Công nghệ sinh học Chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng phương pháp chỉ thị phân tử cho vùng ven biển Đồng bằng sông Hồng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ XUÂN PHƢƠNG
LÊ XUÂN PHƢƠNG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG VEN BIỂN
ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

VEN BIỂN ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ HÙNG LĨNH

Thái Nguyên - 2014
Thái Nguyên - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN


i

ii

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Lê Hùng Lĩnh, sự giúp đỡ của các cán bộ tại Bộ môn Sinh
học phân tử - Viện Di truyền nông nghiệp. Các số liệu, kết quả trong luận văn
là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn
này.

Để hoàn thành luận văn thạc sỹ này, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới
TS. Lê Hùng Lĩnh - Trưởng Bộ môn sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông
Nghiệp, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ
quý báu, nhiệt tình của tập thể cán bộ thuộc:

1. Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp
2. Khoa Khoa học sự sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 9 năm 2014
Tác giả luận văn

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,
đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 9 năm 2014
Lê Xuân Phƣơng

Tác giả luận văn

Lê Xuân Phƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

iii

iv

DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1. Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu của nhiệt độ không khí và

Hình

Tên hình

trang

mực nước biển theo các kịch bản biến đổi khí hậu khác nhau ......................... 9

Hình 1.1. Dự báo sự thay đổi của mực nước biển đến năm 2100 .................... 6

Bảng 2.1. Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1 ................................... 29

Hình 1.2. Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực ........................... 6

Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida..........................35

Hình 1.3. Diễn biến của nhiệt độ (a) và lượng mưa (b) ở Việt Nam ............. 11

Bảng 2.3. Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của mặn ở

trong 50 năm.................................................................................................... 11

giai đoạn mạ (IRRI, 1997) .............................................................................. 37

Hình 1.4. Diễn biến của mực nước biển tại trạm hải văn Hòn Dấu ............... 12

Bảng 3.1. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống ........................... 43

Hình 2.1. Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol ........................... 28

Bảng 3.2.

Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp MABC ………………...……………………33

478 44

Bảng 3.3. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng ............................ 50
Bảng 3.4

3.1.

6 (P1) và

FL478 (P2) ...................................................................................................... 46
2013 tại Giao Thủy, Nam Định................................ 51

Hình 3.2.

Bảng 3.5. Năng suất và các yếu tố cấu tăng năng suất của các dòng tham g
2013..............................................53

1F1 ...................................................................... 47

Hình 3.3.

Bảng 3.6.

1F1 ............................................................................ 48

2014 tại Giao Thủy, Nam Định............................... 55
Bảng 3.7. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các dòng tham gia thí

Hình 3.4.
1F2 ............................................................................ 49

nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định 2014 .......................................................... 57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

TT
1
2
3
4
5
6
7

8
9

Từ viết tắt
ANLT
BĐKH
CNSH
Cs
CTAB
EB
ENSO
FAO
IPCC

10 IRRI
11 MABC
12 MAS
13 NST
14 PCR
15 QTL/QTLs
16 SSR
17
18
19
20

TBE
TE
TGST
WB

v

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

Nội dung
An ninh lương thực
Biến đổi khí hậu
Công nghệ sinh học
Cộng sự
Cetyl trimethyl amonium bromide
Extraction buffer
El Nino Southern Oscillation
Tổ chức lương thực thế giới
Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên
hiệp quốc

Lời cam đoan ................................................................................................................... i

The International Rice Research Institute - Viện Nghiên
cứu lúa quốc tế
Marker assisted backcrossing - Chọn giống hồi giao
nhờ chỉ thị phân tử
Marker assisted selection - Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử
Nhiễm sắc thể
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng trùng hợp chuỗi

1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1

Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng
số lượng
Simple Sequence repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn
giản
Tris - Bric Acid - EDTA
Tris - EDTA
Thời gian sinh trưởng
Ngân hàng thế giới

Lời cám ơn ...................................................................................................................... ii
Danh mục bảng ..............................................................................................................iii
Danh mục hình............................................................................................................... iv
Danh mục các từ viết tắt ................................................................................................. v
Mục lục........................................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................. 2
3. Nội dung Nghiên cứu ................................................................................2
4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ............................................. 4
5.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 4
5.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 4
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 5
1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới và Việt Nam ...................................... 5
1.1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới ........................................................ 5

1.1.2. Ảnh hưởng của BĐKH tại Việt Nam .................................................... 10
1.2. Nghiên cứu di truyền và chọn giống lúa chịu mặn .................................. 13
1.2.1. Cơ sở di truyền tính chống chịu mặn ở cây lúa .................................... 13
1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn .............. 16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

vii

viii

1.2.3. Nghiên cứu lập bản đồ QTL/gen Saltol chịu mặn từ giống lúa Pokkali ... 18

3.2.3. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn

1.2.4. Ứng dụng phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử trong tạo

trong quần thể BC1F2....................................................................................... 48

giống lúa chịu mặn .......................................................................................... 19

3.3. Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn.. 49

1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước ........... 23

3.3.1. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều kiện nhân tạo. . 49

Chƣơng 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 28

3.3.2. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 28

năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ mùa 2013.. 51

2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 30

3.3.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 30

chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ xuân 2014 ........... 55

2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 59

2.4.1. Phương pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen................... 30

1. Kết luận ....................................................................................................... 59

2.4.2. Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) ........... 32

2. Kiến nghị ..................................................................................................... 59

2.4.3. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng .................................................... 34

Tài liệu tham khảo...................................................................................................... 60

2.4.4. Phương pháp thử độ mặn nhân tạo........................................................ 34
2.4.5. Phương pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị phân tử ... 37
Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 43
3.1. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọi tạo giống
lúa chịu mặn .................................................................................................... 43
3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong điều kiện
nhân tạo ........................................................................................................... 43
ịnh vật liệu bố mẹ

3.1.2. Kết quả

.......................................................................................... 44
3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai TL6/FL478 ............... 45
ữa FL478 và TL6 . 45

3.2.1. Kết quả kiể

ử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen
chịu mặn trong quần thể BC1F1. ...................................................................... 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

1

2
giống bằng MAS sẽ giảm được giá thành và thời gian. Chọn giống nhờ chỉ thị

MỞ ĐẦU
1.

phân tử là kỹ thuật hiệu quả cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá

Tính cấp thiết của đề tài
Biến đổi khí hậu (BĐKH) là một trong những thách thức lớn nhất đối

với nhân loại trong thế kỷ 21. BĐKH dẫn đến nhiều thay đổi bất thường của
thời tiết, tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường. BĐKH

thể trong quần thể. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể sử dụng chỉ thị để
kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ và các cá thể con lai. Từ đó có thể kiểm
soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể.

còn làm tăng tính biến động và tính cực đoan của các hiện tượng thời tiết

Bằng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker

nguy hiểm như bão, tố, lốc, các thiên tai thời tiết khô nóng, lũ, ngập úng, hay

assisted backcrossing - MABC), các nhà chọn giống các nước pháp triển trên

hạn hán, rét hại, xâm nhập mặn, sâu bệnh, làm ảnh hưởng rất lớn đến sản xuất

thế giới đã thành công mang lại kết quả trong việc tạo ra các giống lúa vừa có

nông nghiệp. Hậu quả của BĐKH đối với Việt Nam là nghiêm trọng và là

năng suất cao, vừa có khả năng chống chịu với các điều kiện phi sinh học bất

một nguy cơ hiện hữu cho mục tiêu xoá đói giảm nghèo, cho việc thực hiện

lợi như ngập chìm, mặn và chống chịu sâu bệnh. Những giống lúa này có thể

các mục tiêu thiên niên kỷ và sự phát triển bền vững của đất nước.

giúp cho các vùng bờ biển giảm bớt thiệt hại do ảnh hưởng của biến đổi khí

Cây lúa là cây trồng quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời cũng là
nguồn thức ăn quan trọng nhất cho một nửa dân số thế giới. Việt Nam là
nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan. Lúa gạo là
nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và
cũng là nguồn thức ăn chính của 86 triệu dân số trong nước. Đồng bằng Sông
Hồng và đồng bằng sông Cửu Long có sản lượng gạo lần lượt là 17% và 50%

hậu [21], [22]. Từ những vấn đề nêu trên, việc ứng dụng công nghệ chọn
giống nhờ chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa có năng suất cao, có khả năng
chống chịu mặn là một vấn đề cấp thiết. Vì vậy chúng tôi xây dựng đề tài:
“Chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng phương pháp chỉ thị phân tử cho vùng
ven biển Đồng bằng sông Hồng”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

[5]. Đáp ứng sản lượng lúa ở Việt Nam là rất cần thiết cho ứng phó với điều

Sử dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử chọn tạo giống lúa

kiện biến đổi khí hậu. Do vậy, chọn tạo giống lúa năng suất cao chống chịu

chịu mặn đáp ứng nhu cầu giống lúa cho vùng ven biển Đồng bằng Sông

mặn là hết sức cần thiết và có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu

Hồng ứng phó với tác động biến đổi khí hậu.

nhập của nông dân tại vùng chịu ảnh hưởng của biến đổi khí hậu.

3.

Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là
phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính
trạng di truyền số lượng (Quantitative Trait Loci - QTL) hay gen đích vào

Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống

lúa chịu mặn
- Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol.

giống mới. Phương pháp MAS cho phép rút ngắn quá trình chọn lọc, chọn lọc
được những tính trạng khó và đắt tiền hay nhiều gen cùng một lúc. Chọn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

3

4

- Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn được chọn tạo bằng

5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn

5.1. Đối tƣợng nghiên cứu

triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất.

- Giống lúa FL478 là thuần mang QTL/Saltol (gen chịu mặn) được nhập
từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (The International Rice Research Institute IRRI).

4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống
lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn ở các thế
hệ chọn tạo giống, nhờ vậy có thể rút ngắn thời gian chọn lọc trên đồng
ruộng, giảm số lượng cá thể gieo trồng hàng vụ, giảm diện tích gieo trồng,

- Giống TL6 Là giống lúa chịu thâm canh khá, chống chịu tốt với một số
sâu bệnh hại chính như: bệnh Đạo ôn, khô vằn và bạc lá. Phẩm chất gạo
ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy được 2 vụ trong năm, có
tiềm năng cho năng suất cao.
- Các chỉ thị phân tử có liên quan được sử dụng trong nghiên cứu.

giảm lao động nặng nhọc, giảm chi phí cho những thí nghiệm đồng ruộng

5.2. Phạm vi nghiên cứu

góp phần tăng đầu tư cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách chuẩn

Thí nghiệm được triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc
Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Huyện Giao Thuỷ, Nam
Định.

mực.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Những thành công bước đầu trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn

Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2014.

lọc các cá thể lai sẽ mở ra hướng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo
giống nói chung, không chỉ với đặc tính chịu mặn mà còn đối với nhiều đặc
tính nông sinh học quý khác.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ chọn tạo ra một số dòng/giống lúa chịu
mặn cho các vùng ven biển Đồng bằng Sông Hồng nơi chịu ảnh hưởng nặng
nề của biến đối khí hậu.
- Bổ sung thêm cơ sở lý luận trong công tác chọn tạo giống lúa bằng chỉ
thị phân tử nhưng vẫn kế thừa các phương pháp chọn giống truyền thống.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

5

6

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình của BĐKH trên Thế giới
Biến đổi khí hậu là do các hoạt động trực tiếp và gián tiếp của con
người gây ra, nó làm thay đổi các thành phần trong khí quyển toàn cầu.
BĐKH đã và đang gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến cuộc sống của con
người trên mọi lĩnh vực, cả về môi trường và kinh tế-xã hội. Trong 150 năm
qua, nhiệt độ bình quân bề mặt trái đất giai đoạn 1900-2005 tăng khoảng 0,80
C; nhiệt độ đại dương tăng 0,50 C nhiệt độ bình quân bề mặt toàn cầu đã tăng
0,760C [20]. Sự nóng lên toàn cầu đã gây nên khí hậu thay đổi nhiều hơn, như
những biến đổi của mưa và gia tăng tần suất, cường độ và tính biến động và

Hình 1.1. Dự báo sự thay đổi của mực nước biển đến năm 2100
(Nguồn: IPCC, 2007) [20]

tính cực đoan của các hiện tượng thời tiết nguy hiểm như bão, lốc, các thiên
tai liên quan đến nhiệt độ và mưa như thời tiết khô nóng, lũ, ngập lụt, hạn

hán, rét hại, xâm nhập mặn, dịch bệnh và dẫn đến mực nước biển bình quân
toàn cầu dâng cao.
Theo các nhà khoa học về BĐKH toàn cầu và nước biển dâng cho thấy,
đại dương đã nóng lên đáng kể từ cuối thập kỷ 1950. Các nghiên cứu từ số
liệu quan trắc trên toàn cầu cho thấy, mực nước biển trung bình toàn cầu
trong thời kỳ 1961-2003 đã dâng với tốc độ 0,5 - 1,8mm/năm [20]. Dự báo sự
thay đổi của mực nước biển và diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu đến năm
2100 thể hiện ở hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.2. Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực
(Nguồn: IPCC AR4 WG-I Report, 2007) [20]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

7

8

Các từ viết tắt:

của các nhà khoa học, trong thập kỷ vừa qua, mực nước biển dâng nhanh nhất

- CCSR/NIES: Trung tâm nghiên cứu hệ thống khí hậu và Viện nghiên

ở vùng phía Tây Thái Bình Dương và phía Đông Ấn Độ Dương [20].

cứu môi trường Quốc gia; Sử dụng mô hình CCSR/NIES AGCM + CCSR

BĐKH đã ảnh hưởng trực tiếp đến ngành nông nghiệp, đây là ngành
cung cấp lương thực chính cho con người đang phải đứng trước thách thức vô

OGCM Models 1890-2100.
- CCCma: Trung tâm phân tích và xây dựng mô hình khí hậu Canada.

cùng to lớn, những khu vực tập trung trồng lúa nhiều nhất trên thế giới lại có
nguy cơ bị xâm nhiễm mặn khi mực nước biển dâng cao. Do đó, cần phải có

Sử dụng mô hình CGCm2 Model 1900-2100
- CSIRO: Tổ chức nghiên cứu công nghiệp và khoa học về sức khỏe. Sử

các giống lúa có khả năng chịu được ngập và độ mặn cao.
Bên cạnh đó, theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên

dụng mô hình CSIRO-Mk2 model 1961-2100.
- Hadley Centre: Trung tâm nghiên cứu và dự báo khí hậu Hadley. Sử
dụng mô hình HADCM3 model 1950-2099.

toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích
tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhiễm mặn theo mức
độ khác nhau. Mặt khác, tài liệu “Tác động của mực nước biển dâng cao đến

- GFDL: Phòng nghiên cứu biến động các chất lỏng theo địa vật lý. Sử
dụng mô hình R30 Model 1961-2100.

các nước đang phát triển: Phân tích so sánh” của Ngân hàng Thế giới (WB)

thực hiện tháng 2/2007 đã đánh giá các tác động của mực nước biển dâng cao

- MPI-M: Viện khí tượng Max Planck. Sử dụng mô hình

đối với tất cả các nước đang phát triển bằng cách sử dụng bộ chỉ số đồng nhất
các chỉ thị và với các kịch bản khác nhau về mực nước biển dâng cao. WB đã

ECHAM4/OPYC coupled model 1990-2100.
- NCAR PCM: Trung tâm nghiên cứu khí quyển Quốc gia Mỹ. Sử dụng

chia 84 nước đang phát triển ở ven biển thành 5 nhóm theo 5 văn phòng khu
vực của WB gồm: Mỹ Latin và Caribê (25 nước); Trung Đông và Bắc Phi (13

mô hình PCM model 1980-2099.
- NCAR CSM: Trung tâm cứu khí quyển Quốc gia Mỹ. Sử dụng mô
hình CSM Model 2000-2099.

nước); Châu Phi cận Xahara (29 nước); Đông Á (13 nước); và Nam Á (4
nước). Các kết quả nghiên cứu cho thấy 0,31% (194.309 km2) vùng lãnh thổ
của 84 nước đang phát triển bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m.

Tuy nhiên, mực nước biển thay đổi không đồng đều trên toàn bộ đại

Tỷ lệ bị ngập có thể tăng lên 1,2% theo kịch bản nước biển dâng cao 5m. Cho

dương thế giới: Một số vùng tốc độ dâng có thể gấp một vài lần tốc độ dâng

dù tỷ lệ này nhỏ song sẽ có khoảng 56 triệu người (hay 1,28% dân số) ở 84

trung bình toàn cầu trong khi mực nước biển ở một số vùng khác lại có thể hạ

nước đang phát triển bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m. Với kịch

thấp. Xu thế tăng của mực nước trung bình xuất hiện hầu hết tại các trạm

bản nước biển dâng cao 1m, Bahamas (khu vực Mỹ latinh và Caribê) là nước

quan trắc trên toàn cầu, mặc dù, vẫn xuất hiện một số khu vực có xu hướng

bị ảnh hưởng nặng nhất xét về diện tích bị ảnh hưởng (12% tổng diện tích).

giảm như ở bờ biển phía Đông của Nam Mỹ và khu vực ven biển phía Nam

Việt Nam đứng đầu danh sách 10 nước bị ảnh hưởng về dân số, khu vực đô

Alaska và Đông Bắc Canada, vùng biển Scandinavia. Theo một số báo cáo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

9

10

thị và đất ngập nước (khoảng 10%). Nông nghiệp của Ai Cập bị ảnh hưởng

Ghi chú:

nhiều nhất, gần 13%. 28% diện tích đất ngập nước của Việt Nam, Jamaica và

- a: Sự đánh giá này được đánh giá từ một hệ thống mô hình, bao gồm

Belize có thể bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m. Xét về tất cả các

một mô hình khí hậu đơn giản, một số mô hình Trái đất có mức tạp vừa phải

chỉ thị, theo Báo cáo của WB, Việt Nam nằm trong danh sách 5 nước bị ảnh

và số lớn mô hình hoàn lưu toàn cầu khí quyển – đại dương (AOGCMs).

hưởng nhiều nhất cùng với Ai Cập, Suriname và Bahamas [14].

- b: Hàm lượng khí nhà kính (KNK) cố định năm 2000 được lấy từ

Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu của nhiệt độ không khí và
mực nước biển theo các kịch bản biến đổi khí hậu khác nhau được thể hiện ở
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu của nhiệt độ không
khí và mực nước biển theo các kịch bản biến đổi khí hậu khác nhau
(Nguồn: IPCC 2007) [20]
Biến đổi của nhiệt độ (0C)
(Giai đoạn 2090 – 2099 so với giai
đoạn 1980-1999)a

Mức dâng cao của
mục nước biển(m)

(Giai đoạn 2090 –
2099 so với giai
đoạn 1980 – 1999)

Đánh giá tốt nhất

Phạm vi có thể
xảy ra

Phạm vi mô hình cơ
sở ngoai trừ sự biến
đổi động lực của
dòng chảy băng
trong tương lai

Hàm lượng KNK không đổi ở
mức năm 2000b

0,6

0,3 - 0,9

-

Kịch bản B1

1,8

1,1 – 2,9

0,18 – 0,38

Kịch bản A1T

2,4

1,4 – 3,8

0,20 – 0,45

Kịch bản B2

2,4

1,4 – 3,8

0,20 – 0,43

Kịch bản A1B

2,8

1,7 – 4,4

0,21 – 0,48

Kịch bản A2

3,4

2,0 – 5,4

0,23 – 0,51

Kịch bản A1F1

4,0

2,4 – 6,4

0,26 – 0,59

Trường hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

AOGCMs.
1.1.2. Ảnh hƣởng của BĐKH tại Việt Nam
Cũng như các nước khác trên thế giới, khí hậu đã, đang và sẽ biến đổi
trên lãnh thổ Việt Nam. Kết quả phân tích các số liệu khí hậu cho thấy những
biến đổi chủ yếu của các yếu tố khí hậu và mực nước biển như sau:
- Nhiệt độ: Trong 50 năm qua (1958 - 2007), nhiệt độ trung bình năm ở
Việt Nam tăng lên khoảng từ 0,50C đến 0,70C. Nhiệt độ mùa đông tăng nhanh
hơn nhiệt độ mùa hè và nhiệt độ ở các vùng khí hậu phía Bắc tăng nhanh hơn
ở các vùng khí hậu phía Nam (hình1.3a). Nhiệt độ trung bình năm của 4 thập
kỷ gần đây (1961 - 2000) cao hơn trung bình năm của 3 thập kỷ trước đó
(1931 - 1960). Nhiệt độ trung bình năm của thập kỷ 1991 - 2000 ở Hà Nội,
Đà Nẵng, thành phố Hồ Chí Minh đều cao hơn trung bình của thập kỷ 1931 1940 lần lượt là 0,8; 0,4 và 0,60C. Năm 2007, nhiệt độ trung bình năm ở cả 3
nơi trên đều cao hơn trung bình của thập kỷ 1931 - 1940 là 0,8 - 1,30C và cao

/>
hơn thập kỷ 1991 - 2000 là 0,4 - 0,50C.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

11

12
- Mực nước biển: Số liệu quan trắc tại các trạm hải văn dọc ven biển
Việt Nam cho thấy tốc độ dâng lên của mực nước biển trung bình ở Việt Nam
hiện nay là khoảng 3mm/năm (giai đoạn 1993 - 2008), tương đương với tốc
độ tăng trung bình trên thế giới. Trong khoảng 50 năm qua, mực nước biển
tại trạm hải văn Hòn Dấu dâng lên khoảng 20cm. (hình 1.4).

Hình 1.3. Diễn biến của nhiệt độ (a) và lượng mưa (b) ở Việt Nam
trong 50 năm
- Lượng mưa: Trên từng địa điểm, xu thế biến đổi của lượng mưa trung
bình năm trong 9 thập kỷ vừa qua (1911 - 2000) không rõ rệt theo các thời kỳ
và trên các vùng khác nhau: có giai đoạn tăng lên và có giai đoạn giảm
xuống. Lượng mưa năm giảm ở các vùng khí hậu phía Bắc và tăng ở các
vùng khí hậu phía Nam (hình 1.3b). Tính trung bình trong cả nước, lượng
mưa năm trong 50 năm qua (1958 - 2007) đã giảm khoảng 2%.
- Tần suất và cường độ El Nino tăng lên rõ rệt trong những thập niên
gần đây. Trong 5 thập niên gần đây, tác động của hiện tượng ENSO ngày
càng mạnh mẽ đối với chế độ thời tiết và khí hậu trên nhiều khu vực ở Việt
Nam. Biến đổi của ENSO và tác động của nó đến sự biến đổi của gió mừa sẽ
ảnh hưởng mạnh hơn đối với sự biến đổi của mưa. Hiện tượng ENSO cũng
ảnh hưởng đến sự thay đổi sự xuất hiện, cường độ và các đặc trưng của xoáy

thuận nhiệt đới và sự biến đổi của nó giữa các năm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Hình 1.4. Diễn biến của mực nước biển tại trạm hải văn Hòn Dấu [20]
Mực nước biển dâng cao dẫn đến mặn xâm nhập sâu vào hệ thống
sông ngòi, kênh rạch và tầng chứa nước ngầm ở đồng bằng châu thổ sông
Hồng – Thái Bình, Đồng bằng sông Cửu Long và đồng bằng ven biển miền
Trung, làm cho nước nhạt (nước ngọt) bị nhiễm mặn và do đó làm giảm
lượng nước nhạt có thể khai thác, sử dụng. Theo kết quả các kịch bản biến
đổi khí hậu đã được đưa ra, nếu mực nước biển có thể dâng cao 0,75 – 1 m
so với thời kỳ 1980 – 1999, thì khoảng 20 – 38% diện tích Đồng bằng sông
Cửu Long và đồng bằng sông Hồng bị ngập, là hai vùng sản xuất lúa chính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

13

14

của Việt Nam và do đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lương thực để

đây là dạng gây stress quan trọng đối với sản xuất lúa, và đặt ra mục tiêu

cung cấp cho hơn 86 triệu dân Việt Nam và gần 100 triệu dân trên thế giới.

hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu. Xác định gen chống

2

Việt Nam có bờ biển dài khoảng 3260 km, hơn một triệu km lãnh hải và

chịu mặn là trọng tâm quan trọng trong chọn giống lúa, nó có những khó

trên 3000 hòn đảo gần bờ và hai quần đảo xa bờ là Hoàng Sa và Trường Sa,

khăn nhất định mà nhà chọn giống phải đối mặt như: Nguồn gen kháng khan

nhiều vùng đất thấp ven biển. Nước biển dâng cùng với nước dâng do bão,

hiếm, tính trạng chống chịu mặn là tính trạng di truyền số lượng (Quantitative

sóng lớn, triều cường ảnh hưởng lớn đến hạ tầng cơ sở (hệ thống đê biển,

trait loci), cơ chế chống chịu mặn phức tạp, và rất khó để đánh giá chính xác

bờ bao, giao thông, du lịch, công trình dân sinh và quốc phòng…) vùng ven

những tính trạng sinh lý liên quan đến khả năng chịu mặn. Có một số phương

bờ biển và những vùng đất thấp nằm dọc theo bờ biển. Nước biển dâng

pháp chọn giống chống chịu mặn được các nhà chọn giống thường xuyên áp

cũng sẽ tác động đến các đầm phá, vũng vinh, đảo nhỏ, các cồn cát và bãi

dụng như, cải tạo các giống lúa địa phương có khả năng chống chịu mặn bằng

tắm, các bãi phù sa, đánh bắt và nuôi trồng thủy sản.

cách gây đột biến hay lai tạo rồi chọn lọc theo phương pháp truyền thống. Sử

Ở Việt Nam là một trong 5 nước trên thế giới được đánh giá là sẽ chịu

dụng công nghệ sinh học bằng cách tạo mô sẹo (callus) từ phôi hay nuôi cấy

ảnh hưởng nghiêm trọng của BĐKH và nước biển dâng. Trong đó, đồng bằng

bao phấn, sàng lọc và tái sinh cây trong môi trường bổ xung hàm lượng NaCl

châu thổ sông Hồng và sông Cửu Long là hai vùng chịu tác động BĐKH và

với nồng độ khác nhau, hay chuyển gen chịu mặn vào giống có tiềm năng

nước biển dâng nhiều nhất. Đây là hai vùng sản xuất nông nghiệp chính của

năng suất nhưng mẫn cảm với mặn. Biện pháp chọn tạo giống lúa chống chịu

Việt Nam nhưng địa hình thấp, phần lớn chỉ cao hơn 1 m so với mực nước

mặn nhờ chỉ thị phân tử (MAS) tỏ ra là phương pháp hiệu quả, chính xác đã

biển, thậm chí có nơi thấp dưới mực nước biển. Theo kết quả các kịch bản

được các nhà chọn giống sự dụng trong những năm gần đây trên thế giới.

biến đổi khí hậu đã được đưa ra, nếu mực nước biển có thể dâng cao 0,75

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh yếu tố di truyền tính chống chịu

đến1m so với thời kỳ 1980 – 1999, thì khoảng 20 – 38% diện tích Đồng bằng

mặn biến động khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa

sông Cửu Long và đồng bằng sông Hồng bị ngập và do đó ảnh hưởng nghiêm

chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính

trọng đến sản xuất lương thực để cung cấp cho hơn 86 triệu dân Việt Nam và

chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không

gần 100 triệu dân trên thế giới.

đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng

1.2. Nghiên cứu di truyền và chọn giống lúa chịu mặn
1.2.1. Cơ sở di truyền tính chống chịu mặn ở cây lúa
Lúa (Oryza sativa L.) là cây rất nhậy cảm với những yếu tố gây stress
phi sinh học như mặn, khô hạn, nhiệt độ... Đất mặn là yếu tố chính làm giảm
năng suất, sản lượng của lúa. Người ta tập trung sự chú ý vào đối tượng mặn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính
và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn

[19], [25].
Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn tại giai đoạn mạ
của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

15

16

(EC = 12 dSm-1) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh;

lượng bông và số hạt chắc trên bông [29]. Narayanan và cs., (1990) cho rằng,

người ta thấy, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi,

số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng

khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa

suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn[32].

giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do
hoạt động của nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua
các tính trạng này rất thấp [38]. Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa tính
trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện mặn được điều khiển bởi
những gen cộng tính [28].

1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho công
tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới
triển khai rộng rãi. Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm soát các
tính trạng khác nhau đã được xác định và ứng dụng trong chọn giống. Đi tiên

Do ảnh hưởng lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là

phong trong lĩnh vực này là các nhà khoa học ở Trường Đại học tổng hợp

rất thấp trong các tính trạng. Phương pháp chọn giống chống chịu mặn có thể

Cornel (Mỹ), đã thiết lập lên bản đồ di truyền phân tử đầu tiên ở lúa. Đến

dùng phương pháp trồng dồn có cải tiến hoặc có thể dùng phương pháp chọn

nay, hàng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã được xác định,

lọc cá thể (single seed descent) sẽ là thích hợp trong chọn giống chịu mặn.

trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng. Với

Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ, Gregorio và Senadhina (1993) cho rằng,

việc sử dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền, hàng nghìn QTLs đã

có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai. Nghiên

được phát hiện cho các tính trạng khác nhau ở cây lúa như chịu hạn, chịu

cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6,

mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang

năng suất thể hiện hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong

chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng... Phân tích,

điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn.

lập bản đồ di truyền phân tử đã được thiết lập rất phổ biến bằng việc sử dụng

Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Trong một số giống lúa, ưu

quần thể phân ly F2 hay dòng cập phối (RIL) từ tổ hợp lai xa về di truyền như

thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho

giữa hai loài phụ Indica và Japonica, thế hệ tái tổ hợp thu được nhiều đa hình

chọn lọc giống trong môi trường mặn [19].

hơn là trong cùng loài phụ. Như vậy đối với tính chịu mặn, việc phân tích các

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs, (1996) cho rằng,

tính trạng phức tạp liên quan đến tính chịu mặn có nghĩa là việc hiểu rõ bản

chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi

đồ gen QTLs sẽ cung cấp thông tin hữu ích cho việc làm tăng tính chịu mặn

trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này là

cho lúa. Các phân tích QTL về tính chịu mặn của lúa đã được tiến hành bằng

không có hiệu quả. Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có

các chỉ thị phân tử trong nhiều nhóm nghiên cứu. Nhiều bản đồ di truyền

hệ số path rất cao trong môi trường mặn. Chính ba tính trạng này đóng góp

phân tử đã được thiết kế với việc sử dụng quần thể F 2 hoặc tái tổ hợp [31],

phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn, nhất là khối

[40], [41], [42], hoặc quần thể cây đơn bội kép [27], [43].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

17

18

Năm 2000, Prasad và cs đã xác định được bẩy QTL cho tính trạng cây mạ

liên quan với khả năng chống chịu mặn trên các nhiễm sắc thể khác nhau.

1.2.3. Nghiên cứu lập bản đồ QTL/gen Saltol chịu mặn từ giống lúa
Pokkali

Zhang và cs (1995) đã phát hiện QTLs cho trọng lượng 1000 hạt trên nhiễm

Giống Pokali là giống lúa chịu mặn điển hình, Pokali đã và đang được

sắc thể số 7 bằng cách sử dụng quần thể F2 dưới điều kiện có NaCl. Năm

các nhà chọn giống trên thế giới chọn là giống cho gen chịu mặn trong

2000, Prasad và cs đã xác định được QTLs cho các tính trạng của cây giống

chương trình chọn giống của mình. Những nghiên cứu đã xác định được rõ

như sự nảy mầm của hạt, chiều dài rễ, trọng lượng khô và sức sống của cây

những đặc điểm sinh thái học cũng như mức độ phân tử về khả năng chịu

con dưới tác động của muối (salt stress) bằng cách sử dụng một quần thể đơn

mặn của giống Pokali. Khả năng chịu mặn được thể hiện ở cả hai khả năng là

bội kép xuất phát từ lai giữa các giống Indica và Japonica. Năm 2001,

duy trì thấp tỷ lệ Na+/K+ ở chồi và phát triển nhanh trong điều kiện mặn [23].

+

+

+

Koyama và cs đã phát hiện ra QTLs cho việc thu nhận Na , K và tỷ lệ Na :
K+ trong chồi non. Tương tự như vậy Lin và cs (2004) đã công bố một số
QTLs cho các tính trạng lý sinh như thu nhận Na+, K+ và tỷ lệ Na+ : K+ trong
rễ và chồi bằng cách sử dụng quần thể F2, F3 bắt nguồn từ việc lai chéo giữa
hai giống Koshihikari và Nona Bokra. Những nghiên cứu trước đây về tính
chịu mặn của lúa cũng đã được thực hiện bằng cách sử dụng các quần thể F 2,

Gegorio và cs (2002) đã xác định QTL chính, tên là Saltol trên nhiễm sắc
thể số 1 tại vị trí giữa hai SSR marker RM23 và RM140 từ quần thể lai giữa
giống chịu mặn điển hình Pokkali và giống IR29. QTL Saltol có độ dài
khoảng 1cM quyết định tới khoảng 40 – 65% tính chống chịu mặn của lúa.
Giống Pokkali là giống mang alleles trội với khả năng chịu mặn. [18]

RILs hoặc DH. Prasad và cs, (2000) đã lập bản đồ một số QTL liên kết khả

Mohammadi – Nejad và cs., (2008) đã lập bản đồ chi tiết cho QTL chịu

năng chịu mặn ở giai đoạn mạ trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Sử dụng

mặn Saltol bằng những chỉ thị phân tử vệ tinh SSR trên nhiễm sắc thể số 1. 6

quần thể F2 từ giống lúa Japonica chịu mặn và giống lúa thường nhiễm mặn

marker là: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140 liên

77-170A. Zhang và cs (1995) đã xác định được gen chịu mặn chính nằm trên

kết chặt với đoạn Saltol ở vị trí 10.8 đến 12.28 Mb. Xác định lập bản đồ QTL

nhiễm sắc thể số 1. Lin và cs (2004), Ren và cs (2005) cùng xác định QTL

Saltol chịu mặn đã được một số nhà khoa học Viện nghiên cứu lúa quốc tế

liên kết với khả năng chịu mặn trên nhiễm sắc thể số 1 [24], [26], [34], [35],

IRRI nghiên cứu và khẳng định lại khả năng chịu mặn của Saltol.
Michael J. Thomson và cs (2010) đã sử dụng 140 dòng tái tổ hợp (RILs)

[36], [44].
Tính chịu mặn của lúa có thể phụ thuộc vào các chất vận chuyển chất

từ tổ hợp lai giữa IR29/Pokkali xác định lại Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 và

truyền vận K+ ái lực cao, những chất này làm trung gian cho chất vận chuyển

xác định thêm một số QTL chịu mặn khác. Kết quả đã xác định được 2 QTL

chuyên biệt Na hoặc chất truyền vận Na - K và giữ một vai trò quan trọng

chịu mặn, một trên nhiễm sắc thể số 4 và một trên nhiễm sắc thể số 9. QTL

trong điều hoà sự ổn định Na+ [30].

cho tỷ lệ Na+/K+ được xác định trên nhiễm sắc thế số 6. Bản đồ chi tiết cho

+

+

+

QTL saltol cũng được tác giả xác định liên kết với những chỉ thị phân tử SSR
trên nhiễm sắc thể 1 [39].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

19

20

1.2.4. Ứng dụng phƣơng pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử

phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các
chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng

trong tạo giống lúa chịu mặn
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết

trong nhiều tổ hợp lai.

với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương

e. Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc

tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá

đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với

kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong

chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.

muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình

Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương

thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng

tiện hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục

không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại

những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết. Sự

càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống

phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống

gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử,

khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi

các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống

những cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự

nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection = MAS) với ý đồ sử dụng các

có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc

chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới.

hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình. Phương pháp này còn có thể giúp ta

So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:

chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu

a. Kiểu gen của các lôcút chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất

do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác

kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: Tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể,

này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình. Phương

trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt

pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí

được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể.

đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một genôm đích.

b. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các
chương trình chọn giống với các ưu điểm sau:

chỉ thị hình thái rất hạn chế.
c. Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi

hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi

nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai

kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.

đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn

d. Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản
ứng chu kỳ quang).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

21

22

- Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này

truyền đạt 99.6 - 100% hệ gen của cây nhận gen. Từ đó có thể thấy rằng đây

khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối

là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển lôcut gen quy định tính

với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng

trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống đồng thời rút ngắn quá

những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc).

trình chọn lọc.

- Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều
lôcut trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau.

Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại có ba bước
sau:

- Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do

* Bước thứ nhất: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay

vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa

gen đích để chọn lọc trực tiếp lôcut hay gen tính trạng đó từ các cá thể trong

vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này,

quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2.

các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng

* Bước thứ hai: Sử dụng chỉ thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn

thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất

lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu các locus gen không mong

khó đạt được kết quả, nếu không muốn nói là không thể được. Nhưng nếu ta

muốn quang vùng gen đích. Bước này còn gọi là chọn lọc tái tổ hợp

áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử, ta có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt

(recombinant selection).

của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt.

* Bước thứ ba: Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, không liên kết với gen

Phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) là sử dụng chỉ

đích trên 12 nhiễm sắc thể để chọn lọc cá thể có nền di truyền lớn nhất của

thị phân tử liên kết chặt với lôcut gen đích để xác định các cá thể mang gen

giống nhận gen. Bằng phương pháp này có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể

trong quần thể phân ly thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình. Bằng phương

3 thậm chí là 4 thế hệ lai lại so với chọn lọc lai lại truyền thống.

pháp này cho phép tạo được giống mới mang một hay một vài tính trạng
mong muốn một cách nhanh chóng và chính xác. Nhược điểm của phương
pháp MAS là giống mới được tạo ra không còn giữ được đặc tính quý của
giống ban đầu. Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại
(MABC) có thể khắc phục được nhược điểm này. Với mục tiêu chuyển một
tính trạng đặc biệt vào một giống cây trồng. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử
và lai trở lại là phát triển tiềm năng của lai trở lại trong nghiên cứu và du
nhập gen đích vào giống nhận gen. Bằng phương pháp này, chỉ cần chọn lọc

Những năm gần đây, IRRI đã sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ
thị phân tử và lai trở lại (MABC) và đã thành công trong việc chọn tạo giống
lúa chịu mặn bằng việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên
nhiễm sắc thể số 1 vào ba giống lúa trồng đại trà. Kết quả đã tạo được một số
dòng

triển

vọng

như:

IR72046-B-R-8-3-1-3,

IR77674-3B-8-2-2-8-3-AJY5,

IR52713-2B-8-2B-1-2,

IR45427-2B-2-2B-1-1,

IR55179-3B-11-3,

IR64197-3B-3-1, IR74099-3R-3-3, IR66946-3R-178-1-1 (FL478).

đến thế hệ BC3 thì có thể chọn lọc được cá thể mang gen đích và có nền di

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

23

24

Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC)

tác động của sự biến đổi khí hậu. Theo báo cáo về chỉ số rủi ro khí hậu toàn

chuyển gen chịu mặn vào giống lúa trồng đại trà trong sản xuất, với phương

cầu năm 2010 do tổ chức Germanwatch công bố tại Đan Mạch thì Việt Nam

pháp này chỉ mất ba năm trong khi phương pháp truyền thống có thể tới 10

là một trong 10 quốc gia bị thiệt hại nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra;

đến 15 năm [12]. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là kỹ thuật hiệu quả, rút

các quốc gia khác đó là: Bangladesh, Myanma, Honduras, Nicaragoa, Haiti,

ngắn thời gian và rẻ tiền so với phương pháp chọn giống truyền thống. Bởi

Ấn Độ, Cộng hòa Đôminica, Philippines và Trung Quốc. Theo kết quả

vì, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của

nghiên cứu và dự báo của Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên

từng cá thể trong quần thể. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể sử dụng

hiệp quốc (IPPC) và Ngân hàng Thế giới thì trong vòng 100 năm tới, nước

một lượng lớn chỉ thị để kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ. Từ đó có thể

biển sẽ dâng 1m, nhiệt độ sẽ tăng thêm 2 0C. Nếu nước biển dâng cao 1m thì

kiểm soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể. Kiểm tra theo

vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ có 1,5 -2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập

phương pháp đó kết hợp lai trở lại 2 đến 3 thế hệ là có thể thu được cá thể với

nước; còn ở vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có 1.668 km2 đất bị ngập, trong

nền di truyền của dòng mẹ và mang gen chuyển. Các dòng này có thể cho tự

đó có khoảng 0,3-0,5 triệu ha đất chủ yếu là đất lúa bị ngập. Sự biến đổi khí

thụ, thu hạt để làm thí nghiệm thử nghiêm trên đồng ruộng.

hậu ở nước ta cũng làm gia tăng thiên tai khiến năng suất cây trồng giảm, ước

1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nƣớc

tính nếu tăng thêm 10C thì năng suất lúa giảm 10% [20].

Việt Nam có đường bờ biển 3.620 km nằm trải dài từ Bắc vào Nam, hiện

Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu

tượng xâm thực của nước biển ngày càng trở lên nghiêm trọng làm ảnh

tốt với mức nhiễm mặn cao sẽ là giải pháp để khắc phục các hiện tượng trên.

hưởng đến năng suất cây trồng nông nghiệp đặc biệt là cây lúa, một cây trồng

Các biện pháp như xây dựng công trình thủy lợi bao đê ngăn mặn, hay bón

chủ đạo trong nền nông nghiệp của nước ta. Gần đây, phong trào nuôi tôm

các loại phân hữu cơ vào đất (bón vôi, thạch cao để cải thiện cấu trúc đất, cày

nước mặn kết hợp trồn

sâu cải thiện tính thoát nước tốt nhằm giảm đóng váng trên mặt đất) thường
tốn kém và hiệu quả không cao.
0,3-0,4% thậm chí có nơi cao hơn cả chục lần.

Nhiều giống lúa chống chịu mặn như OM732, OM861,OM1314, OM

Theo báo cáo của Cục Thủy lợi - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

1490, OM2031, OM1314, OM576, IR42, OM344, OM924, Trắng Điệp,
Móng Chim Rơi, Móng Chim, Nếp Áo Già, Nếp Bờ Giếng, Nàng Quốc Đỏ,

bằng sông Hồng lên cao và xâm nhập vào trong nội địa từ 30 - 40km làm cho

Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, TD2, CM1, CM5 M6, MT6,

diện tích nhiễm mặn lên tới 100.000ha ở một số tỉnh: Hải Phòng, Nam Định,

MT163, BM9855, BM9820, BM9830.v.v. đã được triển khai ở vùng đồng

Ninh Bình, Thanh Hoá.

bằng Sông Cửu Long và Sông Hồng [2], [3], [9], [8].

Hơn nữa nghề trồng lúa ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặt với những

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

25

26
Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải
tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây
đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các

: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân

giống lúa CM1, CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được

Hương, Tam Sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nàng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng

những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao

Co đỏ, Bảy Dảnh, Một Bụi. Giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan cho

[1].

năng suất cao, chống ch

[8].

Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu mặn tốt thì năng suất

Diện tích đất mặn nhiều và tập trung nhất ở nước ta là đồng bằng sông

lại thấp, tính thích nghi kém. Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen

Cửu Long, vào khoảng 0,7 triệu ha [4]. Các nhà chọn giống lúa Viện lúa

chống chịu mặn ở giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính

đồng bằng sông Cửu Long đã đánh giá 418 giống lúa địa phương trong điều

ưu việt về năng suất, chất lượng đang được phát triển. Thông thường phải

kiện mặn với độ dẫn điện EC: 6 – 12 dS/m đã thu được 44 mẫu giống lúa

mất đến 3 - 4 năm lai tạo để chuyển gen. Ngoài ra, một khó khăn thường gặp

chống chịu tốt, trong đó có các giống điển hình: Nàng co đỏ, Sóc nâu, Đốc

trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng

đỏ, Đốc phụng, Trái mây, Cà đung trắng. Đó là những mẫu giống cho gen

chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn thường được lai

mục tiêu để cải tiến giống lúa chịu mặn có hiệu quả [5].

chuyển vào các con lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong

Nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ (1997) cho thấy, ở nồng độ

muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó lai tạo tính trạng
chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa

muối EC = 10dS/

mới [12]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều
thời gian và không hiệu quả.
: Nếp Áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp
Bờ Giếng [6]. Theo Ngô Đình Thức (2006) đã

172 giống lúa mùa

địa phương và cao sản ở giai đoạn nẩy mầm với 1,5% NaCl và giai đoạn mạ
với EC = 12dS/m cho thấy có 8 giống lúa mùa địa phương chống chịu mặn
cấp 3, tương đương với giống Pokkali là Nàng Quốc Đỏ, Canh Nông Lùn,
Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, Trắng Điệp, TD2. Hai giống lúa

. Năm 2000, Vương Đình Tuấn và cs đã

trung mùa chống chịu tốt với mặn tương đương với giống Pokkali là Thần

xác định được 3 chỉ thị RFLP đó là: R1928, R674 và G257 liên kết với các

Nông Đỏ và OM1352-5. [9]

QTL điều khiển tính chịu mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11[10]. Bùi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

27

28

Chí Bửu và cs. ,(2000) đã xác định được chỉ thị RM223 liên kết với gen chịu

Chƣơng 2

mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 [2].
Tác giả Nguyễn Thị Lang và cộng sự (2008), nghiên cứu ứng dụng
marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy túi
phấn, đã tạo ra được 72 dòng lúa bằng nuôi cấy túi phấn trong nhà lưới. Từ
kết quả thanh lọc mặn ở giai đoạn mạ thông qua các dữ liệu marker SSR với
primer RM 223 sử dụng trên 72 dòng, kết quả, các băng hình thu được có sự
phân tách giữa giống chống chịu và giống nhiễm với kích thước phân tử có

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống lúa FL478: Là giống chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI.
Thông qua dự án hợp tác: “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích
nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt
Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012.

chiều dài nằm trong khoảng 140 - 160bp. Các dòng lúa tái sinh qua nuôi cấy

- Giống lúa TL 6 là giống lúa năng suất cao, thơm, chịu thâm canh khá,

túi phấn: C53/Đốc Phụng - 17, C53/Đốc Phụng - 19, C53/Pokkali - 5,

chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại chính như: Bệnh đạo ôn, khô vằn và

C53/Pokkali - 11, C53/Pokkali - 27, C53/Pokkali - 42, C53/Pokkali - 43,

bạc lá. Phẩm chất gạo ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy

C53/Pokkali - 44, C53/D51 - 4, C53/D51 - 5 và C53/D51 - 8 là các dòng có

được 2 vụ trong năm, được chọn tạo tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp

khả năng chống chịu tốt với điều kiện mặn [7].

Việt Nam từ tổ hợp lai BT7 x KD18, nuôi cấy bao hạt phấn ở F1 tiếp tục
chọn lọc đến F6 chọn ra được TL 6. Giống TL 6 được Hội đồng Khoa học Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận theo QĐ số 215 /QĐ-TTCLT ngày 02/10/2008.

Hình 2.1. Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol [33]
Ghi chú: Bên trái là tên các chỉ thị phân tử, bên phải là vị trí trên

NST1; Vùng đỏ QTL/Saltol; vùng gạch chéo: tái tổ hợp.)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

29

30

- Các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen Saltol trên nhiễm sắc

- Các hóa chất sử dụng để chiết ADN, PCR, điện di, thanh lọc mặn...của hãng

thế số 1: RM3412b, RM493 [33], thông tin chi tiết về chỉ thị phân tử được

chuyên dụng thuộc quản lí của phòng Sinh Học Phân Tử-Viện Di Truyền

thể hiện qua bảng 2.1 và hình 2.1

Nông nghiệp: Acrylamide, Ammonium persulfate (APS), Agarose, Bis –
acylamide, Boric acid, Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB),

Bảng 2.1. Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1

Chloroform Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA) 0,5M; pH = 8.0,
Vị

TT

Tên mồi

NST

Trình tự mồi thuận/nghịch

trí

Nhiệt

Kích

N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine (TEMED), Sodium dedoxyl sulfat

độ

thƣớc

(SDS), Sodium thiosulfates, Tris base 1M; pH= 8.0, Tris HCl 1M; pH = 8.0...

gắn

(bp)

2.2. Địa điểm nghiên cứu

mồi

(Mb)

Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đường Phạm

(0C)
1

2

RM3412b

RM493

1

1

11,6

12,3

TGATGGATCTCTGAGGTGTAAAGAGC
TGCACTAATCTTTCTGCCACAGC
GTACGTAAACGCGGAAGGTGACG

110

Văn Đồng, Hà Nội.
Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại huyện Giao Thủy, tỉnh Nam

60
55

211

CGACGTACGAGATGCCGATCC

(Nguồn ) [45]

Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng, sử dụng trong nghiên
cứu:

Định.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống
lúa chịu mặn
- Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol.
- Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn được chọn tạo bằng

o Máy PCR (hãng Eppendorf)

phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn

o Máy li tâm lạnh (Eppedorf 5810 – R và 2K15 Sigma)
o Máy điện di ngang Bio-Rad GT (Anh), máy điện di đứng Bio-Rad
o Máy soi gel (T2201, sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma)
o Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker)
o Nồi hấp thanh trùng (05MBI-160T-3- Nga)

triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen
Các giống lúa TL6, FL478 được gieo trồng trên đồng ruộng. Khi thời

o Cân điện tử Sartorious (Đức)

kỳ cây lúa ra hoa, tiến hành chọn các cây sinh trưởng khỏe, không sâu

o Máy lắc

bệnh để tiến hành lai.

o Lò vi sóng

2.4.1.1. Chuẩn bị cây mẹ

o Micropipet, ống Eppendorf, bình tam giác các loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

31

32

- Chọn cây: Chọn cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, chuyển cây

- Quan sát kỹ các bông, khi nào túi phấn vươn ra khỏi vỏ trấu của cây

vào chậu (đã được chuẩn bị trước), cột thẻ ghi tên giống vào cây. Chọn 2-3

cha phải thụ phấn ngay khi hoa nở, càng nhanh càng tốt, tận dụng thời gian

bông/tổ hợp lai. Chọn bông đã trổ khỏi bẹ 50–60%. Cẩn thận tách bông

thụ phấn nhiều nhất.

được chọn ra khỏi các bông xung quanh, cắt bỏ các bông đã trổ.

- Lấy bao giấy ra khỏi bông cây mẹ (TL6), rút một bông của cây cha

- Chọn cây lai: loại bỏ những hoa trên (chóp bông) và hoa dưới (gần

(FL478) đang nở rắc lên các bông cây mẹ đã khử đực. Bao bông cây mẹ lại

cổ bông); chỉ giữ lại các hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng ½ - ⅓ vỏ trấu

sau khi thụ phấn. Xếp cạnh miệng bao, dùng kẹp giấy kẹp vào trục bông để

(nhìn xuyên qua vỏ trấu). Mỗi bông giữ lại 15-20 hoa tốt, đúng thời điểm

giữ bông cho chặt (ghi rõ cây cha được thu phấn cho cây mẹ và ngày thụ

để lai.

phấn)

- Cắt vỏ trấu: cắt xiên vỏ trấu, bỏ từ ⅓ - ⅔ vỏ trấu để lộ ra những túi
phấn. Không cắt quá thấp sẽ làm tổn thương nhụy cái. Nếu cắt quá cao sẽ
khó khử đực và phấn sẽ khó rơi xuống nhụy cái.
2.4.1.2. Khử đực

2.4.2. Phƣơng pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC)
Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với các gen được sử dụng để chọn
lọc các cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không phụ thuộc vào điều kiện môi
trường.

- Dùng mũi nhọn kẹp các túi phấn ra ngoài. Thao tác này phải làm rất
cẩn thận để tránh thiệt hại đến nhụy cái (6 túi phấn phải được loại bỏ bao
bông lúa)
- Sau khi khử đực, bao bông lúa lại bằng bao giấy bóng mờ (trên bao
giấy bóng mờ ghi ngày khử đực, tên người khử đực), để giữ bông cho chặt

Trong nghiên cứu này, đã tiến hành xây dựng mô hình sàng lọc trong
các thế hệ chọn giống như sau:
Bước 1: Lai tạo tổ hợp F1
- Các dòng bố mẹ được lựa chọn là cây nhận QTL/Saltol (TL6) sẽ
được lai tạo với giống cho QTL/Saltol (FL478).

2.4.1.3. Chọn cây bố
- Chọn bông từ những cây đại diện, tốt, có nhiều hoa sẽ nở, hoa ở
chóp bông đã tung phấn. Cắt bông lúa có độ dài thích hợp, cắt bỏ lá cờ. Cột
các bông lúa cùng cây cha lại và gắn các thẻ ghi vào bó bông. Mang các

- Khi hai giống lúa cùng trỗ bông, tiến hành thực hiện phép lai hữu
tính, để tạo thế hệ F1.

Bước 2: Tạo thế hệ BC1F1,
- Các tổ hợp lai F1 được lai trở lại với giống nhận QTL/Saltol (TL6) để

bông từ ruộng vào nơi thụ phấn.
- Đặt các bông vào chậu nước, nơi ít gió, dễ di chuyển. Sắp xếp các
bông để rút bất cứ bông nào mà không ảnh hưởng đến bông khác

tạo quần thể BC1F1
- Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, liên kết chặt với QTL/Saltol để xác
định các cá thể mang gen trong quần thể BC1F1

2.4.1.4. Thụ phấn

Bước 3: Tạo cây BC1F2,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

33

34

- Để tạo các cây BC1F2 , các cây BC1F1 tự thụ trong điều kiện nhà lưới.
- Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định và chọn lọc các cá thể BC 1F2
mang QTL/Saltol đồng hợp tử.

2.4.3. Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng
Các thí nghiệm một nhân tố được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên
(RCB), mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

- Đánh giá khả năng chịu mặn nhân tạo và khả năng sinh trưởng phát
triển của các dòng chịu mặn được chọn tạo.

- Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng:
o Cấy 1 dảnh, mật độ 45 khóm/m2

Bước 4: Chọn lọc tạo dòng thuần năng suất và chịu mặn.

o Cây cách cây 15cm, hàng cách hàng 18cm

- Chọn lọc và tạo thuần về các đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu

o Bón phân, chăm sóc như đại trà.

thành năng suất các dòng mang locus gen Saltol chịu mặn trong các thế hệ

như các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng/giống lúa trên đồng

BC1F3, BC1F4 , …
- Đánh giá các dòng mang locus gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng.
TL6

- Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về khả năng sinh trưởng, phát triển cũng

FL478

X

ruộng theo phương pháp nghiên cứu của IRRI, 1980. Các chỉ tiêu theo dõi
gồm có:
o Thời gian sinh trưởng
o Chiều cao cây: đo từ mặt đất đến chóp lá cao nhất theo từng lần

F1

X

lặp lại, đơn vị tính cm.

TL6

o Chiều dài lá đòng: Đo từ cổ lá đến chóp lá
BC1F1

Chọn lọc cá thể mang gen bằng
chỉ thị SSR

 Tự thụ

o Độ thoát cổ bông
o Chiều dài bông: đo từ cổ bông đến chóp bông lúa trước thu
hoạch 3 ngày, đơn vị tính là cm.

BC1F2

Chọn lọc cá thể mang gen Saltol

đồng hợp tử bằng chỉ thị SSR

 Tự thụ

o Số gié/bông
o Số bông/khóm
o Tỷ lệ hạt chắc (%) = Số hạt chắc/tổng số hạt x 100
o Tỷ lệ hạt lép (%) = Số hạt lép/tổng số hạt x 100

BC1F3
 Tự thụ
BC1F4

Đánh giá các dòng mang gen
chịu mặn Saltol trên đồng ruộng

Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp MABC

2.4.4. Phƣơng pháp thử độ mặn nhân tạo
* Thanh lọc mặn nhân tạo giai đoạn mạ bằng chậu và dung dịch
Yoshida có muối theo phương pháp đề xuất của IRRI năm 1997.
- Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida được thể hiện ở bảng 2.2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

35

36

Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, có lặp lại trong điều kiện pH = 5, với công

(Yoshida và ctv, 1976)
Nguyên tố

- Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng được chọn tạo

Hoá chất

Lượng cần

thức có bổ sung muối (NaCl) vào dung dịch Yoshida là 6‰. NaCl tương

(g/2L dd mẹ)

đương với độ dẫn điện EC=12dS/m.

Macronutrient

- Vật liệu nghiên cứu:

N

Ammonium nitrate (NH4NO3)

P

Sodium

365,6

phosphate,

o Sử dụng giống Pokkali (giống chịu mặn có nguồn gốc từ Ấn độ,

monosasic 142,4

làm đối chứng)

monohydrate (NaH2PO4.H2O)

o Giống IR29 (giống mẫn cảm có nguồn gốc từ IRRI)

K

Potassium sulfate (K2SO4)

285,6

Ca

Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O)

469,4

Mg

Magensium

sulfate,

7-

hydrate 1.296,0

(MgSO4.7H2O)
Micronutrient

- Trước khi tiến hành thử nghiệm khả năng chịu mặn, tiến hành xử lý hạt
giống tránh tác động ảnh hưởng của sự ngủ nghỉ đến khả năng nảy mầm của
hạt.

cùng lên thể tích đầy đủ.
Mangannuos chloride, 4-hydrate

6,000

- Sau thời gian phá ngủ (3 ngày), tiến hành đem hạt đã khử trùng cho vào
đĩa Petri với giấy thấm ẩm, đặc trong tủ thúc mầm ở nhiệt độ 30 0C trong 48

(MnCl2.4H2O)
Mo

o Các dòng triển vọng

giống bằng cách đặt trong lò đối lưu ở 500C trong 3 ngày để phá ngủ cho

Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L
nước cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối

Mn

o Giống TL6

Ammonium molybdate, 4-hydrate

0,296

giờ.
- Khi hạt đã nảy mầm, tiến hành gieo hạt vào các hốc của phao cấy. Cây

[(NH4)6MoO24.4H2O]
Zn

Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O)

0,140

mạ con sinh trưởng, rễ có thể xuyên qua lớp lưới xuống dung dịch bên dưới.

B

Boric acid (H3BO3)

3,736

Để hạt có thể làm quen với môi trường, đồng thời tránh gây bất kỳ tổn hại

Cu

Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O)

0,124

nào đến hệ thống rễ cây - cơ quan trực tiếp ảnh hưởng đến cơ chế chống chịu

Fe

Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O)

30,800

mặn, chúng tôi đặt các phao cấy trong nước đã tiệt trùng (3-4 ngày), trước khi

C

Citric acid, monohydrate (C6H8O7.H2O)

47,600

đưa vào dung dịch dinh dưỡng đã mặn hóa.
- Sau 3 đến 4 ngày, khi mạ ổn định, thay nước tiệt trùng bằng dung

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối, 3 lần nhắc lại với công thức
EC= 12 dS/m(6g/l Nacl).

dịch Yoshida có NaCl nồng độ 6‰, định kỳ thay dung dịch 7 ngày 1 lần,
hàng ngày đo pH, luôn duy trì tại pH = 5,0. Sau 14 ngày thử mặn, bắt đầu tiến
hành đánh giá tính chống chịu của các dòng/giống thanh lọc qua quan sát sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

37

38

trưởng dựa vào điểm đánh giá chuẩn SES (Standard Evaluation System) của

- Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành
dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.

IRRI.
Bảng 2.3. Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của
mặn ở giai đoạn mạ (IRRI, 1997)
Mức độ

Khả năng chống

Quan sát

chịu

Sinh trưởng bình thường, lá không có triệu

1

chứng, rễ phát triển mạnh
Sinh trường gần như bình thường, một vài lá hơi

3

trắng và cuộn
Sinh trưởng đã bị chậm lại, hầu hết lá bị cuộn lại,

5

chỉ một vài lá vươn ra
Hoàn toàn ngừng tăng trưởng, hầu hết lá bị khô,

7

một số cây chết
Tất cả cây chết hoặc sắp chết (khô)

9

Chống chịu cao

- Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris
HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07%

- Mercaptol

ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50 l SDS 10%.
- Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 65 0C, thỉnh thoảng đảo cho
dịch được trộn đều.
- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút.

Chống chịu khá
Mức trung bình

- Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml
isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua
đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tượng kết tủa muối.
- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.

Mẫn cảm
Mẫn cảm cao

- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dưới đáy eppendorf. Cho
400 l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ
650C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bước này có

- Để đánh giá khả năng chịu mặn được sử dụng thang điểm đánh giá

thể giữ ở 40C qua đêm.
- Cho 3 l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3

tiêu chuẩn cải tiến (bảng 2.2) để ghi triệu chứng quan sát được của ngộ độc
muối, cho điểm phân biệt kiểu gen nhiễm và kiểu gen chống chịu vừa phải.

2.4.5. Phƣơng pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị

- Thêm 400 l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M
EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh

phân tử

thoảng trộn, lắc đều.

a. Phương pháp tách CTAB
Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai –
Maroof (năm 1984). Quy trình thực hiện gồm các bước:
- Lá của các giống lúa nghiên cứu được cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3
tuần. Mẫu được lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các
enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

tiếng.

/>
- Cho và tủ hút, thêm vào 800 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc
trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.
- Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong
eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên
sang một eppendorf mới. Nếu chưa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng
chloroform/isoamyl alcohol (24:1).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

39

40

- Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200C).
- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa

- Thực hiện các bước trên với 35 chu kỳ, sau đó ở chu kỳ cuối cùng
chạy thêm 720C trong 7 phút sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C
- Sau khi chạy PCR xong, cất giữ mẫu ở nhiệt độ 4 0C. Trước khi đem

trắng ở đáy ống.
- Rửa tiếp bằng 400 l cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13500

phân tích phải được nhỏ thuốc nhuộm Ethidium Bromide vào các mẫu, sau

vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm

đó đưa vào máy PCR gây biến tính ở 940C trong 5phút sau đó để mẫu vào

khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100 l TE

luôn khay đựng đá lạnh rồi tiến hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di.

(10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.

c. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

0

- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 20 C) để sử dụng cho các bước nghiên cứu
tiếp theo.

- Nguyên tắc : DNA tích điện âm không đổi nhờ khung phosphate vì thế
khi đặt trong điện trường, các phân tử DNA dịch chuyển từ cực âm sang cực

b. Kỹ thuật PCR với các mồi SSR

dương và các phân tử DNA có khối lượng và điện tích khác nhau sẽ được
phân tách.

Các chu trình của phản ứng PCR với các mồi SSR, qua các bước:
0

o Bước biến tính: ở chu kỳ đầu tiên biến tính mẫu DNA ở nhiệt độ 94 C

- Mục đích : Nhằm phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau, xác
định được sự có mặt các đoạn DNA quan tâm

trong 5phút, 30 giây
0

o Bước gắn mồi: thực hiện ở 55 C trong 30 giây

* Chuẩn bị bản gel

o Bước tổng hợp thực hiện ở nhiệt độ 720C trong 30 giây

- Cân 0,8g agarose cho vào 100 ml đệm TBE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều

- Thành phần phản ứng

trên máy khuấy từ, để yên 1 phút, cho vào lò vi sóng – mục đích làm nóng

STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

H2O (nước cất 2 lần)

5,3

2

Buffer 10X

1

- Đổ gel vào khuôn gel và lắp lược

3

dNTPs (2mM)

1

- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm

4

MgCl2 (5mM)

0,6

5

Mồi thuận (5µM)

0,5

6

Mồi nghịch (5µM)

0,5

7

Taq Polymerase (5U/µl)

0,1

8

DNA (20ng/µl)

1

9

Tổng số

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
chảy gel và không tạo bọt.
- Làm nguội gel đến 50-55oC, thêm 1µl Ethidium Bromide vào.

chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm
* Kỹ thuật điện di trên gel agarose
- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm
chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm
- Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng tương ứng theo thứ tự mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>