH LÝ ĐỘNG VẬT K25

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO CHO-DG44 MANG GEN
SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG TÁI TỔ HỢP KHÁNG THỤ THỂ HER2
Chuyên ngành: SINH LÝ ĐỘNG VẬT
Mã số chuyên ngành: 1163009

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016


NỘI DUNG
1. Giới thiệu tổng quan
2. Mục đích nghiên cứu
3. Đối tượng nghiên cứu
4. Các phương pháp nghiên cứu
5. Nội dung và phạm vi của vấn đề nghiên cứu
6. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu
7. Thời gian thực hiện
8. Tài liệu tham khảo


1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

Hình 1: Khối mô ung thư vú

- Ung thư vú: thường gặp

nhất và gây tử vong hàng
đầu ở phụ nữ.
(Theo cơ quan nghiên cứu
Ung thư Thế giới (IARC))
- Thành phố Hồ Chí Minh:
19/100.000 dân (2013).
- Yếu tố di truyền chiếm
khoảng 10-15%.
(Nguồn từ Bệnh viện Ung
bướu Tp.HCM)


1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

HER (Human Epidermal
Receptor): Thụ thể nhân tố tăng
trưởng biểu mô.
Biểu hiện quá mức của HER2
chiếm 10-34% các ca ung thư
vú.

Hình 2: Thụ thể HER và con đường truyền tín hiệu tế bào


1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

Hình 3: Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp


1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

Hình 4: Tác động của Herceptin lên HER2


2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Tạo dòng thành công các tế bào CHO DG44 mang
gen sản xuất kháng thể đơn dòng tái tổ hợp
kháng thụ thể HER2


2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
• Tăng sinh tế bào CHO DG44 in vitro.
• Chuyển gen Herceptin vào tế bào thành công sử dụng phương pháp Liposome.
• Chọn dòng tế bào CHO DG44 chuyển gen thành công bằng Zeocine.
• Tạo dòng tế bào đơn biểu hiện Herceptin tốt nhất.
• Khảo sát đặc tính của tế bào CHO DG44 sau khi chuyển gen.


2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
 ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI
Tạo dòng thành công các tế bào CHO DG44 sản xuất Herceptin:
• Đóng góp cho xã hội
Thành công đầu tiên tại Việt Nam.
Mở ra cơ hội tiếp cận các phương pháp chữa trị ung thư vú.
Giá bán thấp hơn.
• Đóng góp cho ngành học
Thành công trong lĩnh vực sinh học tại Việt Nam.
Tiền đề có tính định hướng cho các nghiên cứu khác (tạo dòng các dòng tế bào ung thư mang gen sản xuất thuốc chữa bệnh có nguồn

gốc từ protein tái tổ hợp).


3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- CHO DG44 - Invitrogen
- Vector pcDNA chứa gene mã hóa cho chuỗi nặng (Hc),
chuỗi nhẹ (Lc) của Herceptin – Invitrogen
- Bộ kit chuyển gen Liposome - Invitrogen.
- Môi trường nuôi cấy cho tế bào CHO DG44 – Sigma
Aldrich


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tăng sinh plasmid chứa Hc và Lc

Tăng sinh tế bào CHO-DG44

Chuyển plasmid vào tế bào DG44

Chọn lọc tế bào bằng Zeocine

Tạo dòng tế bào chứa gen Herceptin

Nuôi cấy tăng sinh và Khảo sát tế bào

Hình 5: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nuôi cấy tế bào

Chuyển gen vào tế bào động vật
Chọn lọc tế bào chuyển gen bằng Zeocine
Nuôi cấy tăng sinh và Khảo sát tế bào


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tế bào
Bảng 1: Khảo sát dụng cụ nuôi cấy ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào

Nghiệm thức

Dụng cụ nuôi

Lần lặp lại

A1

Đĩa 24 giếng

3

A2

Flask T75

3

A3

Chai Duran

3

- Môi trường nuôi cấy: CD DG44 CHO. Nhiệt độ: 37oC. CO2 7%
- Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ tế bào


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 2: Chuyển gen vào tế bào động vật: Liposome
Bảng 2: Khảo sát tỉ lệ gen Hc-Lc trong plasmid chuyển vào tế bào CHO
DG44
Nghiệm thức
Tỉ lệ Hc:Lc
Lần lặp lại

B1

1:3

3

B2

1:5

3

B3

1:10

3

Môi trường nuôi cấy: CD DG44 CHO

Dụng cụ chuyển gen: Đĩa 24 giếng


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm 3: Chọn lọc tế bào chuyển gen bằng Zeocine
Bảng 3: Xác định nồng độ kháng sinh Zeocine chọn dòng CHO đã chuyển gen

Nghiệm thức

Nồng độ Zeocine

Lần lặp lại
3

C1

0 μg/mL
Đối chứng âm (tế bào
CHO chưa chuyển gen)
50 μg/mL

C2

100 μg/mL

3

C3
Môi trường nuôi cấy:CD DG44150
CHOμg/mL

3

C0

Tế bào chọn lọc: Tế bào CHO đã được chuyển gen
Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian tế bào tồn tại sau chuyển gen

3


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm 4: Nuôi cấy tăng sinh và khảo sát tế bào
Bảng 4: Xác định loại môi trường và thể tích thích hợp để nuôi cấy tăng sinh tế bào

Nghiệm thức

Môi trường

Thể tích

Lặp lại

D1

CD DG44 CHO

100 ml

2

D2

CD DG44 CHO

500 ml

2

D3

PowerCHO

100 ml

2

D4

PowerCHO

500 ml

2

Chỉ tiêu theo dõi: số lượng copy tế bào, độ bền sản xuất Herceptin.


5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Chuyển gen Herceptin vào tế bào CHO DG44.
- Khảo sát đặc tính của tế bào CHO DG44 sau khi
chuyển gen Herceptin.


6. NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Phòng nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc –
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM


7. THỜI GIAN THỰC HIỆN
Thời gian dự kiến: tháng 07/2016 đến tháng 07/2017


8. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. A&G Pharmaceutical, CHO stable Cell Line Development.
2. B. Leyland-Jones & A. Rakhit et al. 2001. Pharmacologic insights into the future of trastuzumab. Annals of Oncology 12 (Suppl.
I): S43-S47, 2001.
3. Camire, Joseph. 2000. Chinese Hamster Ovary Cells for the Production of Recombinant Glycoproteins. Art to Science, Vol 19, No.
1; Logan, UT, 2000
4. D. Zhao et al. 2008. Improving Protein Production in CHO Cells. BioPharm June 2008.
5. F. Michael Yakes et al. 2002. Herceptin-induced Inhibition of Phosphatidylinositol-3 Kinase and Akt Is Required for Antibodymediated Effects on p27, Cyclin D1, and Antitumor Action. Cancer Res 2002;62:4132-4141
6. Hao Zeng, Zhe-Sheng Chen, Martin G. Belinsky, et al. 2001. Transport of Methotrexate (MTX) and Folates by Multidrug

Resistance Protein (MRP) 3 and MRP1 : Effect of olyglutamylation on MTX Transport. Cancer Res 2001;61:7225-7232.
7. J. Baselga & J. Albanell. 2001. Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies. Annals of Oncology 12 (Suppl 1): S35S41, 2001.
8. J. Baselga, L. Norton, J. Albanell, et al. 1998. Recombinant Humanized Anti-HER2 Antibody (HerceptinTM) Enhances the
Antitumor Activity of Paclitaxel and Doxorubic against HER2/neu Overexpressing Human Breast Cancer Xenografts. Cancer Res
1998;58:2825-2831.
9. J. Baselga. 2001. Phase I and II clinical trials of trastuzumab. Annals of Oncology 12 (Suppl. 1): S49-S55, 2001
10.P. R. Pohlmann, R. Mernaugh et al. 2009. Resistance to Trastuzumab in Breast Cancer. Clin Cancer Res 2009;15:7479-7491.
11.S. A. Sharbaf et al. 2012. In silico design, contruction and cloning of Tratuzumab humanized monoclonal antibody: A possible
biosimilar for Herceptin. Advanced Biomedical Research/ January – March 2012/ Vol 1/ Issue 1.