NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN DLOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

–––––––––––––––––––––––––

–––––––––––––––––––––––––

HỨA THỊ NGA

HỨA THỊ NGA

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH
NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ

CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA

CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG

THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2009


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học
Thái Nguyên đã hƣớng dẫn tôi tận tình, chu đáo trong quá trình tôi học tập và

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố

nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng

trong bất kỳ công trình nào khác.

dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải đã tận

Tác giả luận văn

tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản khóa
luận này. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tôi đã đƣợc các anh chị

Hứa Thị Nga

NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán bộ
nghiên cứu trong phòng quan tâm, hƣớng dẫn và cho tôi những lời khuyên
quý báu. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào Tạo
thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận văn
Hứa Thị Nga

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

A

Adenin

bp

Base pair (cặp bazơ)

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen ........................................... 28

cs

Cộng sự

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt ............................................................................. 29

C

Cytozin

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR

ddNTP

Dideoxynucleside triphosphate

dNTP

Deoxynucleside triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

D-Loop

Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể

Bảng 3.2. So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide ............................ 42

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Bảng 3.3. Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein huyết thanh gà thí

EtBr

Ethidium brommide

EtOH

Ethanol

Epp

Eppendorf

G

Guamin

Kb

kilo base

kDa

kilo Dalton

mtDNA

DNA ty thể (mitochondrial DNA)

NXB

Nhà xuất bản

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

PBS

Phosphate - buffer saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium Doecyl Sulphate

T

Timin

TAE

Tris - Acetate - EDTA

Tm

Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

System 9700 .......................................................................................... 30
Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu so với trình tự
chuẩn ..................................................................................................... 41

nghiệm ................................................................................................... 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà...................................................16

1. Lý do chọn đề tài........................................................................................................ 1

Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số ............................................................. 33

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ................................................................................. 2

Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR ...................................... 36

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 3

Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4

cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 ................................. 40

1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà ......................................... 42

CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU.................................................................. 4

Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh. ............................. 43

1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà ............................. 4
1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu ....................................... 5
1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ ............................................................... 7
1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................... 8
1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu
của gia cầm .............................................................................................. 8
1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết
thanh máu .............................................................................................. 10
1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật ......... 11
1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ ................................................................ 12

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể ........................................................ 12
1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể ......................................................... 13
1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể ........................................................... 14
1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà ........................... 14
1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới .............................. 17
1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ............................... 20
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 22
2.1. VẬT LIỆU............................................................................................................... 22
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................................... 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 22
2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 23

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 23

Gần một thế kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc cả thế giới quan tâm

2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật ................. 23

và phát triển mạnh cả về số lƣợng và chất lƣợng. Chăn nuôi gia cầm chiếm

2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................................ 24

một vị trí quan trọng trong chƣơng trình cung cấp protein động vật cho con

2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ....................................................... 25

ngƣời. Gia cầm chiếm 20-25% trong tổng sản phẩm thịt, ở các nƣớc phát triển

2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR .............................. 27

thịt gà chiếm tới 30% hoặc hơn thế nữa.

2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA ................................................................... 29

Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống,

2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự ............................................................ 30

giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất. Đàn gia cầm ở nƣớc ta

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31

phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở các

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ.................... 31

tỉnh phía Nam chiếm 34%. Đàn vịt thì ngƣợc lại phân bố chủ yếu ở các tỉnh

3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ................................. 31

phía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%.

3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể .................................. 33

Theo số liệu của Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm của nƣớc ta

3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể ............................. 37

đến ngày 1/8/2004 là 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu con năm 2001

3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM ............. 43

(218,1 triệu con) thấp hơn năm 2002 ( 233,3 triệu con) và năm 2003 (254,06

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 46

triệu). Sản lƣợng thịt là 316,41 ngàn tấn, thấp hơn năm 2001 (322,6 ngàn tấn),

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 47

năm 2002 (338,4 ngàn tấn) và 2003 (372,72 ngàn tấn). Sản lƣợng trứng là
3,94 tỷ quả, thấp hơn năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) và 2003
(4,85 tỷ). Nguyên nhân là do ảnh hƣởng của dịch cúm gia cầm [10].Năm
2005, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã hoàn thành việc xây dựng đề
án đổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm ở nƣớc ta. Theo đề án, ngành chăn
nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang
sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa và bán công nghiệp trên
cơ sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung tại từng địa phƣơng;
mục tiêu là đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối
lƣợng thịt 1000 nghìn tấn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ quả và tổng giá trị sản xuất
chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2

3

Hiện nay 75-80% chăn nuôi gà ở nƣớc ta là sử dụng các giống địa
phƣơng, nuôi gà chăn thả với các giống truyền thống địa phƣơng cũng không
ngừng phát triển và hiệu quả ngày càng tăng bởi các giống địa phƣơng đã

3. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông,
và gà Đa cựa.

đƣợc đầu tƣ để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao năng suất. Các giống

- Phân lập vùng D-Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR.

gà nội của ta mặc dù có hạn chế về năng suất, nhƣng khả năng thích ứng với

- Xác định trình tự vùng D-Loop và so sánh với trình tự tham khảo đã

điều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt là một số

đƣợc công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế.

giống gà còn có giá trị dƣợc liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe của con

Trên cơ sở đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đại

ngƣời. Gà Ri của ta, gà của ngƣời H'Mông là một trong những giống gà có

diện của ba giống gà nói trên. Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu cho các

phẩm chất quý đó.Và một giống gà hiện đƣợc rất nhiều ngƣời quan tâm về

nghiên cứu về đa dạng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ gen
và Công nghệ tế bào.

phẩm chất, tác dụng của nó đó là gà Đa cựa.
Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào những đặc điểm
hình thái còn dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa. Các đặc tính này
chịu sự kiểm soát bởi các gen, thuộc hệ gen của cơ thể sinh vật và sự tƣơng

- Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của
ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba
giống gà nói trên.

tác giữa các gen với môi trƣờng. phân tích đa hình protein huyết thanh của
các giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm, so sánh
trình tự đoạn D-loop của các giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định
mối quan hệ di truyền giữa các giống gà, đó là một việc làm cần thiết nhằm
cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo cơ sở cho việc
lai tạo các giống mới đáp ứng đƣợc các nhu cầu thị trƣờng hiện nay. Vì vậy
chúng tôi lựa chọn đề tài:
"Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều
khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa" .

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà.
- Xác định mối quan hệ di truyền của ba đại diện của ba giống gà.
- Phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




4

5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà của ta bắt nguồn từ gà rừng
Gallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus. Cách đây khoảng 3000 năm từ

1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU
1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà
Các giống gà hiện nay đƣợc hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâu
dài và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng.
- Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông Dƣơng và Philippin.
- Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và Nam Ấn Độ.

nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, và gà Ri
đƣợc phân bố rất rộng rãi.
Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà ở nƣớc
ta đã có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách đây 3500 năm. Cơ sở của kết luận
này là tƣợng gà bằng đất nung tìm thấy ở xóm Rền, Đồng Đậu, Vĩnh Phúc.
Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà ở nƣớc ta muộn hơn cách đây

- Gallus Lafazetti: Phân bố ở Sri Lanca.

khoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) đã có

- Gallus Varius: Phân bố ở Inđônêxia.
Ở các vùng thung lũng sông Ấn, sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà diễn
ra ở thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trƣớc Công nguyên (CN). Vào
khoảng 2000 năm trƣớc CN gà đƣợc đƣa sang Trung Quốc. Sau đó gà phân
bố ở Hy Lạp, ở đây gà vừa là con vật để làm cảnh, tế lễ, và giải trí (chọi gà).
Thông qua ngƣời Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà đƣợc đƣa
sang các nƣớc thuộc miền Địa Trung Hải và giữa Châu Âu. Đến thế kỉ I gà
nuôi đã đƣợc phân bố rộng rãi ở Trung Âu và Đông Âu.
Dẫn theo Nguyễn Đình Ân và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loại
sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau:

tƣợng gà bằng đồng khá phổ biến.
Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] thì gà đƣợc nuôi cách đây 3000 năm.
Theo các tài liệu nghiên cứu về khảo cổ và di chỉ tìm đƣợc cho thấy
vùng nuôi gà sớm nhất ở nƣớc ta nằm giữa hai dãy núi Ba Vì và Tam Đảo. Gà
nuôi lúc bấy giờ tầm vóc còn bé, khả năng sinh sản thấp và đó chính là tổ tiên
giống gà hiện nay. Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sở
thích và điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán.. tổ tiên ta đã

tạo nên các giống gà khác nhau mà cho đến ngày nay vẫn tồn tại và phát triển
nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre...
1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu

Giới Động vật (Animalia)

1.1.2.1. Gà Ri

Nghành Động vật có xƣơng sống (Chordata)

Có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus banguira thƣờng gặp ở các

Lớp Chim (Aves)

nƣớc Đông Nam Á nhƣ Ấn Độ, Mianma, Malaysia...

Bộ Gà (Galliformes)

Ở nƣớc ta gà Ri đƣợc nuôi phổ biến ở mọi miền trong cả nƣớc. Mầu

Họ Trĩ (Phasianidae)

sắc lông có nhiều loại: Vàng , nâu, đen, trắng, xám...thể hiện tính pha tạp

Giống Gallus

nặng. Tầm vóc nhỏ, dáng thanh gọn, chân có hai hàng vẩy xếp nhƣ hình mái

Loài Gallus gallus

ngói. Đến tuổi thành thục, con trống nặng từ 1,6- 2,2 kg; con mái nặng từ 1,1

Phân loài Gallus gallus domesticus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta đã tạo ra đƣợc



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




6

7

- 1,6 kg. Sản lƣợng trứng 80 - 100 quả/năm. Khối lƣợng trứng nhỏ: 40 - 50

lông gà Mông thƣờng rất đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng......

gam. Gà Ri đƣợc chọn lọc, sản lƣợng trứng có thể đạt 120 - 130 quả/năm. Gà

Về tập tính, trƣớc đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự do nên tập tính có

Ri có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có hƣơng vị thơm ngon, phẩm chất tốt

phần hoang dại. Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối về chuồng hoặc

[7].

đậu trên cây ngủ. Thức ăn có thể là giun, dế, ngô, thóc....., ngƣời nuôi ít cho
Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả năng chống chịu tốt

với thời tiết, bệnh tật, nuôi con khéo, đẻ trứng sớm với khẩu phần ăn nghèo
chất dinh dƣỡng 13-15% đạm thì vẫn nuôi đƣợc gà đẻ trứng bình thƣờng.

ăn thêm.
1.1.2.3. Gà Đa cựa
Là giống gà địa phƣơng đƣợc nuôi ở chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía
bắc trong các gia đình dân tộc thiểu số. Tầm vóc tƣơng đối lớn, màu sắc lông

1.1.2.2. Gà Mông
Ở nƣớc ta gà Mông đƣợc nuôi chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc

đa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu.....Phẩm chất thịt ngon, ít mỡ. Gà có khả năng

trong các gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt là ngƣời H'Mông, đƣợc nuôi với

chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật. Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy là chân

phƣơng thức chăn thả quảng canh không có đầu tƣ.

có nhiều cựa nên đƣợc gọi là gà Đa cựa.

Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc tƣơng đối

1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ

lớn từ 3 - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh trƣởng khá, nhiều lông, ức nở, mào và

Sinh học phân tử nghiên cứu ở mức độ phân tử các phản ứng sinh học

dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn, màu sắc lông đa dạng. Gà Mông thích nghi

xảy ra trong tế bào. Hoạt động của từng gen cũng nhƣ sự phối hợp giữa các

tốt với điều kiện thời tiết khí hậu, dịch bệnh, phẩm chất thịt ngon, ít mỡ, giàu

gen; Kiểm soát sự phiên mã, dịch mã cũng nhƣ sự phân bố của các protein

dinh dƣỡng. Tuy nhiên gà Mông thƣờng nuôi con và chăm sóc con kém hơn

trong tế bào; các phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống của tế bào cũng

gà Ri [7].

nhƣ điều hòa hoạt động giữa các tế bào trong một mô, giữa các mô với nhau....

Gà Mông không những là món ăn ngon, bổ mà còn có giá trị dƣợc liệu

Sự phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA bởi James D.Watson và

cao, rất tốt cho những ngƣời bị bệnh tim mạch. Đồng bào ngƣời Mông dùng

Francis H.C. Crick (1953) chính thức khởi đầu cho thời kì hiện đại của sinh

xƣơng, thịt của gà Mông nhƣ một loại thuốc bồi dƣỡng sức khỏe cho những

học phân tử.

ngƣời ốm yếu. Gà mái đẻ ít và thƣa số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảng

Trải qua hơn nửa thế kỉ sinh học phân tử đã đạt đƣợc những thành tựu

cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày. Trứng gà Mông có khối lƣợng ở mức trung

vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học

bình với 44,04g. Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng

của sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng

12,41. Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệ

dụng vào thực tiễn. Geneomics và Proteomics là vấn đề đang đƣợc quan tâm

lipit khá cao 26,94% [20].

đặc biệt hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu

Đặc tính riêng biệt: Da, thịt, xƣơng và phủ tạng có màu đen chiếm 90%,

trúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome ty

ngoại trừ màu lông do quá trình nuôi bị lai tạp, chƣa đƣợc chọn lọc nên màu sắc

thể, genome lạp thể. Những đặc điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






8

9

các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ở

Việc nghiên cứu các thành phần của máu cũng nhƣ các chỉ số sinh lý,

ngƣời. Cùng với cấu trúc DNA và RNA còn có đặc điểm của quá trình tái bản

hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng trong công tác giống, chỉ số sinh lý, hóa

DNA và phiên mã cũng đƣợc quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinh

sinh đã trở thành hằng số đặc trƣng cho phẩm chất giống, quy định đặc tính di

học phân tử - các thao tác ở DNA và RNA.

truyền bên trong cơ thể, từ đó cho phép khảo sát và điều tra các chỉ tiêu cho

Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) là sự phát hiện, mô tả

và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài trong phạm
vi loài [16]. Các phƣơng pháp dùng trong phân loại phân tử: Hiện nay có hàng
loạt các phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng trong phân loại học phân tử nhƣ:
Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích hiện
tƣợng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tích
đa hình của ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic
DNA - RAPD) ;Phân tích tính đa hình chiều dài các phân đoạn ADN đƣợc
nhân bản có chọn lọc (Amplified Fragment Length Polimorphism-AFLP).......
1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu
của gia cầm
Máu là một loại dịch thể lỏng, có màu đỏ, vị hơi mặn và đƣợc lƣu
thông liên tục trong hệ tuần hoàn của cơ thể. Máu cũng là một mô lỏng (mô
máu) bao gồm các tế bào máu nhƣ: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu. Ngoài ra
còn có huyết tƣơng (dịch ngoại bào). Máu cùng với các dịch thể khác của cơ
thể nhƣ: Dịch bạch cầu, dịch gian bào, dịch tiêu hóa...là những môi trƣờng

công tác chọn giống và lai tạo giống gia súc, gia cầm.
Thành phần của máu: Lấy máu và chống đông rồi cho vào một ống
nghiệm, sau đó ly tâm, ta sẽ thấy máu đƣợc chia làm hai phần rõ rệt:
- Phần trên có màu vàng nhạt vì có các sắc tố màu vàng và chiếm
khoảng 55-60% thể tích của máu.
- Phần dƣới đặc hơn có màu đỏ thẫm, chiếm khoảng từ 40-45% thể tích
của máu, đó là các tế bào máu gồm có : Các hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu.
Lƣợng máu trong cơ thể là tỉ lệ % của khối lƣợng máu so với trọng
lƣợng cơ thể. Tỉ lệ này thay đổi tùy loài: Ở mèo 6,6%, ở thỏ 5,5% và ở gà
8,5% - 9% (gà 180 - 315ml; vịt 360ml).
Tỉ trọng của máu thay đổi thuộc vào tùy loài, thành phần nhóm tuổi
nhƣng mức độ thay đổi không lớn.
Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu của gia cầm không giống nhau, phụ thuộc

vào giống, tuổi và giới tính.
pH của máu và hệ đệm: Phản ứng của máu phụ thuộc vào tỉ lệ ion H+
và OH- trong máu, phản ứng máu nói chung ổn định ít có sự dao động giữa
các loài:
Máu Ngựa pH=7,4; Dê=7,49; Gà=7,42; Lợn=7,49.

sống của tất cả các loại tế bào trong cơ thể và đƣợc gọi là nội bào. Máu là

pH máu đƣợc duy trì ở trạng thái ổn định nhờ sự hoạt động của cơ quan

thành phần rất quan trọng của nội môi. Nội môi luôn đƣợc ổn định và cân

bài tiết và các hệ đệm của máu: Hồng cầu có 5 đôi hệ đệm, huyết tƣơng có 4

bằng đã đảm bảo cho các quá trình sống của cơ thể đƣợc diễn ra một cách

đôi hệ đệm. Nghiên cứu về hệ đệm của máu là cơ sở để sử dụng các dung dịch

bình thƣờng và do đó cơ thể mới đƣợc tồn tại, sinh trƣởng và phát triển

đệm trong điện di huyết thanh và hemoglobin cho phù hợp với pH của nó.

tốt...Các tế bào máu luôn đƣợc đổi mới trong cơ thể nhƣng vẫn luôn duy trì

Trong điện di ngƣời ta sử dụng các dung dịch đệm khác nhau phù hợp với

một tỷ lệ tƣơng đối ổn định.

từng đối tƣợng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




10

11

1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết

Protein huyết thanh máu là hỗn hợp các chất khác nhau. Ngƣời ta đã đi
sâu chứng minh vai trò quan trọng của các tiểu phần huyết thanh với các quá

thanh máu
Trong những năm gần đây, nhờ các phƣơng pháp và kỹ thuật phân tích
sinh hóa hiện đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là phƣơng pháp điện di và các
phƣơng pháp nhuộm hóa tế bào đã góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát
hiện cấu trúc enzym của protein huyết thanh, sữa, các kiểu hemoglobin…trên

trình trao đổi chất và liên quan của chúng với các chỉ tiêu kinh tế khác.
1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật
Tùy theo phƣơng pháp xác định thành phần protein huyết thanh mà ta
đƣợc số tiểu phần (cấu tử) khác nhau.

cơ sở đó nghiên cứu cơ chế phân tử của trao đổi chất, hoạt động của gen trong

Phƣơng pháp điện di trên giấy tách protein huyết thanh bò, lợn đƣợc

tế bào. Nhiều dẫn liệu trong lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền của các

bốn tiểu phần chính; Anbumin là tiểu phần chạy nhanh nhất về phía cực

tính trạng hóa sinh đã đƣợc ứng dụng trong công tác chọn giống vật nuôi một

dƣơng, tiếp theo là các tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin.

cách có hiệu quả.

Về thành phần protein huyết thanh của lợn, gà, cá và một số động vật

Các tính trạng hoá sinh là những tính trạng muốn xác định nó, ngƣời ta
phải dùng các phƣơng pháp phân tích hoá học, hoá sinh học. Hƣớng nghiên
cứu di truyền học hoá sinh ngày càng phát triển mạnh mẽ trên tất cả các đối
tƣợng vi sinh vật, thực vật, động vật và ngƣời. Nhờ cải tiến các kĩ thuật phân
tích hoá sinh ngày càng hiện đại, chính xác, có sự kết hợp giữa các máy phân
tích tự động với máy vi tính đã rút ngắn khá nhiều thời gian phân tích các tính
trạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần.
Nghiên cứu tính đa hình di truyền của hemoglobin, protein, huyết thanh
máu, protein trong sữa hoặc các enzym trong máu và các cơ quan…..đã đƣợc
tiến hành từ lâu.
Năm 1955, Smithies O. đã chứng minh tính đa dạng di truyền các
protein huyết thanh máu động vật. Ông đã dùng hai phƣơng pháp chính là:
Phƣơng pháp miễn dịch học phát hiện nhóm globin, lipoprotein…và phƣơng
pháp miễn dịch học phát hiện hemoglobin, haptoglobin, transferin.
Nhiều nhà nghiên cứu về sau đã sử dụng các phƣơng pháp điện di trên

nuôi khác khi điện di trên giấy cũng đƣợc 4 tiểu phần chính là anbumin,
αglobulin, βglobulin, γglobulin.
Khi phân tích protein huyết thanh trên gel tinh bột thủy phân, gel
polyacrylamide…số cấu tử sẽ lớn hơn do mỗi tiểu phần ở trên giấy sẽ đƣợc
tách ra nhiều phần nhỏ nhƣ tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin,
α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin…
Anbumin là nguyên liệu xây dựng các tế bào, anbumin huyết thanh
đóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển và liên kết axít béo,
vitamin…
Anbumin liên quan đến một số tính trạng kinh tế nhƣ lợn sinh trƣởng
nhanh, tỷ lệ nạc cao thì chúng có hàm lƣợng anbumin cao.
αglobulin tuy hàm lƣợng thấp so với tổng lƣợng protein huyết thanh
nhƣng chúng có vai trò quan trọng trong liên kết với gluxit, lipit để tạo ra
lipoprotein, glucoprotein. Đồng thời, chúng tham gia vận chuyển cholestron.

giấy, trên gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đa

Khi dùng thạch, tinh bột tách đƣợc 2 phần

hình của hemoglobin, các protein trong máu, mô cơ quan, sữa, trứng và các

α2globulin đƣợc quan tâm nhiều hơn vì nó chứa haptoglobin, nó liên quan

enzym trong máu, trong các dịch của cơ thể.

đến hàm lƣợng mỡ sữa và sự tích lũy mỡ sữa ở động vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

α1globulin, α2globulin.




12

13

βglobulin có nhiệm vụ liên kết và chuyển hóa sắt, tạo máu, vận chuyển
các ion kim loại, chuyển hóa mỡ…

Giữa hai lớp màng trong và màng ngoài có chứa dịch kẽ màng. Mặt ngoài của
lớp ngoài và mặt trong của lớp trong có chứa nhiều hạt với kích thƣớc từ 80-

Khi tách βglobulin bằng gel tinh bột đƣợc phần transferin có vai trò

90 Ao chứa các enzyme và cofacto. Ty thể nhƣ một nhà máy để sản sinh ra

quan trọng trong việc tạo máu. Liên quan đến sản lƣợng sữa ở bò, sức kháng

năng lƣợng của tế bào. Hệ thống sản sinh ra năng lƣợng trong ty thể bao gồm

bệnh tự nhiên ở gia súc.

hai quá trình oxy hóa và photphoril hóa. Quá trình oxy hóa giải phóng ra các

γ globulin là tiểu phần rất quan trọng. Nó là protein miễn dịch, ở động

điện tử, các điện tử tác dụng nhƣ tác nhân tích lũy và biến đổi năng lƣợng.

vật γ- globulin đƣợc chia ra làm 5 nhóm: IgA, IgG, IgH, IgD và IgE (do các

Trong điều kiện nếu thiếu oxy sẽ diễn ra quá trình tổng hợp ATP là chất tích

lympho B sản xuất). Các globulin miễn dịch có tác dụng chống lại các kháng

lũy năng lƣợng dƣới dạng các cầu nối photphát giầu năng lƣợng. Tại ty thể sẽ

nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể. Thông qua hệ thống miễn dịch, các globulin

tiếp nhận các sản phẩm đƣợc phân giải từ các chất nhƣ protein, lipit và gluxit

miễn dịch đã bảo vệ cho cơ thể, và có vai trò trong bảo tồn nòi giống [2].

diễn ra trong bào tƣơng đến dạng pyruvat và chuyển sang dạng Axetyl

1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ

coenzimA. Trong ty thể, axetyl coenzimA đã qua quá trình oxy hóa trong chu

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể

trình Krebs. Với chu trình này, đã có bốn lần giải phóng 2H+ nghĩa là giải

Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào hô hấp hiếu khí, có chức

phóng hai điện tử. Các ion H+ giải phóng ra đƣợc các chất vận chuyển H+ tiếp

năng vô cùng quan trọng là trạm chuyển hóa năng lƣợng từ các phân tử dinh

nhận chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy. Trong

dƣỡng thành dạng năng lƣợng tích trữ trong phân tử ATP là dạng năng lƣợng

chuỗi hô hấp, năng lƣợng giải phóng đƣợc tích lại dƣới dạng ATP. Ty thể còn

cần thiết cho tất cả các hoạt động sống của tế bào.

có đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN. Ty thể đã

Ty thể đƣợc Altman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 đƣợc
Benđa đặt tên là Mitochondria (theo tiếng Hy Lạp- Mistos là sợi và chondiralà hạt) vì chúng có dạng sợi hoặc dạng hạt khi xem dƣới kính hiển vi thƣờng.

sử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản sinh ra ty thể mới.
1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể
Nhờ có đủ các nhân tố riêng của mình (mtDNA, mARN, tARN và

Ty thể là những thể nhỏ có màng bao bọc, số lƣợng ty thể trong các tế

riboxom) nên ty thể có thể tự tổng hợp các protein cho mình. Sự tổng hợp

bào rất khác nhau, có thể hàng trăm hoặc hàng nghìn. Ty thể có nhiều hình

protein cũng diễn ra trên riboxom theo cơ chế chung, nhƣng axit amin khởi

dạng khác nhau nhƣ hình cầu, hình que, hình sợi... Ty thể có khả năng chuyển

động, giống nhƣ ở Bacteria là N-fomyl- methionin, chứ không phải methionin

động, thay đổi kích thƣớc, hình dạng và liên kết lại với nhau thành các cấu

nhƣ ở tế bào Eukaryota. Ty thể không thể tự tổng hợp tất cả protein của ty thể

trúc dài hơn hoặc phân ra thành các cấu trúc ngắn hơn. Trong tế bào, ty thể

bởi vì mtDNA chỉ chứa lƣợng nucleotit mã hóa cho khoảng 500 axit amin.

thƣờng tập trung ở các nơi đang diễn ra sự trao đổi chất mạnh nhất.

Rất nhiều protein của ty thể đƣợc tổng hợp từ mạng lƣới nội chất có hạt trong

Cấu trúc của ty thể đƣợc bao bọc bằng một màng kép lớp ngoài nhẵn,

tế bào chất theo mã của các gen trong nhiễm sắc thể của nhân, sau đó đƣợc

lớp trong có nhiều nếp gấp chạy song song và ăn sâu vào trung tâm của ty thể.

vận chuyển vào ty thể. Ty thể tự tổng hợp một số protein không hòa tan cần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14

15

cho màng trong và một số protein có chức năng điều chỉnh quá trình hoạt hóa

này có đặc điểm: Thứ nhất, kiểu gen của con hoàn toàn do mẹ quyết định.

các gen ty thể của nhân tế bào.

Nếu mẹ mang đột biến ở gen bào quan thì con sẽ có kiểu hình đột biến cho dù

1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể

bố bình thƣờng. Thứ hai, ảnh hƣởng đến kiểu di truyền này là số lƣợng bản

Trƣớc đây có giả thuyết cho rằng trong quá trình tiến hóa của tế bào thì

sao nhiễm sắc thể trong bào quan.

ty thể có nguồn gốc từ sự phân hóa của màng sinh chất ăn sâu vào tế bào chất,

Phân tử mtADN có các đặc điểm chú ý sau:

về sau tách ra và phức tạp hóa hệ thống mào trở thành một bào quan độc lập,

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 lần so với gen nhân.

với dẫn chứng là nhiều bọn vi khuẩn có cấu trúc mezoxom - là một phần của

- Số lƣợng bản sao lớn.

màng sinh chất gấp nếp ăn sâu vào tế bào chất, có chứa các enzym và nhân tố

- Đơn bội, không có sự tái tổ hợp.

của sự hô hấp hiếu khí - đó là hình ảnh của ty thể ở dạng nguyên thủy. Nhƣng

- Chỉ di truyền theo dòng mẹ.

hiện nay ngƣời ta công nhận giả thuyết cộng sinh về nguồn gốc chủng loại

Mt DNA của động vật có xƣơng sống nói chung có dạng vòng kép,

của ty thể. Sự xuất hiện ty thể trong tế bào Eukaryota là kết quả cộng sinh của

gồm một chuỗi nặng (chuỗi H) giàu Guamin, và một chuỗi nhẹ (chuỗi L) giàu

một dạng vi khuẩn hiếu khí với tế bào. Dẫn chứng thuyết phục nhất là trong ty

cytozin, có chiều dài khoảng 5µm. Phân tử mtDNA không liên kết với protein

thể có chứa DNA giống DNA của vi khuẩn, riboxom của ty thể về kích thƣớc

histone, có khả năng tái bản theo cơ chế bán bảo toàn nhờ sử dụng các

và rARN giống với riboxm vi khuẩn, và đặc biệt là cơ chế và hoạt động tổng

enzyme DNA polymerase trong chất nền ty thể. Ở đa số các động vật, phân tử

hợp protein trong ty thể có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn.

mtDNA chứa khoảng 16-17kb, mã hóa cho các loại protein/enzyme tham gia

1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà

vào các quá trình tổng hợp năng lƣợng, trao đổi chất...của tế bào, trong đó

MtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5µm.

gồm 22 loại tRNA, 2 loại rRNA 16S và 12S, 13 chuỗi polypeptide [15, 25].

Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 - 5% DNA của tế bào. MtDNA tự tái bản

Tất cả các động vật có xƣơng sống đã đƣợc phân tích đều có 37 gen

theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảy

trên phân tử DNA ty thể và thƣờng không có khoảng trống giữa các gen

ra ở gian kỳ của chu kì tế bào. MtDNA có dạng vòng và không liên kết với

(không có intron). Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử DNA dạng

histon, điều này làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và mtDNA

vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so

tƣơng tự với DNA của vi khuẩn. MtDNA là một trong các nhân tố qui định

sánh trình tự genome ty thể các bậc taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm

tính di truyền tế bào chất.

về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu

Sự di truyền của các gen ty thể phụ thuộc vào hai yếu tố: Kiểu di truyền

phân loại với các taxon bậc cao [30].

của bản thân bào quan và số bản sao nhiễm sắc thể trong tế bào. Ở phần lớn

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 lần so với các gen nhân

các loài, mỗi cá thể nhận đƣợc các bào quan từ mẹ cùng với tế bào chất của

do thiếu cơ chế sửa chữa DNA do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể,

trứng. Kiểu di truyền này đƣợc gọi là di truyền theo dòng mẹ. Kiểu di truyền

không chỉ giữa các loài mà còn cả trong cùng một loài. Bên cạnh đó, các biến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16

17

dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế
bào khác nhau. MtDNA còn có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền
theo dòng mẹ, có nhiều bản sao trong tế bào và bền vững hơn DNA nhân
trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [18], vì vậy có thể đƣợc sử dụng
nhƣ một dấu hiệu để nhận biết các sai khác di truyền.
Năm 1990, trình tự genome mtDNA lần đầu tiên đƣợc công bố trên đối
tƣợng gà Leghorn trắng bởi các tác giả Desjardins và Moais [16]. MtDNA có
chiều dài khoảng 16,8 kb và ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng điều
khiển không mang mã di truyền gọi là vùng D-Loop. Tuy có nhiều đặc điểm
tƣơng đồng với hệ genome mtDNA của các động vật có xƣơng sống, hệ
genome mtDNA của gà vẫn mang những điểm khác biệt:
- Trên chuỗi nhẹ, trật tự gen theo chiều 5'-3' là NADH dehydrogenase
(ND5), Cytochrome b (Cyt b), tRNA

thr

pro

Glu

, tRNA , ND6, tRNA

và vùng điều

khiển trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần vùng điều khiển
hơn [16].

tRNA

ND: NADH dehydrogenase; CO: Cytochrome oxydase
Đoạn D-loop trên mtDNA là một vùng không mang mã di truyền, có
chiều dài 1227bp ở gà nhà [16], chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter

- Ở gà thiếu 1 điểm khởi đầu sao chép nằm giữa 2 gen tRNA
Asn

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà

Cys

và

cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về cấu trúc vùng
trình tự D-Loop có thể chia thành ba domain I, II và III [14]. Trong đó

nhƣ ở các động vật có xƣơng sống khác [16].

- Gen Cytochrome oxydase I (COI) có bộ 3 mở đầu là GTG thay vì
ATG. Toàn bộ genome ty thể gà (Galuss galuss) đƣợc tổ chức nhƣ sơ đồ

domain II bảo thủ nhất, chứa một số đơn vị cấu trúc không thay đổi ngay cả ở
bậc phân loại họ. Ngƣợc lại domain III đƣợc coi là biến đổi nhiều nhất [25].

Đoạn trình tự D-Loop là vùng tiến hóa nhanh nhất trong phân tử

trong hình 1.1.

mtDNA. Trung bình, nó tích lũy các đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì
gen nào trong hệ gen ty thể vì vậy có thể xem trình tự nucleotide của vùng DLoop là một công cụ quan trọng để đánh giá đa dạng di truyền, sự phân hóa
bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài.
1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới
Năm 1994-1995, Fuhimito và cộng sự [33] đã tiến hành nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




18

19

mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, Công , Trĩ, chim Cun cút...dựa

Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus,

trên các phân tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài

Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã đƣợc công bố trong ngân

các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả

hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập đƣợc mối quan hệ nguồn gốc của chúng

này đƣa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định

dựa trên trình tự vùng D-Loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có

đƣợc trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận

rất nhiều điểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất

đƣợc đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển

với G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu đã giả

mtDNA là điểm đặc trƣng của giống Gallus.

thuyết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G.gallus ở các

Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự của
một phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop)của 2 loài gà lôi đặc hữu ở
Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này.
Năm 1999, Kimball và cộng sự [21] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ
của gen cytochrom b (1143 bp) và đoạn siêu biến 1 (350 bp) của vùng điều
khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà
Gô. Hai cây phân loại đƣợc xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận đƣợc trên
một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết
quả phân tích trên toàn bộ gen cytochrom b, điều này cho thấy trình tự vùng

điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại.

do tính tƣơng đồng cao giữa chúng [36].
Năm 2003, S. Moulin và cộng sự đã sử dụng 800 bp của đoạn D-Loop
và 400 bp của gen cyt b để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của 2 loài gà
Lôi Lophura nycthemera và L. leucomelanos. Các kết quả thu đƣợc đã góp
phần phân biệt 2 loài trên và đồng thời làm sáng tỏ nguồn gốc của một số loài
thuộc 2 loài này [29].
Năm 2003, T. Komiyama và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ của
vùng D-Loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và quá trình thuần hóa của 3
giống gà Naganakidori của Nhật Bản. Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xây

Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và
đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc. Họ giải trình tự
539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự
nucleotide của các giống gà G. gallus, G.sonneratii, G.varius, G. lafayettei lƣu
giữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại phát sinh giữa các giống. Đồng
thời, dựa trên đoạn trình tự phân tích đƣợc họ cũng nhân thấy sự khác biệt đáng
kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống nuôi với mục
đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống [31].
Năm 2002 Zang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nucleotide đầu tiên
trong vùng D-Loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nơi này và hai loài phụ G. g. Gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ



dựng đƣợc các nhà nghiên cứu cho rằng tuy có nhiều điểm khác biệt đáng chú

ý, 3 giống gà trên đều có nguồn gốc từ giống gà chọi Shamo. Kết quả này còn
dẫn đến kết luận 3 giống gà đƣợc đƣa từ các vùng lân cận miền Nam trung
Quốc hoặc Đông Dƣơng qua Okinawa vào Nhật Bản [22, 23].
Pereira và cộng sự (2004) đã tìm đƣợc ít nhất 13 gen giả (pseudogene
hay Numt) trong genome của G.gallus với kích thƣớc dao động từ 131 đến
1733 nucleotide. Đây là các đoạn DNA ty thể đƣợc tìm thấy trong hệ gen
nhân của sinh vật nhân thật. Một số trong chúng có nhiều điểm tƣơng đồng
với các đoạn trong ty thể. Do đó, chúng có thể đƣợc dùng trong các nghiên
cứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




20

21

đối tƣợng nghiên cứu. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn chƣa xác định đƣợc tần số bắt
gặp của Numt cũng nhƣ đóng góp của nó đối với genome trong nhân [33].
Komiya T và đồng tác giả (2004) [23] đã tiến hành phân tích trình tự

Năm 2006 Địch Thị Kim Hƣơng và cộng sự [6] đã xác định đƣợc trình
tự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lƣơng
Phƣợng, đã phát hiện đƣợc 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện.

vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc

Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tự

gà địa phƣơng của Nhật Bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà

nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên,

lông đỏ (Jungle Fowl) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen Quốc Tế

Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự

EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Trên cơ sở đó họ đã

án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm

thiết lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn

1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định đƣợc 10 vị trí khác

gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài

biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau.

Năm 2008 Nguyễn Trƣờng Huy và cộng sự [5] đã xác định đƣợc trình

Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa

tự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà:

vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so

Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tƣơng ứng trên

với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài

đoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà bản địa Lào. Dựa trên cây chủng loại

Nhật Bản đầu tiên đƣợc đƣa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của

phát sinh xây dựng đƣợc, có thể đƣa ra kết luận sơ bộ về mối quan hệ di

vùng Nam Trung Quốc và Đông Nam Á. Nhƣ vậy có thể thấy trình tự

truyền giữa các mẫu thuộc 4 giống gà nghiên cứu so với 2 giống gà đƣợc

nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa

chọn để so sánh.

dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý.
1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam
Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp
đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-Loop của 3 loài gà
lôi Việt Nam gồm: gà lôi đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía. Các kết quả thu
đƣợc cho thấy sự sai khác về trình tự nhận biết các enzyme trong vùng trình
tự nói trên [13].
Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen
điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector
pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide
vùng D-Loop.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




22

23

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol,
2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8

2.1. VẬT LIỆU

Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3

Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của các giống gà:
- Gà Ri Bắc Kạn (RI): Lông vàng, da vàng, chân vàng.
- Gà Mông Bắc Kạn (Mo): Lông đỏ thẫm điểm đốm trắng nhỏ, da vàng,
chân chì.
- Gà Đa Cựa Bắc Kạn (Da): Lông màu đỏ thẫm, da vàng, chân vàng và
có nhiều cựa.
Các giống gà trên đƣợc lấy từ Bản Hậu - Xã Mỹ Phƣơng - Huyện Ba
Bể - Tỉnh Bắc Kạn.

2.2.2. Thiết bị
Các thiết bị và hóa chất đƣợc sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công Nghệ Sinh Học.
Các thiết bị sử dụng trong đề tài
- Bể ổn nhiệt hãng Tempette Junior Tech
- Cân phân tích hãng metter Toledo, Thụy Sỹ
- Máy li tâm hãng Sorvall

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

- Máy điện di hãng PowerPac 300, Mỹ

2.2.1. Hóa chất
Protease K (20mg/l); phenol:chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1);

- Máy khuấy trộn hãng OSI, Rotolab

Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0.8%; Tris-HCl (0.1M; pH7.5);

- Máy làm khô chân không hãng Speed Vac Sc 110A- Savan, Mỹ

NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium bromide.

- Máy PCR-PTC 100 hãng MJ Research, Mỹ

Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma.

- Máy chụp ảnh hãng Bio-Rad, Mỹ

Dung dịch đệm PBS (phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl

- Lò vi sóng hãng Samsung, Hàn Quốc

0.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g. Dẫn nƣớc đến 100ml.
Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8);

- Pipetman các loại hãng Gilson, Pháp
- Tủ lạnh sâu -20oC, -84oC do hãng Sanyo, Nhật Bản sản xuất.
- Máy gene AmpPCR System 9700 do hãng Applied Biosystems, Mỹ

EDTA (10mM, pH8); NaCl 0.1M; SDS 2.1%.
Dung dịch đệm TAE dùng trong kĩ thuật điện di: Tris base;

sản xuất.
- Máy xác định trình tự tự động ABI PRISM TM3100 Genetic Analyser

CH3COOH; EDTA (0.5mM, pH8).
Bộ hóa chất dùng cho PCR (dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt...)

do hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất.

Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS,

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED
Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10%
(w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O,
30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật
• Nguyên tắc chung
Màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài
nhân đƣợc giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA đƣợc tinh sạch nhờ



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




24

25

proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol. Cuối

mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trƣờng với cƣờng độ dòng điện và

cùng, DNA đƣợc tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phƣơng pháp ly tâm.

hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dƣơng. Gel đƣợc

• Quy trình kĩ thuật

sử dụng trong kĩ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong

Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia

thí nghiệm này chúng tôi đã dùng gel agarose 0,8 bởi nồng độ này phù hợp

máu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA
tổng số theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [35] các bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4 oC,
đổ dịch, thu cặn.

kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1-20kb).
• Quy trình kĩ thuật
Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agrose vào 100ml dung dịch đệm TAE.
Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu đƣợc dung dịch trong suốt. Để nguội đến

Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µl

khoảng 50-60oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Sau 30

proteinase K. Mẫu thu đƣợc ủ ở 65 oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng,

phút gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa

chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch.

dung dịch đệm TAE.

Bƣớc 3: Bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl
o

Tra mẫu DNA: Trộn một lƣợng mẫu thích hợp (3 µl) với đệm tra mẫu

alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4 C.

(2,5 µl), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có

Hút pha trên vào ống mới.

hiệu điện thế 100V, dòng 60-80mA trong khoảng 30 phút.

Bƣớc 4: Thêm một thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol
o

(24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4 C. Thu pha trên.
Bƣớc 5: Thêm CH3COONa một lƣợng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong
o

ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20 C trong 15h (qua đêm).
o

Bƣớc 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4 C để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung
o

500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4 C, bỏ dịch và thu cặn.
Bƣớc 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O,

Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung
dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml. Lấy bản gel ra sau 10-15 phút và rửa trong
nƣớc sạch.
Quan sát và chụp ảnh bằng máy Bio-Rab.
2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE

• Nguyên tắc
SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi [26].Trong phƣơng pháp này,

búng nhẹ.

các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện

2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose

trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các

• Nguyên tắc chung

nồng độ khác nhau. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có

Điện di là kĩ thuật dùng để tách và định lƣợng axit nucleic với các kích

kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein

thƣớc và hàm lƣợng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của

gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc

axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO43- trên bề

loại trừ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

26

27

Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein-

Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3

SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc

Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30

vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành

phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản

các băng, vạch khác nhau. Gel thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 5%-15%

gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant

và có thể đƣợc chạy theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng.

Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant

• Phƣơng pháp

Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc

Máu ngoại vi đƣợc lấy khoảng 3ml -5ml từ ba đại diện của ba giống gà

tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho

. Để mẫu máu tại nhiệt độ phòng trong 3h. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút

đến khi có thể quan sát thấy .

trong 15 phút. Hút chuyển phần huyết thanh sang eppendorf mới. Mẫu huyết

2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR

o

o

thanh sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25 C hoặc -75 C.

Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain

Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)

reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên đƣợc Mullis và cộng sự

Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 .Các thiết bị,

mô tả năm 1986.

hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp.
Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ

• Nguyên tắc:
Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch
đại invitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất

khác nhau.
Đối với các protein có trọng lƣợng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%,

thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene từ những

12.6% và 15% (w/v) thƣờng đƣợc sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS-

đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập hoặc từ một lƣợng rất nhỏ lấy ra đƣợc khuếch

PAGE đƣợc tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản nhƣ sau cho

đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp

3 mẫu huyết thanh của 3 dòng gà thí nghiệm đã pha loãng 30 lần.

cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA trong bộ gene

Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE

của các cơ thể sinh vật khác nhau.

Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS,
0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED
Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10%
(w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O,

mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP,
dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực
hiện trên thiết bị nhân DNA.
Một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:

30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED
Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol,
2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn



- Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi
đơn ở nhiệt độ 94o- 95oC trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1- 1.5 phút)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




28

29

- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp xuống 40- 65oC

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt

cho phép hai đoạn mồi gắn DNA mẫu ở vị trí tƣơng đồng theo nguyên tắc bổ

Các

Khởi động

sung ( A - T, G - X) ở hai đầu DNA cần nhân.

bƣớc

nóng

- Giai đoạn kéo dài: Ở nhiệt độ 72 oC DNA Taq polimerase hoạt động

Nhiệt độ

94oC

94oC

kéo dài DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên

Thời gian

4'

1'

tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu.

Số chu kì

1

Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn nhƣ trên, một đoạn DNA khuôn đƣợc
nhân lên thành hai, các đoạn DNA đƣợc nhân bản trong mỗi chu kì lại đƣợc
coi là DNA khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì
nhân bản sẽ tạo ra 2k DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu.
• Nguyên liệu
- Cặp mồi H1255- L16725 chuyên biệt. Ở đây, H(Heavy) và L( Light)
là kí hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuclotide đầu 3' của

Giữ

Kéo dài

Ổn định

50oC

72oC

72oC

4oC

1'

1'20"

10'

∞

mồi

30

mẫu

1

Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel
agarose 0,8%.
2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA
- Cân ống eppendoff (1,5ml)
hành cắt gel trên máy soi DNA, thu lấy các vạch DNA đặc hiệu rồi cho vào
ống eff đã cân.
- Cân lại ống eff có chứa gel để biết đƣợc trọng lƣợng của băng gel ta

primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15].
- Bộ hóa chất: Dung dịch đệm có chứa NH4+, dNTPs 10mM, MgCl2

vừa cắt.
- Bổ sung dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) với tỉ lệ 1mg

10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas.

gel: 1 µl dung dịch MBS và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 50-60oC để gel tan hoàn toàn.

- Nƣớc khử ion vô trùng.
Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể

- Hút dịch gel hòa tan vào các vi cột, giữ ở nhiệt độ phòng trong
khoảng 1 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa.

tích 25 µl nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Gắn

- Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến

- DNA khuôn (Teplate)

Nƣớc
Buffer
MgCl2
dNTPs
Mồi H1255-F
Mồi L16725-R
Taq DNA polymerase
DNA temp

Tổng thể tích

Biến tính

10,85 µl
2,5 µl
4 µl
2,5 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,15 µl
4 µl
25 µl


- Bổ sung 700 µl dung dịch MBW (Membrane Wash Solution) và ly
tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, sau khi ly tâm cũng loại bỏ dịch.
- Lặp lại bƣớc trên với 500 µl dung dịch MBW và ly tâm 12000 vòng
trong 1 phút ở 4oC. Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút.
- Chuyển vi cột sang 1 ống eff 1,5 ml mới, sau đó cho vào máy sấy
khoảng 5 phút.
- Bổ sung thêm khoảng 30-35 µl H2O 2x để ở nhiệt độ phòng 1 phút
rồi ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4 oC, cuối cùng bảo quản mẫu sau khi
tinh sạch ở -20oC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




30

31

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự
• Nguyên tắc chung
Trình tự vùng D-Loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của
phƣơng pháp Sanger: Tạo ra các đoạn Oligonuclotide hơn kém nhau 1
nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ
Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba
giống gà Ri, Mông, Đa cựa chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của

các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR

chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, xác định

sử dụng BigDya Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit đã có chứa sẵn các hóa

trình tự của vùng D-Loop. Từ đó, so sánh các trình tự này để tìm ra sự khác

chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs,ddNTPs,

biệt giữa chúng.

DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn và mồi phù

3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà

hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đx đƣợc đánh dấu

Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền các giống gà, vấn đề quan trọng

bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc

đầu tiên là phải thu nhận đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch và không bị

trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, 200ng DNA khuôn, BigDye và nƣớc với tổng

phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Có nhiều phƣơng pháp tách

thể tích là 15 µl.

chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn một phƣơng pháp tách chiết

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR

có nhiều ƣu điểm và phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì

System 9700

mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu cho nên chúng tôi đã lựa chọn

Các bƣớc

Khởi
động nóng

Biến tính

Gắn mồi

Kéo dài

Giữ mẫu

Nhiệt độ

94oC

96oC

50oC

60oC

4oC

Thời gian

1'

10''

5''

4'

∞

Số chu kì

1

phƣơng pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russel để tách
chiết DNA.
Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39 oC trong 2
giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian nhƣ vậy, plasminogen trong
huyết tƣơng sẽ đƣợc chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân

25

hủy các protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào
đƣợc giải phóng. Sau khi rã đông đem ly tâm dung dịch máu đã đƣợc hòa tan
trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì dộ pH của
máu. Các tế bào thu đƣợc đem hòa tantrong dung dịch đệm tách có chứa
EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải
phóng DNA ra môi trƣờng. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các Mg2+, nhờ
vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Nhƣ vậy, cả SDS và EDTA đều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

32

33

tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease
K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. pH kiềm
của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định.
Để loại bỏ thành phần protein trong mẫu tách, chúng tôi tiến hành lắc
mạnh mẫu với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamy alcohol. Chloroform làm
tăng cƣờng hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhƣng không
làm ảnh hƣởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận
lợi cho việc tách pha nƣớc với với pha hữu cơ. Isoamy alcohol có tác dụng
làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn
hợp đƣợc phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nƣớc có chứa DNA, pha giữa

Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số

là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và

1: DNA tổng số gà Ri; 2: DNA tổng số gà Mông;

isoamy alcohol. Pha nƣớc đƣợc hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này

3: DNA tổng số gà Đa Cựa

sau đó đƣợc xử lý bằng hỗn hợp chloroform: isoamy alcohol nhằm loại bỏ

Trên ảnh điện di, các mẫu đều xuất hiện một vạch DNA sáng đậm ở vị

hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bƣớc

trí cao nhất trên bản gel. Theo lý thuyết, DNA tổng số bao gồm các đoạn có

này có thể lặp lại 1-2 lần.

kích thƣớc từ 10 kb đến 300 kb, khi điện di sẽ tập trung thành một vạch đậm.

Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 µm CH3COONa 3M, pH

Nếu DNA tách chiết đƣợc có lẫn protein, các phân tử protein chƣa đƣợc loại

5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nƣớc bao quanh phân tử

hoàn toàn sẽ tạo thành vạch sáng kéo dài phía trên vạch DNA tổng số. Hình

DNA, để lộ ra các gốc phosphat tích điện âm. Khi đó các ion Na + sẽ kết hợp

1.3 cho thấy sản phẩm DNA tách chiết ít bị lẫn protein tạp và dựa vào độ sáng

với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleitit giảm, do

của vạch DNA tổng số, có thể thấy nồng độ DNA thu đƣợc khá cao. Chúng

o

đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -20 C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần

tôi kết luận DNA tổng số tách chiết từ các mẫu máu gà đảm bảo chất lƣợng để

nhƣ DNA kết tủa hoàn toàn. Tủa thu đƣợc đƣợc rửa bằng EtOH 70%, Làm

phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.

khô và hòa tan trong nƣớc. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế

3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể

o

chúng tôi đã loại RNA bằng RNase, ủ ở 37 C trong 2-3 giờ. DNA tinh sạch

Tốc độ tích lũy đột biến trong vùng trình tự điều khiển cao gấp 5-10 lần

đƣợc hòa tan trong nƣớc khử ion vô trùng và đem điện di kiểm tra trên gel

so với các gen khác trong hệ gen ty thể, do đó nó rất có ý nghĩa rất quan trọng

agrose 0,8%. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1.

trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật.
Nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của 3 giống gà Ri, Mông và
Đa cựa, chúng tôi đã sử dụng vùng trình tự D-Loop trong hệ gen ty thể làm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

34

35
Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72 oC trong 10

đối tƣợng nghiên cứu.
Để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc chúng tôi tiến

phút để đảm bảo sự tổng hợp đƣợc kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR
đƣợc giữ ở nhiệt độ 4oC.

hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 và L16725.
L16725 (Tm = 60oC): 5'-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3 '(19 nucleotit)

• Thành phần và nồng độ các chất tham gia:

H1255 (Tm = 55OC): 5'-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3 '(21nucleotit)

Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA

Cặp mồi này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu đoạn D-Loop ở gà

polymerse, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nƣớc.

nhà và là cặp mồi bảo thủ, do đó có thể sử dụng cho nhiều đối tƣợng khác

Trong đó có 3 thành phần thƣờng thay đổi trong từng phản ứng đó là: Mồi,

trong bộ gà. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi

MgCl2 và DNA khuôn.
- Dung dịch đệm: PCR đƣợc thực hiện trong một môi trƣờng đệm phù

trên có chiều dài khoảng 1,3 kb.
PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản

khi khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4+ của hãng Fementas, nó

ứng cũng nhƣ thành phần và nồng độ các chất tham gia.

phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng

• Chu trình nhiệt của PCR
- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng
94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ đƣợc hoạt
tính. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lƣợng G - C và chiều dài của phân
tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trƣớc khi
bƣớc vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ đƣợc đặt 94 oC trong 4 phút để đảm bảo
phân tử DNA đƣợc biến tính hoàn toàn.
- Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là
o

hợp với hoạt động của enzym với giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau

o

55 C nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52 C. Chúng tôi đã thử chạy phản
ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn đƣợc nhiệt

o

độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 50 C.

về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt
hơn so với loại đệm không có chứaNH4+.
- Mồi: Đây là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh
nhiệt độ gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hƣởng đến lƣợng sản phẩm thu
đƣợc. Nồng độ mồi xuôi và ngƣợc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là
10pmol/µl.
- MgCl2: Vai trò của ion Mg2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với
enzym, kích hoạt và tăng sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá
thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá cao sẽ
ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Mg2+
là 10mM cho kết quả tốt nhất.

- Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến

- 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ

72oC để cho enzym Taq polymerase hoạt dộng tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của

thuộc nhiều vào kích thƣớc của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2.

phản ứng vào khoảng 1000 nucleotit/phút. Trình tự vùng D-Loop quan tâm có

Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị

kích thƣớc khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi đƣợc lựa chọn

cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm,

là 1 phút 20 giây.

chúng tôi thấy nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




36

37

- Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn có chứa trình tự đích

3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể

cần nhân lên, nó phải đảm bảo yêu cầu đƣợc tinh sạch và ít bị đứt gãy. Thông

Đoạn D-Loop đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger. Do xác

thƣờng, hàm lƣợng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100ng/

định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR nên chúng tôi sử dụng cặp mồi

phản ứng.

H1255 và L16725 làm cặp mồi cho 2 chiều đọc. Sở dĩ phải dùng cả mồi xuôi
o

Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở 4 C. Sau khi đƣợc kiểm tra trên gel

và mồi ngƣợc vì đoạn DNA cần xác định trình tự dài 1,3 kb trong khi ở điều
kiện thí nghiệm tối ƣu, chỉ có thể xác định trình tự tối đa 900 - 1000

agarose 0,8%.
Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.2.
M

1

2

nuclotitde. Kết quả đƣợc kết hợp và xử lý bằng phần mềm Seqscape và
BioEdit giúp xác định đƣợc trình tự đầy đủ của vùng D-Loop của các mẫu gà.

3

Do mẫu gà Mông đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-Loop
của gà Mông chƣa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi công bố và so sánh kết quả hai
Kb

mẫu Da và RI.
So sánh trình tự Da và RI với nhau và với trình tự D-Loop của gà đã

1,5

đƣợc công bố Galuss galuss gốc Nhật lấy trình tự trong trên ngân hàng gen

1,3

mang mã số AB114078 quốc tế EMBL (EBI)/Gen Bank/DDBJ, chúng tôi thu

1,0

đƣợc kết quả hình 3.3.
10

Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR
M: Marker; 1: Mẫu gà RI; 2: Mẫu gà Mông; 3: Mẫu gà Đa Cựa

PCR đặc hiệu chứng tỏ chƣơng trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham
gia phản ứng là phù hợp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



50

60

aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg
G.CG..T.A. ...T...... .......... .......... .......... ..........

RI

C......... .......... .......... .......... .......... ..........

70

80

90

100

110

120

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI1

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

nhìn thấy băng phụ rất mờ bên dƣới chứng tỏ sản phẩm PCR tƣơng đối đặc
hiệu. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã nhân đƣợc vùng D-loop. Sản phẩm

40

DA

nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thƣớc chuẩn (marker),
hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung và chỉ

30

AB114078

Quan sát ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA
cho thấy kích thƣớc phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, tức là phù

20

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

130

140

150

160

170

180

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat

DA

.......... .......... .......... .......... ......T... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




38
190

200

210

39
220

230

240

670

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

680

690

700

710

720

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac

AB114078

tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag

DA

.......... .......... .......... .A........ ....C..... ..........

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

250

260

270

280

290

300

730

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

740

750

760

770

780

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc

AB114078

tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag

DA

.....T.... .......... .......... .......... .......... ..........

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

310

320

330

340

350

360

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

790

800

810

820

830

840

AB114078

tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact

DA

.......... ....T..... .......... .......... .......... ....T.....

AB114078

acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ....T.....

DA

.......... .A........ .......... .......... .......... ..........

RI1

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

370

380

390

400

410

420

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
430

440

450

460

470

480

850

860

870

880

890

900

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt

DA

.......... ........-. .......... .......... .......... ..........

RI

.......... ........-. .......... .......... .......... ..........

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

910

920

930

940

950

960

AB114078

ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AB114078

ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

490

500

510

520

530

540

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

970

980

990

1000

1010

1020

AB114078

ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag

DA

.......... .......... ...T...... .......... .......... ..........

AB114078

c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt

RI

.......... .......... ...T...... .......... .......... ..........

DA

.-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

RI

.-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

550

560

570

580

590

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

600

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
610

620

630

640

650

660

1030

1040

1050

1060

1070

1080

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078
DA
RI

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata
.......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... ..........

1090

1100

1110

1120

1130

1140

AB114078

cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AB114078

tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




40
1150

1160

1170

41
1180

1190

1200

Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta

DA

.......... .......... .......... .......... .......... ..A.......

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

so với trình tự chuẩn
Kiểu biến dị

C thành T

335

Đồng hoán

Da, RI

A thành T

504

Dị hoán

3

Da, RI

A thànhT

992

Dị hoán

4

Da

A thành G

1

Đồng hoán

5

Da

G thành A

212

Đồng hoán

6

Da

G thành A

792

Đồng hoán

7

Da

G thành A

1193

Đồng hoán

thấy có 16 điểm đa hình/ đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Da có 15

8

Da

G thành A

1216

Đồng hoán

điểm (chiếm 1,23%) và RI có 4 điểm (chiếm 0.33%) khác với trình tự chuẩn.

9

Da

A thành T

7

Dị hoán

Cả hai giống thuộc mẫu gà Da và RI đều có cùng sự khác biệt nucleotide so

10

Da

A thành T

14

Dị hoán

với trình tự chuẩn AB114078 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T ở vị trí

11

Da

T thành A

9

Dị hoán

355, thay thế A bằng T ở vị trí 504 và vị trí 992.

12

Da

T thành C

3

Đồng hoán

13

Da

T thành C

225

Đồng hoán

14

Da

C thành T

246

Đồng hoán

15

Da

C thành T

315

Đồng hoán

16

RI

A thành C

1

Dị hoán

1210

1220

AB114078

gcaaacacaa aacccgcctt

DA

.......... .....A....

RI

.......... ..........

Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI)
và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078
So sánh hai mẫu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự chuẩn chúng tôi

Ngoài ra giữa hai giống thuộc mẫu gà Da và RI còn có sự khác biệt với
nhau ở 14 điểm đa hình ở các vị trí:
Mẫu Da đột biến thay A thành G ở vị trí 1; đột biến thay G thành A ở
vị trí 212, 792, 1193,1216; đột biến thay A thành T ở vị trí 7, 14; đột biến

Mẫu

1

Da, RI

2

Thay đổi

Vị trí trên ty thể

....|....| ....|....|

STT

nucleotide

thay T thành A ở vị trí 9; đột biến thay T thành C ở vị trí 3, 225; đột biến C
thành T ở vị trí 246, 315; Mẫu RI đột biến thay A thành C ở vị trí 1. Các sai

Chúng tôi so sánh trình tự vùng D-Loop của 2 mẫu gà nghiên cứu với

khác giữa các mẫu là đột biến kiểu đồng hoán, và dị hoán đƣợc thống kê ở

một số trình tự của các chủng gà đã đƣợc công bố: Giống Galuss galuss

bảng 3.1.

Murghi gốc Ấn Độ lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số GQ293096, giống
gốc Mỹ lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số AY235570 và AY235571 để
so sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide và xác định mối quan hệ di

truyền giữa chúng kết quả so sánh bảng 3.2.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên