NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

 -----------------------

------------------------

 -----------------------

------------------------

ĐẶNG NGỌC HÙNG
ĐẶNG NGỌC HÙNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC
MÃ SỐ: 60.62.60

LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH

LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ
THS. ĐỒN THỊ MAI

THÁI NGUN – 2009

THÁI NGUYÊN – NĂM 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC

1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) ........... 16
1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)......................................................... 16

Trang
Lời cảm ơn

1.6.3. Bạch đàn lai ................................................................................................ 17
1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng ni cấy mơ ................................................... 20

Lời nói đầu

1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn ............... 21

Danh mục bảng

1.7.1. Trên thế giới................................................................................................ 21

Danh mục biểu đồ

1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ............... 25

Danh mục hình ảnh

CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3
1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3
1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ................................ 4
1.3.1. Tính tồn năng của tế bào thực vật ............................................................ 4
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào................................................. 4
1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới q trình nhân giống bằng ni cấy mơ tế bào ........ 6
1.4.1. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 6
1.4.2. Các chất điều hồ sinh trưởng.................................................................... 8
1.4.3. Mơi trường vật lý ........................................................................................ 10
1.4.4. Vật liệu nuôi cấy ......................................................................................... 11
1.4.5. Điều kiện vô trùng ...................................................................................... 11
1.4.6. Buồng nuôi cấy ........................................................................................... 12
1.5. Các giai đoạn chính trong q trình nhân giống ........................................ 12

1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ..................................................................................... 12
1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ............................................................................. 13
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh................................................................................ 13
1.5.4. Tạo cây hồn chỉnh (ra rễ) ........................................................................ 14
1.5.5. Đưa cây ra mơi trường tự nhiên ................................................................. 14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) ............................................................ 17



NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 28
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 28
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................... 28
2.2.1. Một số đặc điểm chính của dịng UE35 và dịng UE56 .............................. 28
2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu ...................................................................................... 28
2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ........................................................................ 29
2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 29
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp ................................................................... 31
2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu..................... 31
2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .... 32
2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC)
và chất lượng chồi (TLCHH) ............................................................................... 32
2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH................................. 32
2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH ........................ 33
2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ..................... 34
2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................. 34
2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH ..... 35

2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều
dài trung bình của rễ ............................................................................................. 35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây

Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72

và chiều dài trung bình của rễ .............................................................................. 36

4.1. Kết luận ......................................................................................................... 72

2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con

4.2. Tồn tại ........................................................................................................... 72

ở vườn ươm ........................................................................................................... 36

4.3. Kiến nghị ....................................................................................................... 73

2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................. 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75

2.4.5. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 38

Tài liệu tiếng việt ................................................................................................ 75

2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu............................................................................. 38

Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................ 77

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 41

Phụ Lục

3.1. Khử trùng mẫu cấy ....................................................................................... 41
3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu ...................... 43
3.3. Nghiên cứu loại mơi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi ..................... 44
3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung vitamine B2 vào môi trƣờng MS * đến HSNC
và TLCHH ........................................................................................................... 46
3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hồ sinh trƣởng trong mơi trƣờng MS * đến
HSNC và TLCHH ............................................................................................... 50
3.5.1. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH ............................................. 50
3.5.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + IAA đến HSNC và TLCHH ................... 52
3.5.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường MS *
đến HSNC và TLCHH .......................................................................................... 55
3.5.4. Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ......... 58
3.5.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và
TLCHH ................................................................................................................. 60
3.5.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường 1/2 MS* tỷ lệ
chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ............................................. 63
3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung
bình/cây và chiều dài của rễ ................................................................................. 66
3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây
con ở vườn ươm.................................................................................................... 68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG

LỜI NÓI ĐẦU
Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu
quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nơng Lâm Thái
Ngun. Để hồn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học
2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống

Tên bảng

TT

Trang

3.1a Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) …... 41
3.1b Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) ….... 42
3.2 Bảng ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi…………….... 43

các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E.

exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
Sau thời gian học tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp này, tơi đã

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC và

nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo

3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của

trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai

thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc
Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Ngun. Cho phép
tơi được bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo, đặc biệt là
GS.TS. Lê Đình Khả, Th.s. Đồn Thị Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp
đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và
người thân đã giúp đỡ tơi có được bản luận văn này.
Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một vấn đề khó
trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống cây lâm nghiệp. Việc nghiên cứu

TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường)

44

…….….
UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/cơng thức) …………………………….. 47

dịng UE35 và UE56 (180 mẫu/cơng thức) …………………….……... 51
3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH
của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ……………………… 53
3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công
thức)…………………………………………………………………… 56
3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ……… 59

nhân giống một số dịng Bạch đàn lai nói trên trong đề tài nhằm góp phần xây
dựng cơ sở hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất cây với số lượng lớn,
đồng đều, có chất lượng cao do vậy khơng thể tránh khỏi những khiếm
khuyết, rất mong được sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các

3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến

bạn đồng nghiệp để cơng trình nghiên cứu này được hồn thiện.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Thái Ngun, tháng 4 năm 2009
Tác giả

3.11 Ảnh hưởng của IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và

HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/cơng thức) …………………………. 61
3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều
dài của rễ (180 chồi cây/ cơng thức) ………………………………….. 64
chiều dài rễ của dịng UE35 và UE56 ………………………………… 66
3.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại
vườn ươm sau 1 tháng (90 cây mạ /công thức)……………………….. 69

Đặng Ngọc Hùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
TT

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
TT

Tên biểu đồ

Trang

Tên bảng

Trang

3.1.

Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43

3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH của dòng UE35 và UE ....... 48

3.2.

Ảnh dịng UE35 cấy trong 5 loại mơi trường ………………………. 46

3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC của dòng UE35 và UE ................... 51

3.3

Ảnh mẫu được cấy sang mơi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10

3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC của dòng UE35 và UE.......... 48

ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 47

3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của dòng UE35 và UE................. 52
3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC của

3.4a. Ảnh chồi ni cấy trong mơi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48

dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54

3.4b. Ảnh chồi ni cấy trong mơi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49

3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH của

3.5.

3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC

3.6.

của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 56
3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH

của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60
3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến

Ảnh chồi ni cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1 mg/l
N AA + 0,5 mg/l Kinetin …………………………………………… 62

3.8.

dòng UE35 và UE ................................................................................................. 59
3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH

Ảnh chồi ni cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0
mg/l NAA …………………………………………………………... 58

3.7.

của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 58
3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC của

Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH ……………………………………………………………... 55

dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54

Ảnh chồi ni cấy có bổ sung ABT1 vào môi trường ra rễ sau 15

ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 68

3.9.

Ảnh cây con tại vườn ươm của 2 dòng ……………………………... 71

3.10. Ảnh sơ đồ cho quy trình ni cấy mơ 2 dòng UE35 v à UE56 …….. 74

HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62
3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62
3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65
3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35
và UE .................................................................................................................... 65
3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng
UE35 và UE .......................................................................................................... 67
3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của
dịng UE35 và UE ................................................................................................. 67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã khơng

ABT1

: Chất kích thích ra rễ của Trung Quốc

BAP

: 6- Benzyl amino purine

ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh

B2

: Riboflavil

chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây

Bộ NN&PTNT

: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc

Ca (0Cl)2

: Hypoclorit canxi

điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn.

GA3

: Gibberellin acid 3

Cây ni cấy mơ thường được trẻ hố cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt.

HgCl2

: Clorua thuỷ ngân

Trong lúc cây hom lại thường khơng có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống

HSNC

: Hệ số nhân chồi

đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế

IAA

: Indol acetic acid

ni cấy mơ tế bào cịn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp.

IBA

: 3-Indol butyric acid

Mặc dù ni cấy mơ địi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều

Kinetine

: 6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05

NAA

: Nathyl acetic acid

đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp (Lê Đình Khả, Đồn

Na0Cl

: Hypoclorit natri

Thị Mai, 2002, tr. 166-182).

TTG1

: Thuốc kích thích ra rễ có gốc IBA của Trung tâm
giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam

TLCHH

nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom

Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh
trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất nguyên

liệu như: gỗ, ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ củi. Bạch đàn được trồng rộng

: Tỷ lệ chồi hữu hiệu

rãi ở nhiều nước trên thế giới. Nhiều giống Bạch đàn được cải thiện cùng với kỹ
thuật trồng rừng thâm canh cho năng suất cao.
Ở Việt Nam, Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng.
Tuy nhiên năng suất và chất lượng rừng Bạch đàn trồng rừng ở nước ta còn thấp và
rất khác nhau. Từ năm 1996 Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng - Viện khoa học
Lâm Nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu lai tạo và chọn được một số tổ hợp lai có nhiều
triển vọng về khả năng sinh trưởng. Các tổ hợp lai trong loài và khác loài của các loài
Bạch đàn urophyla (Eucalyptus urophyla) với Bạch đàn liễu (E. exserta) trong đó
Eucaluptus urophyla được dùng làm mẹ, E. exserta được dùng làm bố. Những dòng
cây lai được chọn là các dịng vơ tính thuộc các tổ hợp lai U29E2 (dòng 35) và
U29E4 (dòng 56). Hai dòng cây lai này đều có mẹ là Bạch đàn uro (U29), bố là Bạch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2

3

đàn liễu (E2), song lại thuộc hai cây khác nhau là E2 và E4 vì vậy có đặc điểm sinh

CHƢƠNG 1

trưởng khác nhau. Các dịng vơ tính này thuộc các tổ hợp lai đã được Bộ NN&PTNT

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

cơng nhận là giống tiến bộ kỹ thuật thích hợp với điều kiện lập địa ở vùng đất đồi
nghèo dinh dưỡng có thể cho năng suất gấp 2-4 lần so với lồi bố mẹ (Lê Đình Khả,

1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp

Nguyễn Việt Cường, 2001). Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô những

Giống lai là giống được tạo ra do lai tự nhiên hoặc lai nhân tạo giữa các cá thể

giống lai mới được chọn tạo này có ý nghĩa rất lớn để sớm đưa vào sản xuất trên diện

có kiểu gen (genotype) khác nhau. Giống lai thường có năng suất cao và có tính

rộng mà vẫn giữ được các đặc tính ưu việt của chúng.

chống chịu với các điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ. Vì thế, tạo và sử dụng giống lai

Để hạn chế lây lan của dịch bệnh có thể xảy ra thì một trong những biện

đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà chọn giống nông lâm nghiệp trên thế

pháp kỹ thuật là trồng hỗn loài các dịng vơ tính khác nhau. Ở Nước ta hiện nay có

giới (Lê Đình Khả, 2006).

khoảng 12 dịng Bạch đàn đã được Bộ NN&PTNT công nhận và cho phép trồng

1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp

rừng sản xuất, trong khi đó mới có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 là những dòng đã

Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture). Vi nhân giống

được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống

(micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các

bằng phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng.

bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân

Hiện nay, nhu cầu cây giống Bạch đàn có năng suất cao và đã qua khảo

giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để ni cấy có

nghiệm, cũng như của hai dòng này nhằm phục vụ trồng rừng khá lớn. Thời gian

thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ

qua Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp đã thử

cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) vv. (Isikawa và cs, 1996, Preece, 1997, Tripepi,

nghiệm áp dụng quy trình nhân giống ni cấy mơ hai dịng UE35 và UE56 và đã

1997, Merkle, 1997, Nguyễn Đức Thành, 2000). Song ni cấy mơ cho chồi bên và

có kết quả bước đầu. Việc nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để

chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) là những phương pháp chính được dùng

hồn thiện cơng nghệ và phục vụ sản xuất giống là rất cần thiết. Từ những đặc

trong nhân giống cây rừng mà không đề cập các nội dung khác.

điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ni cấy mơ thường được trẻ hố cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt,

“Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus

thậm chí khơng có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom

urophyla và E. exserta bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô”. Đây cũng là một phần

lại thường khơng có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt

kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch

và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ:

đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế

cây mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai

bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng

tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại

thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện.

có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của
giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và khơng có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ
hố bị hạn chế, cịn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế ni cấy mơ cịn
là biện pháp trẻ hố giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dầu ni cấy mơ địi hỏi


4

5

kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối

Phân hoá tế bào là sự chuyển hố các tế bào phơi sinh thành các tế bào của

hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến

mơ chun hố, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân

trong sản xuất lâm nghiệp.

hố có thể diễn như sau:

Tuy vậy, tính trẻ hố của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt,

Tế bào phơi sinh

Tế bào dẫn

Tế bào phân hố chức năng

Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hố của cây mơ, cây

Khi tế bào đã phân hố thành mơ chức năng, chúng khơng hồn tồn mất khả

hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy

năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng

rằng sau 1 tháng cây ni cấy mơ có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau

lại có thể trở về dạng giống như tế bào phơi sinh và tiếp tục thực hiện q trình phân

4-8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của

hố, q trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào.

cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt
nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ
Phân hố

cây ni cấy mơ tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành
của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hố) song khơng
thể trẻ như cây mọc từ hạt.

Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyển hoá

1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp ni cấy mơ tế bào
1.3.1. Tính tồn năng của tế bào thực vật

Phản phân hoá

Nguyên lý cơ bản của nhân giống ni cấy mơ tế bào là tính tồn năng của tế
bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang tồn bộ lượng thơng

Về bản chất thì sự phân hố và phản phân hố là một q trình hoạt hố phân

tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó cịn gọi là bộ gen (genom). Đặc

hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá thể, có một số gen

tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của q trình

được hoạt hố để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động.

phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen

Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân

của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều

tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi

kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
mới hồn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ.
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ là kết quả phân hoá và phản
phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực
hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mơ có được cấu trúc chun mơn hố nhất
định nhờ vào sự phân hố.

các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen
được hoạt hố, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định
sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994).
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của q trình phân hố và phản phân hố tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực
vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định
hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính tồn năng


6

7

của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy, người ta

+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp

thường bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực

để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng

vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường

hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh,

khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở

1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp

sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường ni cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA,

mơ tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài

IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh

ra nó đóng vai trị là chất thẩm thấu chính của mơi trường. Người ta thường sử dụng

hình thái của mơ ni cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mơ ni

2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994).

cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo

+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào lồi cây và trạng thái phát triển

(callus).

mơ. Thơng thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN 4+ và

1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới q trình nhân giống bằng ni cấy mơ tế bào

NO3- (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá

hơn so với NH4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” mơi trường vì

trình này có thể chia thành các nhân tố sau:

vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng

1.4.1. Môi trường nuôi cấy

rãi nhất.

Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được

+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,

xem là vấn để quyết định sự thành bại của q trình ni cấy. Mơi trường ni cấy

Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này

được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng

được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các ngun tố này có chức

trưởng và phân hố mơ trong suốt q trình ni cấy in vitro. Cho đến nay, đã có

năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu

nhiều mơi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ

trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với mơi trường

thuộc vào đối tượng và mục đích ni cấy. Vấn đề lựa chọn mơi trường thích hợp

được thuận lợi.

cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nơi cấy mơ là rất

Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể

quan trọng. Mơi trường ni cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối

lựa chọn sử dụng. Nói chung, mơi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình

khống đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hồ sinh

thành chồi, cịn mơi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn.

trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước

Thành phần khống của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng

dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ

nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l).

thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn

Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất

đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng

khó địi hỏi người làm cơng tác ni cấy mơ phải có những hiểu biết cơ bản về sinh

giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất

lý thực vật đối với dinh dưỡng khống.

phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
Mơi trường ni cấy bao gồm thành phần sau:

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố
rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng


8

9

vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp

+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA

hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình

(Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin

thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993).

thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hố rễ, hình thành mơ sẹo,

+ Các vitamin: Mặc dù cây ni cấy mơ có thể tự tổng hợp được Vitamin,

kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993).

nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu

+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân

một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo

chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp

từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là

chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6-

những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ

Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì

thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994).

Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành

+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết

rẻ. Tuỳ vào từng hệ mơ và mục đích ni cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các

nấm men, cà rốt, chối, khoai tây... được bổ sung vào mơi trường có tác dụng kích

nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10 -7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự

thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy

phân bào, ở nồng độ 10 -6- 10-5M chúng kích thích sự phân hố chồi. Trong nuôi cấy

mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in

mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10-

vitro. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và

6

- 10-4 (Lê Văn Chi, 1992).

DNA. Đặc biệt trong nước dừa cịn có chứa những hợp chất quan trọng cho ni

+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan

cấy mơ như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của

trọng nhất là GA3 (Gibberellin acid 3). GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các

Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993).

loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 cịn có tác

+ Chất làm đơng cứng mơi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của

dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ

tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thống khí của mơi trường thạch có

(Street, 1973). Ngồi ra, có cịn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số

ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong

thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây.

khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu ni cấy.
1.4.2. Các chất điều hồ sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hồ sinh trưởng và phát triển
của thực vật. Chúng đóng vai trị quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển

+ Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được
dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mơ ni cấy,
khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (lê
Văn Chi, 1992).

của thực vật như: phân chia, biệt hố tế bào… ngồi ra cịn có ảnh hưởng đến q

+ Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở

trình lão hố mơ và nhiều q trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5

giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một

nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan

số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường

trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả ni cấy.

hợp nó lại kìm hãm q trình này (Nguyễn Văn Uyên, 1993).


10

11

Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của mơi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ

tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí cịn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì

nét tới khả năng hồ tan các chất khống trong mơi trường. Sự ổn định của mơi

hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Cịn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào khơng

trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây. Nếu pH thấp (<4,5) hặc (>7,0)

có tổ chức. Trong ni cấy mơ, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ

đều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Nên việc xác

25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C.

định được độ pH ban đầu của mơi trường cho q trình sinh trưởng và phát triển của

+ Độ ẩm: Trong các bình ni cấy thì độ ẩm tương đối ln bằng 100% nên

mô cấy là cần thiết. Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mơ.

nói chung từ 5,6 - 6.

1.4.4. Vật liệu ni cấy

1.4.3. Môi trường vật lý

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân

Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của mơi trường vật lý được quan tâm đó
là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.

giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mơ chun hố đều có tính tồn
năng, nghĩa là đều có thể ni cấy thành cơng. Thực tế cho thấy các lồi tế bào và các

+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái

loại mơ khác nhau có mức độ ni cấy thành cơng khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản

của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thơng qua thời gian chiếu

trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu ni cấy càng non thì khả năng

sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.

nuôi cấy thành công càng cao. Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi

Thời gian chiếu sáng có vai trị quan trọng trong q trình phát triển của mơ
ni cấy. Với đa số các lồi cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày.

đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non,
tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai

Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy.
Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mơ sẹo trong khi cường độ thấp
gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp
cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974).

đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995).
1.4.5. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của q trình ni
cấy in vitro. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu ni cấy hoặc mơi

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng

trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị

cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy. Ánh sáng đỏ làm

ngừng lại. Do đó, trong tồn bộ q trình ni cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô

tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, cịn ánh sáng xanh thì ức

trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng

chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mơ sẹo.

mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn ni cấy vơ trùng.

Chính vì vậy mà trong phịng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn
huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux.

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, mơi trường dinh dưỡng
thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh.

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các q
trình trao đổi chất của mơ ni cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của
Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên
0

0

0

0

cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 20 C/15 C hoặc 20 C/18 C

Phương tiện khử trùng
 Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ
ni cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm, 120 -1300C).

12

13

 Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

động trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hố vật

 Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường

liệu giống.

sử dụng các dung dịch như HgCl2 (clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit
natri), Ca (0Cl)2 (Hypoclorit canxi), H202 (ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng
để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi ni cấy.

1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mơ ni cấy. Khi đã
có nguồn ngun liệu ni cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều

 Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở

kiện vô trùng. Người ta thường dùng một hoá chất như HgCl2, Ca(0Cl)2, Na0Cl,

nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng.

H202, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất,

Hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích

nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về ngun tắc, mơ ni cấy có thể là bất

lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền

kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa, quả…) nhưng theo Blatt thì mơ lấy từ các

phù tế bào.

phần non của cây có khả năng ni cấy thành cơng cao hơn mô lấy từ các bộ phận

 Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải
được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp

trưởng thành khác (Blat K. M. and Hwanok Ma, 2004). Vì vậy, người ta thường lấy
chồi đỉnh hay chồi nách để ni cấy in vitro.
Ngồi ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp

chiếu đèn tử ngoại.
 Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị

thì độ trẻ hố cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh

này làm việc theo nguyên tắc lọc khơng khí vơ trùng qua màng và thổi khơng

của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anoleson, 1980). Đối

khí vơ trùng về phía người ngồi thao tác.

với mẫu dễ bị hố nâu khi ni cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin

pyrroline (PVP) vào mơi trường (Lê Đình Khả, 1999). Giai đoạn này cần đảm bảo

1.4.6. Buồng nuôi cấy
Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải

các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết
quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy

đảm bảo các điều kiện:
-

Nhiệt độ: 25 - 30 C

mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần.

-

Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.

1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh

0

Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài.

Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các

1.5. Các giai đoạn chính trong q trình nhân giống

phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn

1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị

then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các

5-50 lần tuỳ thuộc vào lồi cây, mơi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Trong

bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để ni cấy.

giai đoạn này vai trị của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ

Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với mơi

quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất

trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ

di truyền của cây. Theo ngun tắc chung thì mơi trường có nhiều Kitocinin sẽ kích
thích tạo chồi. Chế độ ni thường là 25-270C và 10-16h/ngày, cường độ chiếu sáng


14

15

1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con tối đa trong thời

đã cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92%) ở các dòng Keo lai BV10, BV29, BV32 và BV33.

gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây.

Nồng độ cho tỷ lệ ra rễ cao ở dòng BV16 (65%) và BV5 (50%) là 1ppm của IBA.

1.5.4. Tạo cây hồn chỉnh (ra rễ)

Đồng thời đưa cây ni cấy mơ ra rễ trực tiếp (bằng cách chấm thuốc bột TTG1)

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngồi hệ thống vơ trùng khi
đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi

với giá thể cát sông thực hiện thành công cho cây Lát hoa, Keo lai (Đoàn Thị Mai
và cs, 2000, 2006,2008).

trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây

Tuy vậy, kết quả xử lý ra rễ cho cây mô bằng thuốc bột TTG1 1,0% trên mơi

hồn chỉnh. Mơi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine

trường cát sơng do Lê Đình Khả cùng kỹ sư lâm nghiệp Malaysia thực hiện tại tập

để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Người ta thường dùng các chất NAA

đoàn sản xuất gỗ dán Ta Ann ở Sarawak (Malaysia) vào ngày 1 tháng 12 năm 1999

(Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở

và kiểm tra vào ngày 6 tháng 1 năm 2000 đã thấy các dòng BV5, BV10, BV16,

nồng độ 1mg/l - 5mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang
mơi trường Auxin để rễ phát triển.
Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động
của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng.
1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con trong ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngồi trời. Cây mơ được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng,
nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột
làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn
nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngồi giá thể. Giá thể tiếp nhận cây
in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây mới
đưa từ bình ni ra, cần duy trì độ ẩm >50% để cây con không mất nước và làm
giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau 2-3 ngày đưa ra ngồi cây mơ sẽ sinh

BV32 và BV33 đều có tỷ lệ ra rễ 100%, dịng BV29 có tỷ lệ ra rễ thấp nhất cũng đạt
86,7% đến ngày 24 tháng 1 (gần 2 tháng sau khi cấy giâm) vẫn giữ được tỷ lệ sống
là 81- 100% (với tỷ lệ chung là 91,51%) (Anken, 2000). Điều đó cho thấy khi giâm
trên môi trường cát sông. IBA được sử dụng ở dạng thuốc bột TTG1 1% là chất
kích thích có hiệu quả ra rễ cao nhất đối với các dòng keo lai đã được đánh giá và
lựa chọn (Lê Đình Khả và các cộng tác viên, 2003).
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngồi
trời. Cây mơ được chuyển từ mơi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng nên
phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm
cho cây có thể bị sốc hoặc bị chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt được tiêu chuẩn
về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngồi giá thể. Giá thể tiếp nhận cây ni cấy
mơ phải đảm bảo tơi, xốp, thống nước và sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây khi mới
đưa cây từ bình ni ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nước và

trưởng ổn định, chăm sóc cây mơ tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.

làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau 2-3 tuần đưa ra ngồi cây mơ sẽ

Đối với ni cấy mơ, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu của viện

sinh trưởng ổn định, chăm sóc cây mơ tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc

khoa học Lâm nghiệp Việt Nam là Đoàn Thị Mai và cs đã sử dụng chất kích thích

cây từ hạt.

ra rễ IBA, IAA và NAA ở các nông độ khác nhau (để bổ sung cho môi trường MS)

Tóm lại, q trình nhân giống in vitro có thể được chia thành các giai đoạn

và đã thấy rằng khi dùng IBA ở nồng độ 2 mg/l đối với ra rễ chồi trong ống nghiệm,

như trên nhưng kết quả của mỗi giai đoạn khơng tách biệt nhau mà có sự kế thừa

còn ra rễ trực tiếp bằng cách ngâm và chấm dung dịch ra rễ sử sụng nồng độ 3 ppm

của giai đoạn trước. Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị mơi trường là


16

17

đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hưởng xuyên suốt và quyết định sự thành

Bạch đàn E. urophylla có thể mọc lẫn với Bạch đàn E. alba (Martin and Cossalater,

cơng hay thất bại của q trình nhân giống.

1975 - 1976). Bạch đàn urơ là cây thích hợp với các lập địa có đất sâu ẩm ở các tỉnh

1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta)

miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng

1.6.1. Bạch đàn urơ (Eucalyptus urophylla)

trung tâm miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Nguyễn Dương Tài, 1994; Lê

Eucalyptus urophylla lồi có phân bố tự nhiên ở một số đảo của phần cực

Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một trong những suất xứ có triển vọng nhất ở

Nam của quần đảo Santo - Indonesia, bao gồm các đảo: Adonara, Alor, Flores,

Mang Linh và Lang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 1996, Phạm Văn Tuấn và

0

Lomblen, Pantar Timor và Wetar. Tại đây E. urophylla xuất hiện theo dải 7 30’ 0

10 vĩ độ Nam. Giới hạn phía Đơng và phía Tây của vùng phân bố chưa xác định rõ
ràng. Hiện nay người ta chấp nhận vùng phân bố của loài Bạch đàn này là từ 122 -

cs, 2001).
1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta)
Bạch đàn liễu (E. exserta) là loài cây gỗ nhỡ đến gỗ lớn khi mọc trên những

127 kinh Đông. Trong khu vực phân bố, Bạch đàn E. urophylla sống từ vùng bán

nơi đất tốt và lượng mưa cao có thể cao đến 25m, đường kính 60 cm - 1m ở những

sơn địa tới vùng núi, nhưng cũng thấy có hiện tượng xuất hiện lồi này ở vĩ độ thấp.

nơi khơ cạn thì cao đến 10-15m và chiều dài đoạn thân dưới cành ngắn, dưới 1/2

Đây là lồi có phân bố khá đặc biệt và đáng nhớ nhất về độ cao và nhiệt độ.

chiều cao của đoạn thân (Bolandetal, 2006) trong khoảng 1500m dọc bờ biển Bạch

E. urophylla có phân bố theo độ cao lớn nhất trong số các loài Bạch đàn (79 - 2960

đàn liễu có phân bố tự nhiên ở phía Đơng bang Queenland đến phía Bắc của

m trên mặt biển). Do thay đổi về độ cao nên biến động về nhiệt độ cũng vì thế mà

Newsouth Wale trong khoảng 1500km từ 140-260 vĩ độ Nam và 1400- 1550 kinh độ

khá lớn. Trên cùng một đảo với khoảng cách không thấy xa nhau mà các quần thụ

Đông dọc theo bờ biển.

0

0

phải thích nghi với các điều kiện nhiệt độ rất khác nhau, từ 27 - 30 C trên độ cao
0

400m xuống 17 - 21 C trên độ cao 1900m.

Đây là lồi có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện khí hậu và đất đai
khác nhau, từ vùng đất thấp ven biển, đất xấu, đất dốc ngèo dinh dưỡng, vùng đất

Trên đảo Timor từ độ cao 1000m trở lên, ngồi lượng mưa cao (1300 - 2200 mm)

đồi, có thể sống trên đất cát nghèo dinh dưỡng, trên đất đồi trơ sỏi đá và trên đất thịt

còn thấy cả sương mù thường xuyên. Mặc dù phạm vi phân bố hẹp song loài bạch

nặng. Song sinh trưởng tốt nhất trên đất bồi tụ, giàu dinh dưỡng. Bạch đàn liễu sinh

đàn này vẫn có lượng biến dị di truyền lớn theo độ cao được thể hiện qua các xuất

trưởng ở độ cao gần mặt biển đến 900m trên mặt biển, từ nhiệt độ 2-160C của tháng

xứ của loài ở nhiều nước (Nguyễn Hồng Nghĩa, 2000).

lạnh nhất nhiệt độ tối cao trung bình của tháng nóng nhất 26-360C.

Bạch đàn là nhóm cây được trồng rộng rãi ở nước ta (đặc biệt là các tỉnh

Bạch đàn liễu có gỗ lõi màu đỏ nâu, có vân đẹp và có độ bền lớn có khối

miền Trung và miền Nam) để cung cấp nguyên liệu giấy và ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ

lượng riêng 905-1000kg/m3 (Boland et al, 2006).

xây dựng và củi đun. Đây cũng là cây trồng chủ yếu trên các đường nông thôn, các

1.6.3. Bạch đàn lai

bờ vùng, bờ thửa ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng Sông Cửu Long. Kết quả

Giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn caman (Eucalyptus camaldulensis) với

nghiên cứu và gây trồng nhiều năm qua cho thấy nhiều loài Bạch đàn được nhập vào

Bạch đàn đỏ (E. robusta) đã được Lê Đình Khả phát hiện 1970 tại các rừng trồng

nước ta chỉ một số lồi sinh trưởng nhanh và có khả năng thích ứng lớn. Trong đó,

Bạch đàn caman (E. camaldulensis) tại các tỉnh Nghệ An, Quảng Ninh, Phú Thọ,

đáng chú ý là các loài Bạch đàn uro (E. urophylla), Bạch đàn tere (E. tereticornis) và

Thái Nguyên, với tỷ lệ 2-3%. Giống lai có hình thái thân cây, vỏ cây, lá, hoa, quả và

Bạch đàn caman (E. camaldulensis), Bạch đàn liễu (E. exserta). Ở những nơi thấp

giải phẫu như chiều dày lá, số lượng và kích thước tế bào khí khổng, chiều dày vỏ


18

19

hạt, chiều dày lá mầm, khối lượng 1000 hạt, v.v… Thể hiện tính trung gian giữa hai

Flores của E. urophylla (xuất xứ tốt nhất) về thể tích lá 51,3 - 247,4% (có thể tích

lồi bố mẹ, đồng thời có sinh trưởng nhanh hơn rõ rệt so với các loài cây bố mẹ. Ở

thân cây gấp 1,5 - 3,5 lần giống sản xuất tốt nhất). Năm 2001 Bộ NN&PTNT đã có

giai đoạn 7 tuổi Bạch đàn lai có đường kính 9,9 - 14,4 cm, chiều cao 5,1 - 11,4 m,

quyết định số 4356 (ngày 19/9) công nhận 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai U 29E1,

thì Bạch đàn đỏ có đường kính là 4,3 - 9,7 cm, chiều cao 3,4 - 6,9 m; còn Bạch đàn

U29E2, U29C3, U29C4, U29U4, U29U26, U15C4, U30E5 (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt

caman có các chỉ tiêu này tương ứng là 1,8 - 6,3 cm và 3,1 - 7,4 m (Lê Đình Khả,

Cường, 2001). Các giống lai này đã được Nguyễn Việt Cường và cs (2007, 2008)

1970), nghĩa là giống Bạch đàn lai tự nhiên này có thể tích thân cây gấp 4 - 5 lần

tiếp tục khảo nghiệm ở một số nơi từ đó đã chọn được các dịng vơ tính sinh trưởng

các lồi cây bố mẹ.

nhanh đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống quốc gia hoặc giống tiến bộ kỹ

Điều thú vị là ngay từ khi phát hiện ra đời F2 của Bạch đàn lai tự nhiên có
n

thuật.

hiện tượng phân ly theo kiểu nhị hạng thức bậc n dạng (a + b) , theo 5 dạng khác

Khảo nghiệm tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy các dòng Bạch đàn lai được

nhau với tỷ lệ phân ly theo phần trăm là 1,7: 14,0: 58,4: 8,3: 1,0 mà cây lai F2 thiên

chọn có một số dòng sinh trưởng vượt trội rõ rệt so với các dòng đối chứng như:

về hệ mẹ là Bạch đàn caman (Lê Đình Khả, 1970).

U6, GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc

Đáng tiếc trong thời kỳ này do chưa có kỹ thuật giâm hom thích hợp nên

biệt là các dịng U29E1.24, U29E2.5, U15E4.83. Những dịng này có chỉ số thể tích (Iv

Bạch đàn lai đã không được phát triển vào sản xuất ở Việt Nam. Một số nơi đã thử

= D2H) bằng 70,4 - 73,9, trong khi dòng Bạch đàn GU8 có chỉ số thể tích 50,3, cịn

xây dựng vườn giống bằng cây ghép song cũng khơng thành cơng.

các dịng khác như PN2, PN14 và U6 có chỉ số thể tích thân cây là 23,5 - 31,7 (Lê

Lai nhân tạo cho các lồi Bạch đàn E. urophylla, E. exserta và E.

Đình Khả et al, 2003).

camaldulensis ở Việt Nam đã được trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thực hiện

Một số tổ hợp lai khác loài mới giữa các loài E. tereticornis (T), E. pellita

từ năm 1997. Đến năm 2000 hơn 60 tổ hợp lai giữa 3 lồi nói trên đã được tạo ra,

(P), E. camandulensis (C) và E. urophylla (U) được tạo ra sau này và khảo nghiệm

trong đó một số dòng hoặc tổ hợp lai sinh trưởng gấp 1,5 - 2 lần bố mẹ.

tại Minh Đức (tỉnh Bình Dương) cũng thấy rằng sau 2 năm các tổ hợp lai T1P17,

Một bộ giống gồm nhiều tổ hợp lai khác loài UC, UE, EU, UC, và UU đã

C1P17, P18U29C3, v.v… có thể đạt thể tích thân cây 21,8 - 26,1 dm3/cây, trong lúc

được khảo nghiệm so sánh với các xuất xứ tốt nhất của các loài bố mẹ như U Egon,

giống U29 có thể tích thân cây 9,7 dm3/cây, một số giống sinh trưởng kém nhất

U27, U28, U29, E1, E2, E4. Khảo nghiệm được tiến hành tại Thụy Phương (Hà Nội),

trong khảo nghiệm chỉ đạt 6,8 - 8,5 dm3/cây (Nguyễn Việt Cường, 2006).

Cẩm Quỳ (Hà Tây) và một số vùng khác trong nước.

Theo quy trình trồng Bạch đàn urophylla của ta (04-TCN-26-2001) quy định

Khảo nghiệm đã cho thấy lai thuận nghịch ở những điều kiện lập địa khác

mật độ trồng rừng là 1100 - 1660 cây/ha. Song kết quả nghiên cứu của Stape C.R.,

nhau, sinh trưởng của các tổ hợp lai cũng thay đổi theo từng điều kiện lập địa. Ví

C.R. Silva (2007) cho nhiều công thức mật độ trồng Bạch đàn khác nhau tại Brazin

dụ, ở Thụy Phương tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất là giống Bạch đàn urơ với

đã thấy là mật độ 500-900 cây/ha chưa cho năng suất cao, mật độ 1500 cây/ha bắt

Bạch đàn caman. Trong khi ở Ba Vì các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất lại là

đầu có năng suất cao, những mật độ khác năng suất tăng lên không đáng kể. Vì thế

giữa Bạch đàn urơ và Bạch đàn liễu (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2002).

với Bạch đàn chúng tơi chỉ dùng một mật độ trồng 1660 cây/ha với các công thức

Sau khi đã tạo được tổ hợp lai và khảo nghiệm giống lai đã chọn lọc được
một số cây trội trong các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất, vượt xuất xứ Egon

bón phân khác nhau.


20

21

Bạch đàn cao sản đang được sử dụng rộng rãi trong trồng rừng nguyên liệu,

chồi/cụm. Bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau đều cho số chồi ít hơn, còn Kn

tuy vậy số giống thực sự được đưa vào sản xuất chưa nhiều, một số ít giống có biểu

hoặc BAP + Kn đều cho hệ quả thấp. Ví dụ: BAP + 0,1mg/l Kn thì cơng thức cao

hiện bị bệnh, một số khác năng suất chưa cao, kỹ thuật nhân giống hàng loạt cịn

nhất chỉ đạt 8,3 chồi/cụm.

gặp khó khăn. Vì thế việc chọn tạo thêm, nhân giống và khảo nghiệm giống và kỹ
thuật trồng thâm canh vẫn còn rất cần thiết.

Nhân chồi Bạch đàn cao 2,5 - 3cm trong mơi trường ra rễ là MS có bổ sung
1mg/l IBA có thể đạt tỷ lệ ra rễ 83,8% bổ sung IBA ở các nồng độ thấp hơn đều có

Ngồi ra tái tổ hợp trong biến dị di truyền đã được các nhà di truyền học phát

tỷ lệ ra rễ thấp. Khi bổ sung NAA thì tỷ lệ ra rễ cao nhất cũng chỉ đạt 51% (nồng độ

hiện từ những năm đầu thế kỷ 20 (Williams, 1964; Lobasev, 1969; Muntring, 1967),

1mg/l MS). Cây mô đã ra rễ được cấy vào bầu gồm 94% đất đồi + 5% phân chuồng

song đến nay việc áp dụng lý thuyết tái tổ hợp mới chỉ dừng lại ở một số loài cây

hoai mục + 1% NPK sau 3 tháng có tỷ lệ sống 76-83%.

nơng nghiệp cịn trong lâm nghiệp là hồn tồn mới.

1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn

1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô

1.7.1. Trên thế giới

Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho giống lai giữa Bạch đàn trắng đã được

Bạch đàn lai tự nhiên đã được phát hiện những năm 1950 giữa Eucalyptus

Nguyễn Ngọc Tân và cs (1997) thực hiện thành công từ năm 1993 thấy rằng dùng

pausiflora với E. dives (Fryor, 1950), trong những năm sau này các giống lai tự

BAP thêm vào mơi trường MS có thể tạo được 20-30 chồi trên hom. Môi trường

nhiên đã được phát hiện giữa E. camandulensis và E. tereticornis với tên gọi là E.

MS + IBA có thể đạt tỉ lệ ra rễ 80%.

hybrid ở Ấn Độ (cuối những năm 1970) và giống lai giữa E. grandis với E.

Giống lai được sử dụng để nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô là

urophylla ở Brazil vào đầu những năm 1980. Giống lai tự nhiên cũng được phát

U29C3. Nghiên cứu do nhóm Đồn Thị Mai (2000) thực hiện bằng cách lấy chồi non

hiện giữa E. obliqua với E. pulchella ở Tasmania (Potts, Reid, 1983). Nhờ chọn lọc

của cây hơn 3 tháng tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy khử trùng mẫu vật trong

và khảo nghiệm giống mà nhiều giống lai có năng suất cao đã được đưa vào sản

HgCl2 nồng độ 0,1% cho chồi đoạn 2 trong thời gian 8 phút có hiệu quả cao nhất,

xuất trên quy mơ lớn.

cịn Ca(OCl)2 có hiệu quả rất thấp. Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu (bằng tích của tỷ lệ mẫu

Lai giống Bạch đàn đã được nhiều nước quan tâm từ cuối những năm 1960.

không nhiễm với tỷ lệ mẫu nẩy chồi) ở đoạn 2 là 48,0% (thời gian 8 phút), còn chồi

Phương pháp lai giống Bạch đàn cũng được giới thiệu áp dụng trong các nước

đoạn một là 14,8-22,2% (thời gian 8-10 phút). Còn xử lý bằng Ca(OCl)2 10% đối

(Moncur, 1995). Nhiều tổ hợp lai khác loài mà E. grandis và E. urophylla được

với đoạn chồi 1 và chồi 2 có tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cao nhất là 10,8% và 7,3%.

dùng làm cây mẹ đã được tạo ra. Theo Martin (1989) thì đến năm 1989 đã có hơn

Nghiên cứu cho thấy từ tháng 5-8 là thời kỳ khử trùng có hiệu quả nhất (mẫu

20 tổ hợp lai khác loài được tạo ra ở chi Bạch đàn, trong đó chủ yếu là nhóm E.

ít bị nhiễm, có tỷ lệ bật chồi cao nhất), thời gian bật chồi khoảng 20 ngày, các tháng

grandis và E. urophylla được dùng làm cây mẹ. Còn theo Shuxiong (1989) thì từ

khác cho hiệu quả thấp hơn, thời gian bật chồi lâu hơn (khoảng 30 ngày).

năm 1975 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã tạo được một

Chồi Bạch đàn lai sau khi khử trùng và rửa sạch cấy chuyển vào mơi trường
nhân chồi MS có bổ sung BAP và Kn phối hợp hai chất này ở các nồng độ khác

số tổ hợp lai E. saligna x E. exserta, trong đó một số cá thể của cây lai có thể tích
thân cây vượt E. exserta đến 82%.

nhau, cơng thức bổ sung cho thấy tăng hệ số nhân chồi rõ rệt. Với BAP 0,5 mg/l

Từ năm 1989 Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra 204 cây

MS đạt số chồi trong cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm), cá biệt có cụm lên đến 20-30

lai (khơng phải tổ hợp lai) giữa E. urophylla với E. tereticornis, E. camaldulensis.


22

23

E. exserta, E. grandis, E. saligna và E. pellita, trong đó một số cá thể cây lai E.

và Nam Phi đã tạo được các rừng trồng có năng suất 30-50 m3/ha/năm (Stape, da

urophylla x E. tereticornis và E. urophylla x E. camaldulensis đã có ưu thế lai rõ rệt

Silva, 2007).

về sinh trưởng so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ tương ứng là
120,7% và 89,4% (Xing & Wang, 1996; Shen Xihuan, 2000).
Các tổ hợp lai thuận nghịch giữa E. urophylla và E. grandis đã được tạo ra ở
Trung Quốc (Wang & Yang, 1996, Rezede Gabriel & Rezende Marcos, 2000). Ở

Điều đó cho thấy lai giống, khảo nghiệm giống và nhân giống là những khâu
không thể thiếu khi phát triển các giống lai cho Keo lai và Bạch đàn lai. Đây là một
hướng đi đang được các nhà lâm nghiệp ở nhiều nước trên thế giới áp dụng có kết
quả để tạo ra các giống lai có năng suất cao (Lê Đình Khả, 2008).

Brazin và Indonesia (Hardlyanto & Tridasa, 2000). Một loạt tổ hợp lai giữa các loài

Số lượng các loài Bạch đàn đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy

E. alba, E. camaldulensis, E. microtheca, E. terericornis, E. polycarpa và

mô ngày càng tăng, đến năm 1987 đã có trên 20 lồi Bạch đàn khác nhau được nuôi

E.torelliana cũng được tạo ở Ấn Độ trong các năm 1991 - 1999 (Paramathma,

cấy thành công. Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cấy mô từ các

Surendran, 2000). Sau này nhiều giống lai khác loài giữa E. grandis và E. urophylla,

cây chội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. tereticornis, E. globulus, E.

giữa E. urophylla và E. tereticornis, E. camaldulensis, E. exserta, E. grandis, E.

torelliana. Cây mơ có nguồn gốc từ cây ưu việt sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và

saligna và E. pellita đã được khảo nghiệm, từ đó đã chọn được những giống lai có ưu

đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Australia, nhân giống nuôi

thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ và có tính chống chịu gió, được sử dụng cho

cấy mơ đã được áp dụng để nhân nhanh cho các cây được chọn cho tính chịu mặn

các chương trình trồng rừng ở Trung Quốc (Bai Jiayu et al, 2003). Các giống lai trong

trong đất và đang được sản xuất với quy mơ lớn cho lồi E. camandulensis.

lồi Bạch đàn caman cũng đang được trồng có kết quả ở ThaiLand.

Trung Quốc là một nước thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mơ cho các lồi

Nghiên cứu của Glori (1993) ở Philippin cho thấy trong các giống giữa các

cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 lồi cây thân gỗ được ni cấy như Dương, Bạch

lồi Bạch đàn E. pellita, E. deglupta và E. urophylla sau 4 năm trồng các tổ hợp lai

đàn, Tếch, Bao đồng (cây Hông). Là một trong những nước ứng dụng sớm và thành

E. deglupta x E. pellita và E. pellita x E. urophylla đều có thể tích thân cây cao hơn

cơng ni cấy mơ vào trồng rừng trên diện rộng. đến năm 1991 ở vùng Nam Trung

các loài cây bố mẹ. Lai thuận nghịch và tế bào chất có ảnh hưởng rất lớn đến ưu thế

Quốc, người ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai được chọn lọc.

lai, vì thế có vai trị quan trọng trong chọn giống cây rừng.

Những cây mô này được dùng như là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn

Tuy vậy trong một số trưởng hợp cây lai F1 E. grandis x E. dunii sau 4 năm
3

chỉ có thể tích thân cây 52 dm /cây, cịn thể tích thân cây của mẹ và bố tương ứng là
261 dm3/cây và 132 dm3/cây (de Asiss, 2000).

ươm địa phương và dùng thẳng vào trồng rừng (Nguyễn Quang Thạch, 2000).
Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống được áp
dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng

Chương trình cải thiện giống cho E. pellita dựa trên lai thuận nghịch cũng

dòng vơ tính. Một số lồi Thơng đã được ni cấy thành cơng đó là: Pinus nigra, P.

được thực hiện tại Pointe Noire ở Công Gô. Sinh trưởng của những cá thể tốt nhất

caribaea, P. pinaster… Có tới 30 lồi trong số lồi cây lá kim được nghiên cứu ni

của các tổ hợp lai xa khác loài đã vượt trội (superior) các xuất xứ của lồi thuần

cấy mơ đã đạt được những thành cơng bước đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách

(loài bố mẹ) (Harwood, 1998).

tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh (Nguyễn Quang

Nhờ sử dụng giống lai được đánh giá qua khảo nghiệm giống và áp dụng các

Thạch, 2000)… Trong số 30 loài cây lá kim đã được ni cấy mơ, có 4 lồi được

biện pháp kỹ thuật thâm canh (trong đó có bón phân Kali và vi lượng) mà ở Brazin

đưa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp, Thơng


24

25

P. radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. taera và Pseudotsuga

nhanh chồi là MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo

menziesii ở Mỹ.

rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA.

Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô

Cũng với cây Keo tai tượng, V.J. Hartney và cs thuộc (Division of Forest

tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng mơi trường MS có bổ sung 3%

Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường

Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều

ni cấy được sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM

cao >0,5cm được cấy vào mơi trường tạo rễ và chất điều hồ sinh trưởng tốt nhất

NAA. Nhiệt độ trong q trình ni cấy duy trì ở 250C (± 40C), giai đoạn khử trùng

cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (O. L. Gamborg, G. C. Phillips,

mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng

1997).

trong thời gian 20 phút (sharma, J.K., 1994).
Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cây mô

1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam

và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được áp dụng để

Bạch đàn là một trong các lồi cây trồng rừng chính của Việt Nam, không

tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng

chỉ đối với trồng rừng tập trung mà còn cả đối với trồng cây phân tán, trồng cây

rừng (Nguyên Quang Thạch, 2000).

trong các hộ gia đình.

Các biện pháp ni cấy mơ cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona

Cho tới trước những năm 1970 đã có trên 50 lồi Bạch đàn được khảo

grandis). Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt

nghiệm ở Việt Nam và từ đó đến nay đã có hàng chục loài được khảo nghiệm trên

của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô

diện rộng với khá nhiều xuất xứ làm cơ sở cho chọn loài và xuất xứ sinh trưởng

từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm. Kaosaard

nhanh phục vụ trồng rừng đại trà (Lê Đình Khả, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Hoàng

(1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm

Trương, 1993).

1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm

Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn

(Ikemori, Y.K., 1987). Perhutani (Indonesia, 1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô

trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa

thành công đối với lồi Tếch và một vài cây mơ đã được đem trồng thử.

học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh Phú Thọ, Công ty

Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành

giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng

công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên

Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp…

thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến cơng nghệ nhân giống nuôi

Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phịng ni cấy mơ để phục vụ cho

cấy mơ cây Tếch, các dịng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các lồi

cơng tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu.

Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea), Thông Radiata

Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số

(Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P.

giống Bạch đàn nhập nội, các dịng vơ tính Bạch đàn lai và keo lai có năng suất cao.

caribaea x P. elliottii) ở Austraylia… (Dr. Phundan sigh, 2001).

Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã

W.Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R., 1990)
đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân

nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cây mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và một số
cây rừng khác (Lê Đình khả và cs, 2003).


26

27

Ngồi những nghiên cứu ni cấy mơ Keo lai đã được giới thiệu khi tổng kết

Đoàn Thị Mai (2008) đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn

đề tài KH03.03 năm 1996 (Lê Đình Khả, 1996) trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu

dịng UE35 hố chất khử trùng thích hợp là chất kháng sinh với nồng độ 4,5mg/l

của Nguyễn Ngọc Tân Và cs (1996), nhóm nghiên cứu ni cấy mơ (Đồn Thị Mai,

trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và PN3D là mẫu bật chồi đạt

Ngô Thị Minh Duyên, 2000) đã thực hiện một số nghiên cứu bổ sung cho một số

17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian là 12 phút. Mơi trường là MS*

dịng Keo lai đã được đánh giá và thu được một số kết quả như sau: khử trùng mẫu

+ BAP 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l + các phụ gia khác.

vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 2,4,6,8,10,12 phút trong tháng 2, 5, 8, 10 và 12
cho thấy trong 8 - 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng
đến khả năng nẩy chồi là BAP (2ppm) và BAP (2ppm) + Kn (0,05 ppm) và môi
trường MS là công thức cho mẫu vật đẻ chồi nhiều nhất. Ảnh hưởng của chất kích
thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là: IBA (3ppm) cho tỷ
lệ ra rễ cao (80-92) đối với BV10, BV29, BV32, BV33. Nồng độ IBA 1ppm ra rễ
tốt cho dòng BV16 (65%), BV5 (50%).
Dương Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài Bạch
đàn E. camaldulensis và E. urophylla từ cây chội của 2 lồi đã tạo được một số cây
mơ Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2 lần.
Đoàn Thị Mai và cs (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống
Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật
chồi cao nhất là từ tháng 5-8. Mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi
trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm). Mơi trường ra rễ thích hợp là
mơi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8 % (Đồn Thị Mai và
cs, 2000).
Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn
dịng U6 là: mơi trường nhân chồi (MS + 3% đường + 4,5 g/l agar + 0,5 mg/l BAP
+ 0,25 mg/l NAA), môi trường tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đường + 5g/l agar + 1mg/l
IBA).

Đoàn Thị Nga, thuộc viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh - Phú
Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dịng PN2. Tác giả cho rằng, mơi trường
thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA. Môi trường ra rễ tối
ưu là 1/4 MS + 1mg/l IBA.


28

CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

29

2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy)
Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở
chồi 15 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ phần ngọn
non, một phần cuống lá mà tồn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 - 3cm,

2.1. Mục tiêu nghiên cứu
 Xác định mơi trường (hố học và vật lý) phù hợp để nhân giống 2 dòng
UE35 và UE56 của bạch đàn lai giữa (E. urophylla x E. exserta) bằng
phương pháp nuôi cấy mơ.
 Tạo ra cây con hồn chỉnh bằng phương pháp ni cấy mơ cho các dịng
UE35 và dịng UE56.
 Huấn luyện và cấy cây con ra vườn ươm.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu nhân giống cho 2 dòng UE35 và dòng UE56. Hai dòng
này đã được tuyển chọn và trồng khảo nghiệm dịng vơ tính tại trung tâm nghiên
cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam.

2.2.1. Một số đặc điểm chính của dịng UE35 và dòng UE56
Dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 đã được tuyển chọn thơng qua khảo
nghiệm dịng vơ tính và được cho là nhóm có sinh trưởng tương đối nhanh.
2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu
Hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56 là cây trội được chọn từ các tổ hợp lai
U29E2 và U29E4, đây là những tổ hợp lai thuộc nhóm có sinh trưởng nhanh thích hợp
cho trồng rừng trên đất nghèo dinh dưỡng đồi núi miền Bắc. Dòng UE35 được tạo
ra từ đề tài lai giống Bạch đàn (Lê Đình Khả, 2001), đã qua khảo nghiệm giống.
Cây lấy mẫu là cây 1,5 tuổi trồng tại Trung tâm giống cây rừng thuộc viện
khoa học lâm nghiệp Việt Nam và chồi gốc của cây 3 năm trồng thí nghiệm tại Cẩm
Quỳ (Hà Nội) (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) và (Lê Đình Khả, Nguyễn
Việt Cường, Ngơ Minh Chí, 2007).

đường kính từ 2 - 3mm mang từ 2-3 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 - 6. Đề tài tiến
hành nghiên cứu ở phịng thí nghiệm và vườn ươm tại Trung tâm nghiên cứu giống
cây lâm nghiệp thuộc Viện khoa học Việt Nam và khu nuôi cấy mô tế bào - Viện
khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục đích nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau đây:
1. Khử trùng mẫu vật nuôi ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và Ca (0Cl)2
trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra chất khử trùng mẫu thích
hợp.
2. Ni cấy mẫu trong 5 loại mơi trường và xác định mơi trường thích hợp cho
giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi.
3. Thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin B2 tới hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ
chồi hữu hiệu (TLCHH) của quá trình ni cấy.
4. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng
phối hợp của chúng đến HSNC và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH).
5. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng
của chúng đến hiệu quả của giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo

rễ).
6. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.


30

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu giống nuôi cấy mơ hai dịng Bạch đàn
UE35 và UE56
Dịng tuyển chọn

Tạo cây hom

Khử trùng mẫu
(Bằng dung dịch HgCl2 hoặc Ca (ClO)2 hay các hố chất có tính diệt khuẩn khác ở các
nồng độ khác nhau)

Tạo chồi ban đầu
(Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp)

Nhân chồi
(Xác định mơi trường nhân chồi thích hợp được bổ sung các chất kích thích sinh
trưởng như BAP và Kinetin ở các nồng độ khác nhau)

Tạo rễ
(Tạo rễ in-vitro: Xác định môi trường và phương pháp ra rễ hiệu quả)

Vƣờn ƣơm
* Cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần

31

* Tạo và nhân nhanh chồi
Là giai đoạn kích thích mơ cấy phát sinh hình thành nhiều chồi. Vấn đề là
phải xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện ni cấy thích hợp để có hiệu
quả cao nhất.
+ Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành cấy trên các môi trường
khác nhau như WPM, MS, MS* (môi trường MS cải tiến), WV3, Litvay có bổ sung
agar 7 g/l, đường 30 g/l và độ pH của các môi trường được điều chỉnh đến 6.
+ Nhân chồi: trên cơ sở thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử nghiệm
môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh chồi bằng cách thay đổi thành phần
chất khống và sự có mặt của Cytokynin (BAP, Kinetin) riêng rẽ hay phối hợp.
+ Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh
sang mơi trường tạo rễ để có thể hồn chỉnh hoặc có thể ra rễ trực tiếp trên cát trong
nhà kính. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn về chiều cao, chất lượng nuôi cấy trên các
môi trường tạo rễ hoặc cho ra rễ trực tiếp, mục đích là để tìm ra mơi trường thích
hợp để tạo cây con hồn chỉnh. Sau đó cây con được huấn luyện để thích nghi với
điều kiện bên ngoài.
+ Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngồi: Để tìm giá thể thích hợp cho cây
con có tỷ lệ sống cao khi đưa ra ngồi điều kiện tự nhiên tiến hành các thí nghiệm
về thành phần ruột bầu.
2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp
Tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 mơi trường có
bổ sung Sucroser 30g/l, agar 5g/l (khơng bổ sung chất điều hoà sinh trưởng) là:

đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt.

1. Môi trường Litvay (Litvay, 1985) phụ biểu 1 [34]

Khử trùng mẫu bằng chất hố học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua

2. Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) phụ biểu 2 [31]

các bước:

3. Mơi trường MS cải tiến (có bổ sung thêm vitamin và khoáng chất) (Murashige

 Rửa xà phịng lỗng
 Rửa dưới vịi nước chảy
 Tráng nước cất
 Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5 - 15 phút
 Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất từ 3-5 lần
 Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện
trong buồng cấy vô trùng

& Skoog medium including Nitsch vitamin, 1969) phụ biểu 3 [32]
4. Môi trường WPM (Mccown Woody Plant medium, 1980) phụ biểu 4 [20]
5. Môi trường WV3 (Westvaco WV3 medium) phụ biểu 5 [29]
2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu
Kết quả tổng hợp các mùa thí nghiệm khử trùng mẫu cho 2 dòng UE35 và
UE56. Kết quả được tổng hợp dựa trên số liệu thu thập được kế thừa từ cơng trình
“Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn urophyla,


32

33

Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào - chủ nhiệm

CT7

MS* + 1.0 mg/l BAP

đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học

CT8

MS* + 2.0 mg/l BAP

Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện.

CT9

MS* + 3.0 mg/l BAP

2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu

CT10

MS* + 4.0 mg/l BAP

Để xác định vai trò của vitamin B2 đối với sự sinh trưởng và phát triển của
chồi, môi trường nhân chồi có sự bổ sung thêm là MS* + 30g/l đường + 5,5g/l agar,
pH = 6,5 với 5 mức nồng độ như sau:
Bảng 2.1: Công thức ảnh hƣởng của vitamin B2 đến khả năng nhân chồi
Công thức

Thành phần môi trường

ĐC

MS* + 1.0 mg/l B2

CT2

MS* + 2.0 mg/l B2

CT3

MS* + 3.0 mg/l B2

CT4

MS* + 4.0 mg/l B2

CT5

MS* + 5.0 mg/l B2

2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) và
chất lượng chồi (TLCHH)
Các thí nghiệm được sử dụng riêng lẻ một chất điều hoà sinh trưởng hoặc
phối hợp 2 hoặc 3 chất ở các nồng độ khác nhau. Những thí nghiệm được sử dụng
phối hợp thì có những chất được cố định nồng độ, chỉ một chất có nồng độ thay đổi.
Khi đó việc xử lý số liệu được đưa về dạng ảnh hưởng của một nhân tố đến HSNC
và TLCHH.
2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH

Từ môi trường tốt nhất cho nhân chồi ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của
vitamin B2 (MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2) đề tài tiến hành bổ sung
BAP ở các mức nồng độ thay đổi như sau:
Bảng 2.2: Cơng thức thí nghiệm nhân chồi
Cơng thức
ĐC

Thành phần mơi trường
MS*

2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH
Đề tài tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi có sự tương
tác với BAP. Tìm ra mơi trường thích hợp cho nhân chồi của 2 dịng này, đề tài tiến
hành bổ sung IAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường là: MS* + 30g/l
đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP (mơi trường này xác định là mơi trường
có HSNC và TLCHH cao nhất ở thí nghiệm trên), nồng độ IAA thay đổi là:
Bảng 2.3: Cơng thức thí nghiệm nhân chồi
Cơng thức
CT 11
CT 12
CT 13
CT 14
CT 15
CT 16
CT 17
CT 16
CT 19
CT 20
CT 21
CT 22

CT 23
CT 24
CT 25
CT 26
CT 27

Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng
CT
IAA
ĐC
0
0,5 mg/l
1,0 mg/l
MS* + 1 mg/l BAP +
1,5 mg/l
2,0 mg/l
0,5 mg/l
1,0 mg/l
MS* + 2 mg/l BAP +
1,5 mg/l
2,0 mg/l
0,5 mg/l
1,0 mg/l
MS* + 3 mg/l BAP +
1,5 mg/l
2,0 mg/l
0,5 mg/l
1,0 mg/l
MS* + 4 mg/l BAP +
1,5 mg/l

2,0 mg/l

2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH
Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và IAA, đề tài
tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến HSNC và TLCHH


34

35

của 2 dịng nghiên cứu. Mơi trường MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2 +
mg/l BAP + bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau.
Bảng 2.4: Cơng thức thí nghiệm nhân chồi
Cơng

Nồng độ và chất điều hồ sinh trưởng

TLCHH của 2 dịng. Tuy nhiên, để tìm ra mơi trường thích hợp hơn cho nhân nhanh
chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Kinetin với tổ hợp
BAP và NAA.

thức
ĐC

Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được môi trường MS* + 30mg/l
đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA là tốt nhất cho HSNC và

NAA
ĐC

0

CT 29

0,5 mg/l

CT 30

1,0 mg/l
MS* + mg/l BAP+

CT 31

1,5 mg/l

CT 32

2,0 mg/l

2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH
Bên cạnh các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP với

Kinetin được bổ sung vào môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar
+ mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA với hàm lượng thay đổi là:
Bảng 2.6: Cơng thức thí nghiệm nhân chồi
Cơng

Nồng độ và chất điều hồ sinh trưởng

thức

Kinetin

ĐC

ĐC

CT 39

0
0,5 mg/l

CT 40

MS* + mg/l BAP

1,0 mg/l

auxin, đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp BAP + Kinetin đến khả năng

CT 41

+ mg/l NAA +

1,5 mg/l

nhân nhanh chồi của 2 dịng. Mơi trường là: MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar +

CT 42

mg/l B2 + mg/l BAP và bổ sung Kinetin ở các nồng độ mg/l thay đổi là:
Bảng 2.5: Cơng thức thí nghiệm nhân chồi
Cơng

Nồng độ và chất điều hồ sinh trưởng

thức
ĐC

Kinetin
ĐC

CT 34

dài trung bình của rễ
IBA được bổ sung vào môi trường 1/2 MS* + 15 mg/l đường + 5 g/l agar, pH
= 6,5. IBA ở nồng độ thay đổi là:
Bảng 2.7: Cơng thức thí nghiệm ra rễ

1,0 mg/l

Công
thức

MS* + mg/l BAP

2,0 mg/l

CT 36

+

3,0 mg/l

CT 37

2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều

0

CT 35

4,0 mg/l

ĐC

Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng
IBA
ĐC

CT 44
CT 45
CT 46

2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH

2,0 mg/l

CT 47

0
1,0 mg/l

1/2 MS* +

2,0 mg/l
3,0 mg/l
4,0 mg/l


36

37

2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và

Sau khi huấn luyện, cây con được trồng ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành
đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh hưởng của thời

chiều dài trung bình của rễ
Để xác định ảnh hưởng của nồng độ IBA và ABT1 đến quá trình hình thành
*

rễ của hai dòng UE35 và UE56, đề tài bổ sung ABT1 vào môi trường 1/2MS +
30g/l đường + 5,0g/l agar + mg/l IBA + nồng độ ABT thay đổi như sau:
Bảng 2. 8: Cơng thức thí nghiệm ra rễ
Cơng

Nồng độ và chất điều hồ sinh

thức

trưởng
ĐC

vườn ươm.
Q trình lấy cây con ra khỏi bình, trồng cây vào bầu đất và chăm sóc cây
ngồi vườn ươm được tiến hành theo các bước kỹ thuật được thực hiện tại Trung
tâm giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và khu công nghệ tế
bào Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
1. Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kình 5,5 cm, cao 11 cm, có

ABT1
ĐC

gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây trong giai đoạn

0

đục lỗ dưới đáy. Thành ruột bầu là đất tầng B 100% đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây
và các tạp chất khác.

CT 44

1,0 mg/l

2. Xử lý bầu: Trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng mầm bệnh

CT 45

2,0 mg/l

bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hồ thuốc tìm vào nước và dùng ô doa tưới

CT 46

1/2 MS* + mg/l IBA +

CT 47

3,0 mg/l
4,0 mg/l

2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở

lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm).
3. Lấy cây ra khỏi bình và cấy vào bầu
-

lệ thể tích đất/dung dịch thuốc tím = 1/1 trước khi ra cây 12-24 giờ.

vườn ươm
Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra trồng ở vườn ươm, đề tài chuyển

Tạo hỗn hợp hồ rễ: Trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1% với tỷ

-

Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt

các bình cây (cây hồn chỉnh ở trong bình) ra mơi trường bên ngồi, mục đích để

từng cây ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Nhúng rễ cây vào hỗn

cây con làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai đoạn huấn luyện).

hợp hồ rễ

Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ
5.000 - 10.000 lux, khơng cho ánh nắng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây.
Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo dài
so với sản xuất. Chúng tôi thử nghiệm 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con.

-

Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất đã được xử lý và để bay hơi sau 1 ngày.

4. Chăm sóc cây sau khi cấy: Cây sau khi cấy được che bằng lưới đen (độ tàn
che 50-60%) 10-15 ngày sau khi cấy. Sau 2 tuần tưới phân NPK tỷ lệ
(5:10:3) nồng độ 0,3%, sau khi tưới rửa lại bằng nước sạch. Phun phòng nấm

Huấn luyện cây để ở ánh sáng và nhiệt độ trong điều kiện tự nhiên:

bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5g/10 lít nước, 1 tuần một lần. Thu

- Không huấn luyện (0 ngày)

thập tỷ lệ sống và đo chiều cao của cây sau khi cấy 4 tuần.

- 4 ngày
- 12 ngày
- 16 ngày

2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm
Q trình ni cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện nhân
tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:


38

-

39

Ánh sáng: Mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng
từ 1500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày.

-

Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 23-250C (±2)

-

Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60%

4. Chiều cao trung bình của chồi (cm) =

Tổng số chồi mới hình thành
Tổng số chồi ban đầu

5. Hệ số nhân chồi =

2.4.5. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp (Andrew. I, 1991,

6. Tỷ lệ ra rễ (%) =

Tổng số chồi ra rễ
x 100
Tổng số chồi ni cấy

số 71, 39 trang).
Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng, thí

7. Chiều dài rễ trung bình (cm) =

nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu (ống nghiệm, đánh
8. Tỷ lệ cây sống (%) =

giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy qua HSNC).
Các thí nghiệm nghiên cứu mơi trường nhân chồi, mỗi cơng thức theo dõi 10

Tổng chiều cao chồi
Tổng số chồi đo đếm

Tổng chiều dài rễ
Tổng số rễ đo đếm

Tổng số cây sống

Tổng số cây ban đầu

x 100

Số liệu thu được nghi chép trong bảng biểu và xử lý trên máy tính bằng phần

bình, mỗi bình 6 mẫu. Mơi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá kết quả

mềm thống kê Excel (theo Nguyễn Hải Tuất và Ngô Kim Khôi, 1996).

HSNC và TLCHH sau 4 tuần ni cấy.

Một số cơng thức tính tốn:
- Số trung bình mẫu:
X = Error! Objects cannot be created from
editing field codes.Error! Objects cannot be created from editing field
codes.
- Phương sai: Sd2 = Error! Objects cannot be created from editing field
codes.Error! Objects cannot be created from editing field codes.)2
- Hệ số biến động:
Sd
V% =
x 100
Xtb
* Xử lý số liệu

Các thí nghiệm nghiên cứu mơi trường tạo rễ, mỗi cơng thức theo dõi 10
bình, mỗi bình 30 chồi. Mơi trường được chứa trong bình trụ đường kính 6cm hoặc
10cm, chiều cao 15 - 20 cm, với nắp nilong quấn nịt cao su kép. Thu thập tỷ lệ ra rễ,
số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 2 tuần ni cấy.

Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều
cao của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo đếm 30 cây tại
vườn ươm.

- Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel

2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu

- Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm bằng phương pháp phân
tích phương sai một nhân tố theo phần mềm SPSS 11.5. Tiêu chuẩn Duncan được

* Thu thập số liệu
+ Các chỉ tiêu đo đếm trong phịng thí nghiệm:
1. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

2. Tỷ lệ mẫu sống (%) =

3. Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) =

Tổng số mẫu nhiễm
Tổng số mẫu ban đầu
Tổng số mẫu sống
Tổng số mẫu ban đầu

dùng để phân nhóm và tìm cơng thức thí nghiệm tốt nhất là:
x 100

Giả thiết H0: nhân tố A có tác động một cách đồng đều (ngẫu nhiên) đến kết
quả thí nghiệm khi đó: α1= α2=...= αa = 0 hoặc μ1= μ2 = …..= μa = μ
Giả thiết H1: Tác động của nhân tố A là không đồng đều ở tất cả các cấp khi

x 100

Tổng số mẫu nảy chồi
x 100
Tổng số mẫu thí nghiệm

đó có ít nhất là có một αi ≠ 0.