Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------------ -----------------------






ĐẶNG NGỌC HÙNG







NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ







LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH

THÁI NGUYÊN – NĂM 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------------ -----------------------





ĐẶNG NGỌC HÙNG




NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG

PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ



CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC
MÃ SỐ: 60.62.60



LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH





NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ
THS. ĐOÀN THỊ MAI








THÁI NGUYÊN – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn
Lời nói đầu
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình ảnh
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3
1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3
1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ................................ 4
1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ............................................................ 4
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào................................................. 4
1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 6
1.4.1. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 6
1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng.................................................................... 8
1.4.3. Môi trường vật lý ........................................................................................ 10
1.4.4. Vật liệu nuôi cấy ......................................................................................... 11
1.4.5. Điều kiện vô trùng ...................................................................................... 11
1.4.6. Buồng nuôi cấy ........................................................................................... 12
1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống ........................................ 12
1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ..................................................................................... 12
1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ............................................................................. 13
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ................................................................................ 13
1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ........................................................................ 14
1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ................................................................. 14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) ........... 16

1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)......................................................... 16
1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) ............................................................ 17
1.6.3. Bạch đàn lai ................................................................................................ 17
1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô ................................................... 20
1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn ............... 21
1.7.1. Trên thế giới................................................................................................ 21
1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ............... 25
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 28
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 28
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................... 28
2.2.1. Một số đặc điểm chính của dòng UE35 và dòng UE56 .............................. 28
2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu ...................................................................................... 28
2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ........................................................................ 29
2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 29
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp ................................................................... 31
2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu..................... 31
2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .... 32
2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC)
và chất lượng chồi (TLCHH) ............................................................................... 32
2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH ................................. 32
2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH ........................ 33
2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ..................... 34
2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................. 34
2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH ..... 35
2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều
dài trung bình của rễ ............................................................................................. 35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây

và chiều dài trung bình của rễ .............................................................................. 36
2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con
ở vườn ươm ........................................................................................................... 36
2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................. 37
2.4.5. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 38
2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu ............................................................................. 38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 41
3.1. Khử trùng mẫu cấy ....................................................................................... 41
3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu ...................... 43
3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi ..................... 44
3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung vitamine B2 vào môi trƣờng MS
*
đến HSNC
và TLCHH ........................................................................................................... 46
3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS
*
đến
HSNC và TLCHH ............................................................................................... 50
3.5.1. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH ............................................. 50
3.5.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + IAA đến HSNC và TLCHH ................... 52
3.5.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường MS
*

đến HSNC và TLCHH .......................................................................................... 55
3.5.4. Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ......... 58
3.5.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và
TLCHH ................................................................................................................. 60
3.5.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường 1/2 MS
*
tỷ lệ

chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ............................................. 63
3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung
bình/cây và chiều dài của rễ ................................................................................. 66
3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây
con ở vườn ươm.................................................................................................... 68
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 72
4.2. Tồn tại ........................................................................................................... 72
4.3. Kiến nghị ....................................................................................................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75
Tài liệu tiếng việt ................................................................................................ 75
Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................ 77
Phụ Lục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI NÓI ĐẦU
Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu
quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nông Lâm Thái
Nguyên. Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học
2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống
các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E.
exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã
nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo
trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc
Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Cho phép

tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo, đặc biệt là
GS.TS. Lê Đình Khả, Th.s. Đoàn Thị Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và
người thân đã giúp đỡ tôi có được bản luận văn này.
Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một vấn đề khó
trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống cây lâm nghiệp. Việc nghiên cứu
nhân giống một số dòng Bạch đàn lai nói trên trong đề tài nhằm góp phần xây
dựng cơ sở hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cây với số lượng lớn,
đồng đều, có chất lượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm
khuyết, rất mong được sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các
bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu này được hoàn thiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2009
Tác giả

Đặng Ngọc Hùng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG

TT Tên bảng Trang
3.1a Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) …...
41
3.1b Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) …....
42
3.2 Bảng ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi……………....
43
3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC và
TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường)
…….….

44
3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của
UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) ……………………………..

47
3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai
dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….……...

51
3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH
của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ………………………

53
3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công
thức)……………………………………………………………………


56
3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ………

59
3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/công thức) ………………………….

61
3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều
dài của rễ (180 chồi cây/ công thức) …………………………………..

64
3.11 Ảnh hưởng của IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và
chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56 …………………………………

66
3.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại
vườn ươm sau 1 tháng (90 cây mạ /công thức)………………………..

69


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

TT Tên biểu đồ Trang
3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC của dòng UE35 và UE.......... 48
3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH của dòng UE35 và UE ....... 48
3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC của dòng UE35 và UE ................... 51
3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của dòng UE35 và UE................. 52
3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54
3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54
3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 56
3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 58
3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 59

3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60
3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62
3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62
3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65
3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35
và UE .................................................................................................................... 65
3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng
UE35 và UE .......................................................................................................... 67
3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 67
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

TT Tên bảng Trang
3.1. Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43
3.2. Ảnh dòng UE35 cấy trong 5 loại môi trường ………………………. 46
3.3 Ảnh mẫu được cấy sang môi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10
ngày nuôi cấy ………………………………………………………..

47
3.4a. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS
*
có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48
3.4b. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS
*
có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49
3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và

TLCHH ……………………………………………………………...

55
3.6. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0
mg/l NAA …………………………………………………………...

58
3.7. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1 mg/l
N AA + 0,5 mg/l Kinetin ……………………………………………

62
3.8. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung ABT1 vào môi trường ra rễ sau 15
ngày nuôi cấy ………………………………………………………..

68
3.9. Ảnh cây con tại vườn ươm của 2 dòng ……………………………... 71
3.10. Ảnh sơ đồ cho quy trình nuôi cấy mô 2 dòng UE35 v à UE56 …….. 74

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABT1
: Chất kích thích ra rễ của Trung Quốc
BAP : 6- Benzyl amino purine
B2 : Riboflavil
Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Ca (0Cl)
2
: Hypoclorit canxi
GA

3
: Gibberellin acid 3
HgCl
2
: Clorua thuỷ ngân
HSNC : Hệ số nhân chồi
IAA : Indol acetic acid
IBA : 3-Indol butyric acid
Kinetine : 6- Furfuryl aminopurine - C
10
H
9
N0
5

NAA : Nathyl acetic acid
Na0Cl : Hypoclorit natri
TTG1 : Thuốc kích thích ra rễ có gốc IBA của Trung tâm
giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam
TLCHH : Tỷ lệ chồi hữu hiệu

1
MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không
ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh
chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây
trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc
điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn.
Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt.

Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống
đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế
nuôi cấy mô tế bào còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp.
Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều
nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom
đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp (Lê Đình Khả, Đoàn
Thị Mai, 2002, tr. 166-182).
Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh
trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất nguyên
liệu như: gỗ, ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ củi. Bạch đàn được trồng rộng
rãi ở nhiều nước trên thế giới. Nhiều giống Bạch đàn được cải thiện cùng với kỹ
thuật trồng rừng thâm canh cho năng suất cao.
Ở Việt Nam, Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng.
Tuy nhiên năng suất và chất lượng rừng Bạch đàn trồng rừng ở nước ta còn thấp và
rất khác nhau. Từ năm 1996 Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng - Viện khoa học
Lâm Nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu lai tạo và chọn được một số tổ hợp lai có nhiều
triển vọng về khả năng sinh trưởng. Các tổ hợp lai trong loài và khác loài của các loài
Bạch đàn urophyla (Eucalyptus urophyla) với Bạch đàn liễu (E. exserta) trong đó
Eucaluptus urophyla được dùng làm mẹ, E. exserta được dùng làm bố. Những dòng
cây lai được chọn là các dòng vô tính thuộc các tổ hợp lai U29E2 (dòng 35) và
U29E4 (dòng 56). Hai dòng cây lai này đều có mẹ là Bạch đàn uro (U29), bố là Bạch

2
đàn liễu (E2), song lại thuộc hai cây khác nhau là E2 và E4 vì vậy có đặc điểm sinh
trưởng khác nhau. Các dòng vô tính này thuộc các tổ hợp lai đã được Bộ NN&PTNT
công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật thích hợp với điều kiện lập địa ở vùng đất đồi
nghèo dinh dưỡng có thể cho năng suất gấp 2-4 lần so với loài bố mẹ (Lê Đình Khả,
Nguyễn Việt Cường, 2001). Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô những
giống lai mới được chọn tạo này có ý nghĩa rất lớn để sớm đưa vào sản xuất trên diện
rộng mà vẫn giữ được các đặc tính ưu việt của chúng.

Để hạn chế lây lan của dịch bệnh có thể xảy ra thì một trong những biện
pháp kỹ thuật là trồng hỗn loài các dòng vô tính khác nhau. Ở Nước ta hiện nay có
khoảng 12 dòng Bạch đàn đã được Bộ NN&PTNT công nhận và cho phép trồng
rừng sản xuất, trong khi đó mới có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 là những dòng đã
được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống
bằng phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng.
Hiện nay, nhu cầu cây giống Bạch đàn có năng suất cao và đã qua khảo
nghiệm, cũng như của hai dòng này nhằm phục vụ trồng rừng khá lớn. Thời gian
qua Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp đã thử
nghiệm áp dụng quy trình nhân giống nuôi cấy mô hai dòng UE35 và UE56 và đã
có kết quả bước đầu. Việc nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để
hoàn thiện công nghệ và phục vụ sản xuất giống là rất cần thiết. Từ những đặc
điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus
urophyla và E. exserta bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô”. Đây cũng là một phần
kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch
đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế
bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện.

3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp
Giống lai là giống được tạo ra do lai tự nhiên hoặc lai nhân tạo giữa các cá thể
có kiểu gen (genotype) khác nhau. Giống lai thường có năng suất cao và có tính
chống chịu với các điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ. Vì thế, tạo và sử dụng giống lai
đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà chọn giống nông lâm nghiệp trên thế
giới (Lê Đình Khả, 2006).

1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture). Vi nhân giống
(micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các
bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân
giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có
thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ
cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) vv. (Isikawa và cs, 1996, Preece, 1997, Tripepi,
1997, Merkle, 1997, Nguyễn Đức Thành, 2000). Song nuôi cấy mô cho chồi bên và
chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) là những phương pháp chính được dùng
trong nhân giống cây rừng mà không đề cập các nội dung khác.
Nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt,
thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom
lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt
và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ:
cây mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai
tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại
có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của
giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ
hoá bị hạn chế, còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn
là biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi

4
kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối
hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến
trong sản xuất lâm nghiệp.
Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt,
Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây
hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy
rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau
4-8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của

cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt
nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ
cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành
của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không
thể trẻ như cây mọc từ hạt.
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào
1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế
bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông
tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom). Đặc
tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình
phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen
của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều
kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ.
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản
phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực
hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất
định nhờ vào sự phân hoá.

5
Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân
hoá có thể diễn như sau:
Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng
Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả
năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng
lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân

hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào.











Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân
hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen
được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động.
Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân
tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi
các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen
được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định
sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994).
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực
vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định
hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng

Phân hoá
Tế bào dãn
Phản phân hoá
Tế bào phôi sinh

Tế bào chuyển hoá

6
của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực
vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường
khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở
sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA,
IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi
cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo
(callus).
1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá
trình này có thể chia thành các nhân tố sau:
1.4.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được
xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy
được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng
trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có
nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ
thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp
cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất
quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối
khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh
trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước
dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ
thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn
đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng
giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất

phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:

7
+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp
để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng
hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh,
1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp
mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài
ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng
2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994).
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển
mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN
4
+
và
NO
3
-
(nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO
3
-
của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả
hơn so với NH
4
+
. Nhưng đôi khi NO
3
-
gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì

vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng
rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,
Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này
được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức
năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu
trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường
được thuận lợi.
Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể
lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình
thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn.
Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng
nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l).
Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất
khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh
lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố
rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng

8
vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp
hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình
thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin,
nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu
một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo
từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là
những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ
thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994).
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết

nấm men, cà rốt, chối, khoai tây... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích
thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy
mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in
vitro. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và
DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi
cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của
Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của
tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có
ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong
khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy.
1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển
của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá
trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5
nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan
trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.

9
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA
(Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin
thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo,
kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân
chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp
chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C
10
H
9

N0
5
), BAP (6-
Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì
Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành
rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các
nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10
-7
- 10
-6
M) chúng có tác dụng kích thích sự
phân bào, ở nồng độ 10
-6
- 10
-5
M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy
mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10
-
6
- 10
-4
(Lê Văn Chi, 1992).
+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan
trọng nhất là GA
3
(Gibberellin acid 3). GA
3
có tác dụng kích thích nảy mầm của các
loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA
3

còn có tác
dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ
(Street, 1973). Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số
thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây.
+ Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được
dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy,
khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (lê
Văn Chi, 1992).
+ Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở
giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một
số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường
hợp nó lại kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyên, 1993).

10
Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ
nét tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường. Sự ổn định của môi
trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây. Nếu pH thấp (<4,5) hặc (>7,0)
đều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Nên việc xác
định được độ pH ban đầu của môi trường cho quá trình sinh trưởng và phát triển của
mô cấy là cần thiết. Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
nói chung từ 5,6 - 6.
1.4.3. Môi trường vật lý
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó
là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái
của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu
sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.
Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô
nuôi cấy. Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy.

Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp
gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp
cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974).
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm
tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức
chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo.
Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn
huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá
trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của
Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên
cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 20
0
C/15
0
C hoặc 20
0
C/18
0
C

11
tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì
hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không
có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ
25 - 30
0
C và ban đêm từ 17 - 20
0

C.
+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên
ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
1.4.4. Vật liệu nuôi cấy
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân
giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn
năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Thực tế cho thấy các loài tế bào và các
loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản
trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng
nuôi cấy thành công càng cao. Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi
đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non,
tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai
đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995).
1.4.5. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình nuôi
cấy in vitro. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi
trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị
ngừng lại. Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô
trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng
mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng.
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng
thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh.
Phương tiện khử trùng
 Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ
nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm, 120 -130
0
C).

12
 Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

 Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường
sử dụng các dung dịch như HgCl
2
(clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit
natri), Ca (0Cl)
2
(Hypoclorit canxi), H
2
0
2
(ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng
để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
 Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở
nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng.
Hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích
lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền
phù tế bào.
 Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải
được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp
chiếu đèn tử ngoại.
 Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị
này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không
khí vô trùng về phía người ngồi thao tác.
1.4.6. Buồng nuôi cấy
Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải
đảm bảo các điều kiện:
- Nhiệt độ: 25 - 30
0
C
- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.

Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài.
1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống
1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các
bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi cấy.
Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi
trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ

13
động trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật
liệu giống.
1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy. Khi đã
có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều
kiện vô trùng. Người ta thường dùng một hoá chất như HgCl
2
, Ca(0Cl)
2
, Na0Cl,
H
2
0
2
, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất,
nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về nguyên tắc, mô nuôi cấy có thể là bất
kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa, quả…) nhưng theo Blatt thì mô lấy từ các
phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận
trưởng thành khác (Blat K. M. and Hwanok Ma, 2004). Vì vậy, người ta thường lấy
chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.
Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp

thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh
của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anoleson, 1980). Đối
với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin
pyrroline (PVP) vào môi trường (Lê Đình Khả, 1999). Giai đoạn này cần đảm bảo
các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết
quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy
mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần.
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các
phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn
then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ
5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Trong
giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ
quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất
di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều Kitocinin sẽ kích
thích tạo chồi. Chế độ nuôi thường là 25-27
0
C và 10-16h/ngày, cường độ chiếu sáng

14
1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con tối đa trong thời
gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây.
1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)
Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi
đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi
trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây
hoàn chỉnh. Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine
để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Người ta thường dùng các chất NAA
(Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở
nồng độ 1mg/l - 5mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp

nuôi cấy mô. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang
môi trường Auxin để rễ phát triển.
Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động
của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng.
1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con trong ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngoài trời. Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng,
nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột
làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn
nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá thể. Giá thể tiếp nhận cây
in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây mới
đưa từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm >50% để cây con không mất nước và làm
giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau 2-3 ngày đưa ra ngoài cây mô sẽ sinh
trưởng ổn định, chăm sóc cây mô tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.
Đối với nuôi cấy mô, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu của viện
khoa học Lâm nghiệp Việt Nam là Đoàn Thị Mai và cs đã sử dụng chất kích thích
ra rễ IBA, IAA và NAA ở các nông độ khác nhau (để bổ sung cho môi trường MS)
và đã thấy rằng khi dùng IBA ở nồng độ 2 mg/l đối với ra rễ chồi trong ống nghiệm,
còn ra rễ trực tiếp bằng cách ngâm và chấm dung dịch ra rễ sử sụng nồng độ 3 ppm