Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen chống sau VIP3A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------

----------

LỜI CAM ðOAN
- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn
ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ

TRẦN THỊ THANH HẢO

nguồn gốc.
Tác giả luận văn

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
KHÁNG SÂU vip3A

Trần Thị Thanh Hảo

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn: 1. TS. CHU HOÀNG HÀ
2. GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI - 2009

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i


LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh

MỤC LỤC
Lời cam ñoan

Error! Bookmark not defined.

luận văn tốt nghiêp, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ vô cùng quý báu

Lời cảm ơn

Error! Bookmark not defined.

của Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội,

Mục lục

Error! Bookmark not defined.

Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội và tập thể Phòng Công

Danh mục các chữ viết tắt

Error! Bookmark not defined.

nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học.

Danh mục bảng

Error! Bookmark not defined.

Danh mục hình

Error! Bookmark not defined.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng

1.

MỞ ðẦU

1.1

ðặt vấn ñề

1

1.2

Mục ñích và yêu cầu

2

2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1

Giới thiệu chung về cây thuốc lá

3

2.1.1

Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá

4

2.1.2

Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá

5

Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học

2.1.3

Tình hình sâu bệnh hại

6

Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ

2.1.5

Giá trị của cây thuốc lá

7

Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia

2.1.6

Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu

7

ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản

2.2.

Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài

9

luận văn tốt nghiệp.

2.2.1

Khái niệm chuyển gen

2.2.2

Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng

10

2.3

Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt)

19

2.3.1

Lịch sử phát hiện ñộc tố Bt

19

2.3.2

Các loại protein ñộc tố của Bt

20

2.4

Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới

22

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều

kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và
hoàn chỉnh luận văn.
Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch,
trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu
ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Hảo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii

1

9

2.5

Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước

23

3.

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

25

3.1

Vật liệu, hoá chất, thiết bị

25

3.1.1

Vật liệu

25

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii


3.1.2

Hoá chất, thiết bị

25

3.2

ðịa ñiểm và thời gian:

26

3.3

Phương pháp nghiên cứu

26

3.3.1

Phương pháp thiết kế vector chuyển gen

26

3.3.2

Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens

3.3.3

Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

khuẩn A. tumefaciens

46

4.3

Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen

53

5.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

57

5.1

Kết luận

57

BAP
bp
Bt
Cefo
CNSH
cry
cs
CTTN
CV
DNA
EtBr
GM Kan 30
GM Kan 50
GM
gus
IBA
Kan
kb
kDa
LB
LSD

MS
MT
OD
PCR
RM
RM Kan 50
RNA
TAE
T-DNA
TE
Ti- plasmid
v/p
vip

5.2

Kiến nghị

57

vir

bằng xung ñiện

3.3.4

31

(theo Topping, 1998 )

31

Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

33

3.4

Các chỉ tiêu theo dõi:

36

4.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

37

4.1

Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A

37

4.1.1

Thiết kế mồi

38

4.1.2

PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR

39

4.1.3

Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng

40

4.1.4

Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

40

4.1.5

Chọn lọc plasmit tái tổ hợp

41

4.1.6

Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A

42

4.2

Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá

45

4.2.1

Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens
bằng xung ñiện

4.2.2

45

Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi

TÀI LIỆU THAM KHẢO

58

PHỤ LỤC

64

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv

6 - benzyladenine
Base pair = cặp bazơ
Bacillus thuringiensis

Cefotaxime
Công nghệ sinh học
Crystal toxin gene = gen mã hóa protein nội ñộc tố δ
Cộng sự
Công thức thí nghiệm
Coefficient of variation = sai số thí nghiệm
Deoxyribonucleic Acid
Ethidium bromide
Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l
Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l
Môi trường tái sinh chồi
β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
Indole-3-butyric acid
Kanamycin
kilo base
kilo Dalton
Môi trường theo Luria và Bertani
Least significant difference = sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa
Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
Môi trường
Optical density = mật ñộ quang học
Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase
Môi trường ra rễ
Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l
Ribonucleic Acid
Tris bazơ - Axit acetic – EDTA
Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển
Tris HCl - EDTA, pH = 8
Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u
Vòng/phút

Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng
diệt côn trùng
Virulence region = vùng gây ñộc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v


DANH MỤC BẢNG
STT
2.1.

Tên bảng

DANH MỤC HÌNH
Trang

Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới

STT

Tên hình

Trang

2.1

Cấu trúc Ti- Plasmit

12

giai ñoạn 2004 - 2008

8

2.2

Mô chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

14

2.2.

Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008

9

4.1

Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A

39

4.1.

Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A

38

4.2

Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli

4.2.

Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn

49

DH5α

40

4.3

Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit

41

4.4

Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI

43

4.5

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc
hiệu V1.2/V2.2

4.6

Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ

4.7

Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc

hợp bằng enzyme BamHI & SacI

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi

44
45

chọn lọc

48

4.8

Dịch huyền phù vi khuẩn

48

4.9

Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30

50

4.10

Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30

50

4.11

Mảnh lá ð/C2 trên MT GM

50

4.12

Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50

50

4.13

Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50

50

4.14

Cụm chồi ð/C2 trên MT GM

50

4.15

Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1)

51

4.16

Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2)

51

4.17

Cây ð/C trên MT RM Kan 50

51

4.18

Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50

51

4.19

Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50

51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii


4.20

Cây trong bầu trấu cát

53

4.21

Cây trồng trong bầu ñất

53

4.22a Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp
mồi 33S Fs/Rs

1.1
54

4.22b Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 6 dòng thuốc lá với cặp
mồi 35S Fs/Rs
4.23

ðặt vấn ñề
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị

kinh tế cao. Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc
55

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá với cặp
mồi V2.1/V2.3

1. MỞ ðẦU

trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá.
Ngoài ra cây thuốc lá cũng ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng

56

làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật.
Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau ñược quan
tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong
những hướng chọn tạo giống ñược quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ
biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các
bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc
kháng sâu (sâu xanh, sâu xám...). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của
cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các
gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng)
mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn
Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt
tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt
côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo
protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có
phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12].
Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày
có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những
nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một
trong những hướng ñi ñể giải quyết vấn ñề ñó.
Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng

2.1

Giới thiệu chung về cây thuốc lá

bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có

CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào ñược công bố về sử dụng gen vip3A

tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ ñối với

trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu.

trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công

Trên cơ sở ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo cây
thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A”

1.2

Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu của ñề tài:
Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A)
1.2.2 Nội dung nghiên cứu:

nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn ñiếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu ñến cả
hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư
nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật
[16], [20]... Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ
60o vĩ Bắc ñến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu ñược khoảng
6,5 - 8,5 triệu tấn (trong ñó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng

- Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A.

0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là

- Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumerfaciens.

các loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47].

- Theo dõi, kiểm tra và ñánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen.

Theo Reed S. M. [41] thì cây thuốc lá ñược phân loại thuộc giới thực
vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt
kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi
với tổng số trên 1.800 loài. Một số loài trong họ này ñược trồng rộng rãi như
khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong ñó có chi Nicotiana. ðặc trưng của

các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin,
atropin, scopalamin, nicotine...
Chi Nicotiana ñược chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66
loài trong ñó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1
loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là
cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài
chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại ñược trồng phổ biến làm thuốc lá là
Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3


Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội

Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia ðịnh,

(Dihaploid = 4n), có biến ñộng lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc ñóng

tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá ñiếu bắt ñầu ñược sản xuất tại Hà

lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc

Nội cùng thời gian này. Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash ñầu

trên ñỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng ñến

tiên ñược du nhập và trồng thử ở An Khê, ñến năm 1940 trồng thử ở Tuyên

ñỏ (N. tabacum) hay màu vàng ñến vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường

Quang, Ninh Bình... [22].

tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn ñến 95%. Mỗi cây có thể cho

2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá

200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt. Trong

2.1.2.1. Rễ thuốc lá

hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30%

Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên)

protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống

và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất ñịnh mọc ở cổ rễ, phần trên sát

rất lâu [16], [20], [22].

mặt ñất. Rễ trụ ñược hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh ñược phát sinh từ trục

2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá

của rễ cái, thường có ñộ xiên 30 - 40o. Rễ hấp thu ñược phát triển trên các rễ

Trong lịch sử, cây thuốc lá ñược trồng ñầu tiên ở châu Mỹ từ hơn

nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất ñịnh mọc

6000 năm trước công nguyên và ñược sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm

từ thân, những rễ bất ñịnh ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi ñộ ẩm

thuốc chữa bệnh [16], [22].
Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt ñới và Á nhiệt ñới,

không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày ñặc ở lớp ñất 0 - 30 cm, phát triển
theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin ñược

hương vị ñặc biệt của nó ñã ñược biết ñến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách ñây

vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá.

trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [16], [20].

2.1.2.2 Thân cây

Sử viết về cây thuốc lá bắt ñầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi

Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân ñứng, tiết diện thân tròn, chiều

Christopher Columbus ñặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn ðộ Dương.

cao thân cây có thể ñạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều ñốt, mỗi ñốt mang một lá.

Các thổ dân ở ñó ñã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm

ðường kính thân ñạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là

quyến rũ khi chúng ñược châm hút ñể mời ñoàn thám hiểm [16], [20].

chồi nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ.

Người Tây Ban Nha bắt ñầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với
nguồn hạt giống từ Mexico và sau ñó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn

2.1.2.3 Lá thuốc lá
Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay

ñảo lân cận khác. Trồng trọt thuốc lá bắt ñầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau ñó

ñổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình

phát triển sang Guiana, Brazil [20] và dần dần phát triển trên các châu lục khác.

tim, hình elip, hình mũi mác. ðộ dày, màu sắc lá có thể thay ñổi.

Một số tài liệu ñáng tin cậy cho rằng thuốc lá ñược trồng từ thời vua Lê

Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá

Thần Tông (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha.

bắt ñầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5


lá quyết ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có

2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá

nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến

Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm

này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật.

chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá

Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ.

trên toàn thế giới. Ngoài ra thuốc lá còn ñược sử dụng vào một số mục ñích

2.1.2.4 Hoa

khác như:
- Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ

Hoa thuốc lá là hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung
quanh có 5 nhị ñực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,
ñược hình thành do sự phân hoá của ñỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm
hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa.
Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể
do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,..

2.1.2.5 Quả và hạt
Quả thuốc lá ñược hình thành trên ñài hoa. Mỗi cây có 100 - 150 quả
trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên
chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra.
Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng
sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 ñến 15.000 hạt [14].
2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại
Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do

4 - 5 % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin.
- Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất ñược sclareol và 13 epi - sclareol
chống bệnh gỉ sắt cây họ ñậu.
- Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược
phẩm.
- Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử
dụng trong thực phẩm.
- Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao.
- Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá.
- Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc
lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin.
- Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng
vượt cả Phomat Protein trong sữa [5].

virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi

2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu

khuẩn , ñen thân, héo ñốm cà chua....

2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới

Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa
assulta), sâu khoang (Prodenia litura), sâu xám (Agrotis ypsilon)...
Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu chính xác nhưng nhiều chuyên gia cho
rằng thiệt hại do bệnh và sâu ñối với thuốc lá khoảng 25 - 30%. Nếu sản
lượng hàng năm là 30.000 tấn với giá bình quân 12.000 ñ/kg thì sâu bệnh hại
ñã lấy ñi mất khoảng 100 tỷ ñồng/năm và mỗi phần trăm thu lại ñược từ phần
thiệt hại này trị giá hàng tỷ ñồng [9].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6

Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu ñược sản
xuất ở các vùng từ 45o vĩ Bắc ñến 30o vĩ Nam. Diện tích trồng thuốc lá trên thế
giới trong những năm gần ñây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55].
Trong tổng sản lượng thuốc lá nguyên liệu trên 5 triệu tấn ñược sản xuất
hàng năm, thuốc lá vàng sấy lò chiếm trên 60%, thuốc lá burley khoảng 15%,
thuốc lá oriental gần 10% và một số chủng loại khác [48].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7


Bảng 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới

Bảng 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008

giai ñoạn 2004 - 2008

Năm

ðVT: ngàn tấn

Năm

Vàng sấy

Burley

Oriental

Nâu

Tổng

TT

ðịa ñiểm

2006
DT

2007

SL

NS

DT

2008

SL

NS

DT

SL

NS

I

Phía Bắc

5.875

8.912

1,52

5.615

8.737

1,56

7.066

11.144

1,58

II

Phía Nam

9.683

17.184

1,77

7.564

13.725

1,81

6.165

11.229

1,82

Tổng /TB

15.558

26.096

1,68

13.18

22.462

1,70

13.23

22.373

1,69

2004

3757,1

886,4

350,9

195,9

5190,3

2005

4035,6

771,8

353,1

181,9

5342,4

Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc lá Việt Nam [15]

2006

3948,5

725,3

268,5

182,1

5124,4

Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: năng suất (tấn/ha)

2007

3872,6

620,6

237,0

185,5

4915,7

Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong

2008

4185,9

743,5

259,0

184,3

5372,7

nước trong những năm qua tương ñối ổn ñịnh. Theo ñánh giá của các chuyên

Nguồn: USDA (Tobacco World Markets and Trade june – 2008) [48]

gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương ñối

Số liệu ở bảng 2.1 cho thấy sản lượng các dạng thuốc lá chính của thế

tốt, có thể thay thế ñược nguyên liệu Trung Quốc. Vì vậy việc phát triển sản xuất

giới những năm qua tương ñối ổn ñịnh, mặc dù ngành công nghiệp thuốc lá ở

thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội ñịa

các nước chịu nhiều áp lực.

là một việc làm cần thiết trong giai ñoạn hiện nay. Nó vừa giúp cho ngành sản

2.1.6.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá lá ở Việt Nam

xuất thuốc lá trong nước chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu ñầu vào vừa tạo công

Hiện nay, thuốc lá ñược trồng ở nhiều ñịa phương trong cả nước (27/64
tỉnh, thành phố) [7] với 3 chủng loại thuốc lá vàng sấy, nâu và burley trong ñó
thuốc lá vàng sấy là loại nguyên liệu ñược trồng nhiều nhất ở nước ta hiện nay
chiếm tỷ trọng ñến 90% sản lượng thuốc lá nguyên liệu sản xuất nội ñịa.
Các ñịa phương trồng thuốc lá vàng sấy chủ yếu hiện nay là Cao Bằng,
Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, ðắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên. Tổng
diện tích trồng thuốc lá vàng sấy trên cả nước hiện dao ñộng ở khoảng 14 - 16
ngàn ha với sản lượng hàng năm ước ñạt từ 22 - 26 ngàn tấn. Tại khu vực
phía Bắc, năng suất ñạt 1,5 - 1,8 tấn/ha. Năng suất bình quân tại các tỉnh phía
Nam hiện nay ñạt khoảng 1,8 - 2 tấn/ha [9], [15].

ăn việc làm cho một bộ phận ñông ñảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân
sách và tiết kiệm ñược nguồn ngoại tệ cho nhà nước.
2.2.

Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài

2.2.1 Khái niệm chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết

kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện
các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen [3], [12].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng ñịnh
tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hoá cho các tính

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9


trạng nhất ñịnh, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông

Phương pháp này ñã khắc phục ñược những hạn chế chủ yếu của các

qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các

phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược cây trồng có

quá trình ñiều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại

nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen

cảnh lên hoạt ñộng của gen.

trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu ñược những cây

2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng

mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây...

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại

ðặc biệt là khi nhược ñiểm của A. tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây

thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và

hai lá mầm ñược khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành

phương pháp chuyển gen trực tiếp.

hiện thực và ñược ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi

2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

khuẩn Agrobacterium ngày càng gây ñược sự quan tâm và dần trở thành một

- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung ñiện

phương pháp chuyển gen ñược ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm

nhà chọn tạo giống trên thế giới.

- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

* ðặc ñiểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens

- Chuyển gen nhờ súng bắn gen

Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu

- Chuyển gen nhờ silicon carbide
2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp
- Chuyển gen nhờ virus
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñược nghiên cứu từ những

chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.
Trong chi Agrobacterium thì A. tumerfaciens ñược sử dụng nhiều nhất
cho việc chuyển gen.
Phân loại khoa học:
Giới

Bacteria

năm 1960 - 1970. Việc phát kiến ra Agobacterium tumefaciens

Ngành:

Proteobacteria

(A.tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm

Lớp:

Alpha Proteobacteria

1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của

Bộ:

Rhizobiales

Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu ñiểm nổi trội: số bản sao

Họ:

Rhizobiaceae

của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen,

Chi:

Agrobacterium

trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự không

Loài:

A. tumefaciens

biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả

Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens.

chuyển gen cao; tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ

(Smith & Townsend, 1907) [52].

thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [13].

A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau ñó sử

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11


dụng bộ máy thực vật ñể biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng

Trên Ti-plasmit có ñoạn T-DNA ñược giới hạn bằng bờ phải (right

cho chúng. A. tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần ñiểm tiếp nối giữa

border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau. T-DNA là

rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi

ñoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư

ñó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một ñoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân

(oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các

tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như:

auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp

nopaline, octopine goi chung là opine. Các chất này không hề có trước ñó và

opine. ðoạn này ñược gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì ñây là ñoạn sẽ ñược

không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn ñã truyền vào cây

chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u. Trên Ti-plasmit

qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là

còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt ñộng lây nhiễm, chuyển

vật chất di truyền.

nạp và tiêu hoá opine [13].
Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt
ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng
của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u.
Opine ñược vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá
opine trên Ti-plasmit.
Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn:
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất ñộc vết thương có bản chất
phenol: acetosyringon và hydroxyacetosyringon. Các chất này sẽ thu hút vi
khuẩn tập trung vào vùng bị thương ñồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng
vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có
Hình 2.1. Cấu trúc Ti- Plasmit

hai chức năng chính: cắt ñứt bờ phải và bờ trái ñể giải phóng ñoạn T-DNA,

(nguồn : )

bao bọc và vận chuyển ñoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với

Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Tiplasmit có trong vi khuẩn A. tumerfaciens. Ti-plasmit này có ñặc ñiểm chung
như sau:

genom cây chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumerfaciens sang tế bào cây
chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir A, B, C, D, E, G, F. Các

Ti-plasmit là một plasmit ñược cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép,

gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây

vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản ñộc lập với sự tái bản

thông qua tín hiệu hoá học acetosyringon (AS). Tín hiệu hoá học ñược nhận

của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

biết ñầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………12

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………13


màng tế bào ñể ñáp ứng sự trao ñổi chất của vết thương trên cây. Protein Vir

Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B ñảm nhiệm. Vir B có

A tự photphoryl hoá ñồng thời làm cho protein Vir G ñược photphoryl hoá

chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vào

(Jin và CS 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H

nhân tế bào. ðồng thời protein Vir B4, Vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp

(Ziemienowcz 2001).

năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000).
Như vậy, thực chất ñã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn ñất vào
cây trồng tồn tại trong tự nhiên.
Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn ñất ñể chuyển các gen
mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmit của vi khuẩn
sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen
gây ñộc cho cây.
Người ta ñã tạo ra các dạng vector mới ñể chuyển gen là những vector
liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4].
Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai

Hình 2.2. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

loại plasmit: Ti-plasmit ñã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất

(1). Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2). Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của

opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen

Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật ñặc trưng;(3). Sự hoạt hoá của vùng gen

bị cắt bỏ là ñoạn tương ñồng với một ñoạn trên plasmit thứ hai (plasmit trung

vir; (4). T-DNA ñược tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD1/D2; (5). Sự tạo

gian) ñể phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmit. Plasmit trung gian là một

thành phức hợp VirD2-DNA (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir

plasmit tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh ñược ở Agrobacterium.

khác, ñi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6). Sự kết hợp của VirE2 với sợi-T tạo thành
phức hợp-T thành thục ñi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7). Phức hợp-T thành
thục chủ ñộng ñi vào nhân tế bào chủ; (8). T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9). TDNA tách khỏi các protein bảo vệ; (10). T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ.

Tiếp ñó các protein ñược mã hoá bởi vir D, vir E thực hiện chức năng

Plasmit này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc
chọn lọc và có mặt ñoạn tương ñồng. Khi cho tương tác hai loại plasmit này với
nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao ñổi chéo giữa hai ñoạn tương ñồng và hình
thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A.

giải phóng sợi T-DNA. Protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’

tumefaciens và hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn

của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA. Protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân

ñất. Do tần số ñưa plasmit trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-

giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998). ðồng thời thực hiện
chức năng này có các protein Vir C1, Vir C 2 có tác dụng tăng cường việc giải

7

-10-5) nên vector này ít ñược sử dụng (John Draper, 1882).
Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector

phóng T-DNA.

(plasmit) cùng có mặt và hoạt ñộng trong Agrobacterium. Một plasmit tách

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………14

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………15


dòng từ E.coli trong ñó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là

* Vùng kết thúc (terminator).

các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmit thứ hai là Ti-plasmit cải

* Vùng gắn gen chuyển vào (MCS).

tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại

* Vùng chứa gen chọn lọc (ñể tách các tế bào chuyển gen).

vùng vir, plasmit này ñược gọi là plasmit hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng
hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn ñất Agrobacterium một cách
rất hữu hiệu (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005) [12].
Thiết kế vector
Các nghiên cứu về vi khuẩn Agrobacterium và khả năng tự nhiên của

* Vùng chứa các gen báo cáo ñể biết ñược các gen chuyển vào có thành
công không (gus, gfp - gen phát huỳnh quang).
Quy trình nghiên cứu tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens như sau:
Bước 1: Thiết kế vector mang gen.

chúng trong việc biến ñổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm

Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli.

ñã giúp các nhà khoa học thiết kế ñược những phân tử giúp chuyển gen mong

Bước 3: Chuyển vector tái tổ hợp vào A. tumerfacien.

muốn vào tế bào thực vật: T-DNA ñược giới hạn hai ñầu bởi vùng biên (T-

Bước 4: Lây nhiễm A. tumerfaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô

DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong

thực vật ñể tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào ñích.

quá trình chuyển gen. Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA

Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào ñược biến nạp thành công.

bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai ñầu vùng biên

Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh.

bằng các gen mong muốn. Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực

Sau ñó, từ những cây chuyển gen thu ñược cần ñánh giá sự ổn ñịnh di

vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho

truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính ñể thu ñược con cái

cây hữu thụ. Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm

mang gen mong muốn. ðồng thời ñánh giá tác ñộng của cây chuyển gen ñể

ảnh hưởng ñến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ

ñưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường [13].

các gen tổng hợp opine. Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên

Sàng lọc cây sau chuyển gen:

những ñoạn DNA không cần thiết cũng phải ñược cắt bỏ ñể chèn vào ñoạn

ðể tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang gen ñược

DNA mục tiêu. Ngoài ra, Ti-plasmit không tự tái bản trong E.coli nên cần

chuyển vào, thông thường trong các nghiên cứu ñều sử dụng môi trường nuôi

ñược bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli. Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ

cấy có bổ sung những chất mà chỉ có tế bào có tính trạng chọn lọc nhất ñịnh

thị ñể chọn lọc cây và vi khuẩn.

mới có thể sinh trưởng ñược, ñó là những gen kháng kháng sinh. Các kháng

Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này ñược gọi chung là các vector.

sinh ñược sử dung phổ biến ñể chọn lọc các thể biến nạp plasmit tái tổ hợp là

Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm:

ampicilin,

* Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn.

spectinomycin, tetracycline. Ở hệ biêu hiện là nấm thì gen chỉ thị chọn lọc

* Vùng khởi ñộng (promoter) có nguồn gốc từ thực vật.

dựa vào nguồn dinh dưỡng là LEU2, TRP1, URA3, HIS3....

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………16

chloramphenicol,

gentamixin,

kanamycin,

rifamicin,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………17


2.2.2.3 Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen trên thế giới

một mở rộng [51].

Công nghệ sinh học phát triển ñã tạo ñiều kiện ñể các nhà khoa học tiếp

Tám nước dẫn ñầu trồng hơn 1 triệu ha, sắp xếp theo diện tích giảm dần

tục nghiên cứu chọn tạo giống kháng sâu bằng cách chuyển gen mã hoá các

là Hoa Kỳ (62,5 triệu ha), Ac-hen-ti-na (21 triệu ha), Brazil (15,8 triệu ha),

ñặc tính mong muốn vào cây trồng.

Ấn ðộ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha), Trung Quốc (3,8 triệu ha),

Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen ñầu tiên nhờ vi khuẩn A.

Paraguay (2,7 triệu ha) và Nam Phi (1,8 triệu ha).

tumefaciens vào cây trồng ñầu tiên ñược thực hiện. Năm 1986, các thử

ðậu tương CNSH là giống cây chính ñược trồng trong năm 2008 với

nghiệm ñầu tiên trồng cây biến ñổi gen trên ñồng ruộng ở một số quốc gia.

diện tích 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tích ñất trồng cây CNSH trên toàn

Năm 1990, chuyển gen bất dục ñực cho ngô bằng súng bắn gen và thực phẩm

cầu, tiếp theo là ngô CNSH (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông CNSH (15,5

biến ñổi gen ñược chấp thuận ở Mỹ lần ñầu tiên. Năm 1994, giống cà chua

triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% diện

Flavor Saver mang gen chín chậm, là sản phẩm cây trồng chuyển gen ñầu tiên

tích ñất trồng cây CNSH trên toàn cầu).

ñược thương mại hoá. Năm 1998, lần ñầu thành công việc chuyển ñồng thời

Hiện nay ñã có 25 quốc gia cho phép trồng cây CNSH và 30 quốc gia

10 gen vào một cây. Toàn cầu có 48 giống cây chuyển gen ñược phép thương

khác ñã cho phép nhập khẩu các sản phẩm CNSH sử dụng làm thực phẩm và

mại hoá (trong ñó Mỹ có 35 giống) [38]. Năm 1999, chuyển gen cho lúa có

thức ăn chăn nuôi, ñưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng cây CNSH lên 55

giá trị dinh dưỡng cao hơn. Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu lớn

nước. Diện tích trồng tăng 74 lần từ năm 1996 ñến nay ñã khiến cây CNSH

hơn 40 triệu ha [11]. Năm 2006 ñược ghi nhận là năm ñầu tiên của thập niên

nhanh chóng trở thành công nghệ cây trồng ñược ứng dụng nhanh nhất.

thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015. Năm

Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5

2006, diện tích toàn cầu cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng cao vượt ngưỡng

tỷ USD với tổng giá trị tích luỹ ñạt 50 tỷ USD từ năm 1996 ñến 2008 [51].

100 triệu ha (250 triệu mẫu Anh), khi lần ñầu tiên hơn 10 triệu nông dân (10,3

2.3

triệu) tại 22 nước canh tác cây chuyển gen, cao hơn so với 90 triệu ha và 8,5

2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bacillus thuringiensis

triệu nông dân tại 21 nước năm 2005. Tỷ lệ chấp nhận cao chưa từng thấy là

minh chứng cho sự thật và sự tin tưởng của hàng triệu nông dân nhỏ và lớn
vào cây trồng chuyển gen ở các nước công nghiệp và ñang phát triển [51].
Năm 2007, Hoa Kỳ, Ac-hen-ti-na, Brazil, Canada, Ấn ðộ và Trung
Quốc tiếp tục là những nước trồng cây công nghệ sinh học (CNSH) chủ yếu
trên thế giới. Hoa Kỳ là nước có diện tích canh tác cây trồng cây CNSH dẫn
ñầu thế giới, tuy nhiên tỉ lệ diện tích ñất trồng cây CNSH của Hoa Kỳ so với
toàn cầu ñang giảm do diện tích canh tác cây trồng CNSH trên toàn cầu ngày

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………18

Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt)
Shigetane Isiwata, nhà sinh học người Nhật Bản ñã phát hiện ra vi

khuẩn này năm 1901 từ ấu trùng tằm bị bệnh.
Sau ñó, Ernst Berliner (1911) ñã phân lập vi khuẩn này từ ấu trùng
Ephetia kuniella bị bệnh và ñặt tên là Bacillus thuringiensis (Bt), (vi khuẩn
ñất ñiển hình ñược phân lập ở vùng Thuringia, ðức)
ðến năm 1915, Berliner ñã phát hiện sự có mặt của tinh thể trong Bt
nhưng hoạt tính của chúng chưa ñược xác ñịnh.
Bảng phân loại Bt: [56]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………19


Giới:

Eubacteria

Do cấu trúc tinh thể tự nhiên của các protein nên chữ cry ñược sử dụng

Ngành:

Firmicutes

như thuật ngữ cho các protein và gen. Ban ñầu, các nhà khoa học phân ra 4

Lớp:

Bacilli

nhóm gen ñộc tố theo sự tương ñồng của trình tự gen và loài côn trùng ñặc

Bộ:

Bacillales

hiệu (Hofte H và Whiteley HR, 1989) [32]. Các gen cryI mã hoá protein 130

Họ:

Bacillaceae

Chi:

Bacillus

Loài:

thuringiensis

Bt là vi khuẩn ñược phân lập từ ñất, có khả năng sinh ra các protein thể
vùi dạng tinh thể trong quá trình sinh bào tử. Sau ñó ñến những năm của thập
kỷ 50, các nhà khoa học mới phát hiện ra cấu trúc tinh thể của các ñộc tố gây
tê liệt bộ máy tiêu hoá của côn trùng (Steinhaus, E.A, 1951) [44].
Hannay (1953) [31] ñã phát hiện ra cấu trúc của các tinh thể gây ñộc

kDa, thường ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea). Các gen cryII mã
hoá protein 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh
(Diptera). Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng
cánh cứng (Coleoptera). Các gen cryIV ñặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh
(Diptera). Sau ñó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng
(Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992)
Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội ñộc tố (gồm 140 gen ñã
ñược công bố) ñược xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ
cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera).

cho côn trùng và ñặt tên là nội ñộc tố δ. Một số loài vi khuẩn khác cũng có

+ Cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt

khả năng sinh ra các nội ñộc tố gây chết các loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy,

Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao

cánh cứng và bộ hai cánh. Chúng ñược sử dụng ñể sản xuất thuốc trừ sâu sinh

(môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội ñộc tố δ (Hoftey, H. và

học trong suốt 40 thập kỷ qua (Lambert và Peferoen, 1992). ðã có 67 chế

Whiteley, H.R, 1989) [33].

phẩm Bt ñược ñăng ký với trên 450 công thức khác nhau (Shewry và
Gutteridge, 1992) [54].
Gen mã hoá nội ñộc tố ñã ñược nhân vô tính từ thập kỷ 80 (Schnepf và
Whitley, 1981) [43], ñược chuyển vào cây thuốc lá và cây cà chua (Barton và
cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) ñể biểu hiện tính kháng côn trùng [54].
Từ ñó cho ñến nay có rất nhiều thành tựu nghiên cứu về cây chuyển
gen cũng như các ñộc tố diệt côn trùng.
2.3.2 Các loại protein ñộc tố của Bt
2.3.2.1 Nội ñộc tố δ (cry) và cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt
+ Phân loại:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………20

Mục tiêu chính của ñộc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels,
1994) [34], [35]. Các tiền ñộc tố không hoạt ñộng cho ñến khi chúng bị hoà
tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa,
1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37],
[39], [46]. Các ñộc tố gắn vào chất nhận ñặc hiệu ở trong màng của tế bào
biểu mô trụ. Sau khi gắn vào chất nhận, ñộc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh
của tế bào ñể gây tổn thương cho côn trùng. Sau khi gắn với tế bào biểu mô
ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao
ñổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34]. Sự hình thành ñộc tố sẽ tạo thành các
lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao ñổi ion nhanh
chóng. Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………21

1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là

thuốc lá và cây khoai tây ñể kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa

nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết. Theo Knowles và Dow (1993)

decemlineata) (Perlak và cs, 1993) [40]. Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñược

[34] ñộc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương

chuyển vào cây ñể phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994).

lên và phá huỷ tính thẩm thấu. Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột ñã làm côn

100% sâu xanh (H. virescens, H. zea và S. exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá

trùng chết ñói hoặc nhiễm trùng ñường tiêu hoá.

thuốc lá ñược chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36]. Selvapandian và cs

2.3.2.2. ðộc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác ñộng

(1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh

+ Phân loại:

(H. armigera ) tương ñương với gen cry1A(b) hoặc cry1A(c).

Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25],

Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu

[26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng ñược chia thành 2 nhóm

thuốc lá biến ñổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá

chính:

chuyển gen chưa ñược ñánh giá khách quan
Nhóm liên hợp vip1 và vip2 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng
Nhóm vip3 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy

2.5

Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước
Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy

+ Cơ chế tác ñộng của VIP

mạnh việc phát triển loại thực vật, ñộng vật này [53]. Mới ñây nhất, Thủ

Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt ñộng trong ruột giữa

tướng chính phủ ñã ký quyết ñịnh ñồng ý về Chương trình trọng ñiểm và ứng

của côn trùng. Chúng gắn với chất nhận ñặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa
của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao ñổi chất và

dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT ñến năm 2020.
Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian phân

gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21].

hóa từ mô ñến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển

2.4

Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới

gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những

Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ ñược tiến hành tại Mỹ và

nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá ñã ñược tiến hành từ khá sớm.

Pháp năm 1986. Cây thuốc lá là ñối tượng ñược chuyển gen kháng sâu ñầu tiên

Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuyển thành công gen kháng

vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987)

kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens. Trần

[28]. Trung Quốc là quốc gia ñã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng

Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp

bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying

một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit

Chang và cs, 1993). Wong và cs (1992) cũng ñã tạo ñược cây thuốc lá chuyển

vector. Nguyễn ðức Thành và cs (1994) [11] ñã tiến hành nghiên cứu chuyển

gen cry1A(c) mRNA có ñộc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển

gen lục lạp thuốc lá. Trần ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên cứu phương

gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein ñộc tố thu ñược chiếm gần

pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong ñó ñã

1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá. Gen cryIII cũng ñược chuyển vào cây

xác ñịnh ñược mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng ñộ kanamycine (kan)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23


30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, ñã tạo ra

3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, ñã tạo ñược chủng A.

NGHIÊN CỨU

tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS. Vũ
Thị Bản và cs (2007) [2] ñã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá
vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và ñã chuyển ñược gen CP
mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống
C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0.
Cho ñến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu
chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam. Chính vì vậy
chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A.

3.1

Vật liệu, hoá chất, thiết bị

3.1.1 Vật liệu
- Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và
ñã ñược công nhận giống quốc gia, có một số ñặc ñiểm chính như sau:
Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày;
thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt.
Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây
trồng thuốc lá trên cả nước.
- Các vật liệu khác:
+ Các plasmit
Plasmit

Kích thước (bp)

@

pCR 2.1-TOPO

3900

ðặc tính

Nơi cung cấp

Ampiciline

hãng Invitrogen

Kanamycine
pBI121

13000

Kanamycine

Phòng CNTBTV

+ Nguồn gen vip3A do phòng Công nghệ tế bào thực vật phân lập
+ Chủng khuẩn: Chủng DH5α (E.coli) và C58 (A. tumerfaciens)
3.1.2 Hoá chất, thiết bị
- Các enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI
- Enzyme T4 ligase; T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp
- Các hoá chất khác: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform,
kanamycine.... và các hoá chất thông dụng khác
- Thiết bị máy móc:
Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi Gel (Bio - Rad), máy chụp
ảnh, máy ly tâm, máy ño pH, bộ ñiện di, máy PCR, bể ổn nhiệt....

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25


3.2

3.3

ðịa ñiểm và thời gian

Dung dịch II:

- ðịa ñiểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

- 0,2 N NaOH

- Thời gian: từ tháng 8 năm 2008 ñến tháng 9 năm 2009

- 1% SDS
Dung dịch III:

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen

- 60 ml kali acetate 5M

3.3.1.1 Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn

- 28,5 ml H2O
Dung môi loại protein:

- Môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani)
Yeast extract

5g/l

- Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1)

Trypton

10 g/l

- chloroform : isoamyl alchohol (24:1)

NaCl

10 g/l

- TE 0,01M pH 8,0

Bacto agar(cho môi trường ñặc)

15g/l

pH

7

- Phương pháp nuôi cấy:
Khuẩn giữ trong glycerol ñược lấy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bổ
sung kháng sinh thích hợp. Nuôi lắc 200v/p ở 37oC qua ñêm. Sau ñó cấy ria trên
ñĩa petri chứa LB ñặc có kháng sinh, nuôi ở nhiệt ñộ và thời gian thích hợp.

b/ Quy trình:
- Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng
sinh chọn lọc, lắc qua ñêm ở 37oC, 200 v/p.
- Chuyển 2 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf loại 2 ml và ñem
ly tâm 8000 v/p, 5phút, 4oC ñể thu tế bào.
- Cặn ñược hoà trong 100 µl dung dịch I .

- Giữ chủng:

- Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, ñảo nhẹ nhàng

Bổ sung glycerol vô trùng ñến nồng ñộ cuối cùng là 15% vào 0,5 - 1ml

- Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, ñảo nhẹ nhàng

dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua ñêm, trộn ñều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và
0

giữ chủng ở ñiều kiện -80 C.
3.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmit của vi khuẩn E.coli
a. Hoá chất sử dụng:
Dung dịch I:
- 50 mM glucose
- 25 mM Tris HCl pH 8,0
- 10 mM EDTA pH 8,0

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………26

- Thêm 550 µl dung dịch Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25 :
24 : 1), ñảo nhẹ nhàng
- Ly tâm 12.000 v/p, 4oC, 15 phút.
- Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và chiết tiếp bằng
chloroform : isoamyl alchohol (24:1)
- Bổ sung 1ml cồn tuyệt ñối và 10 µl 3M Sodium acetate, ñể lạnh -200C
trong 3 giờ sau ñó ly tâm 12.000v/p trong 15 phút ñể thu DNA
- Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút, làm
khô và hoà cặn trong 40 µl TE 0,01M, giữ ở -200C

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………27


- Bổ sung RNase vào mẫu ñến nồng ñộ cuối cùng là 100 µg/ml, ủ mẫu
0

ở 37 C trong 1 giờ, chiết lại bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) và tủa
bằng cồn 100%
- ðiện di trên gel agarose 0,8% ñể xác ñịnh ñộ sạch của DNA.
3.3.1.3 Phương pháp ñiện di DNA trên gel agarose

b. Tiến hành:
ðiện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy ñoạn
gel chứa ñoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dung dịch QG
theo tỷ lệ 1Vmẫu : 3VQG và ủ trong 50oC trong 15 phút. Sau khi gel tan hoàn
toàn chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực ñại trong 1 phút và

Các ñoạn DNA có khối lượng và ñiện tích khác nhau ñược tách ra khi

loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 1 phút. Bổ

di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng ñiện trường có ñiện thế và

sung tiếp 750 µl dung dịch PE vào cột, ñể ở nhiệt ñộ phòng 5 phút. Sau ñó ly

cường ñộ thích hợp

tâm cực ñại 1 phút, ñổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút ñể loại bỏ hết

a. Hoá chất sử dụng: Agarose 0,8%, dung dịch ñệm TAE 1X (Tris HCl,
EDTA ...); Ethidium bromide (EtBt) 10mg/ml, ñệm tra mẫu 10X.
b. Quy trình:
- Chuẩn bị gel agarose: cho 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch TAE
1X, lắc ñều và ñun cho agarose tan hoàn toàn, ñể nguội ñến khoảng 50 - 60oC,
ñổ dung dịch vào khay ñiện di có cài sẵn răng lược, ñể gel ñông cứng, rút lược
và ñặt bản gel vào bể ñiện di, ñổ dung dịch TAE ngập bản gel từ 1 - 2 mm
- Tra mẫu và ñiện di: mẫu DNA ñược trộn với ñệm tra mẫu 10X theo tỷ
lệ 1: 10, mix ñều và tra vào giếng, chạy ñiện di với thang DNA chuẩn ñể xác
ñịnh trọng lượng phân tử DNA
- Nhuộm bản gel: bản gel ñược lấy ra khỏi khuôn, ngâm 20 - 40 phút
trong dung dịch nước có chứa EtBt, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh
sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh ñược chụp bằng máy soi gel.
3.3.1.4 Tinh sạch DNA từ bảng gel agarose
a. Dụng cụ và hoá chất:
- Cột thôi gel; eppendorf; tip các loại...
- Dung dịch QG (solubilization buffer), dung dịch PE (washing buffer),

PE. Cuối cùng hoà tan DNA trong 30 - 50 µl nước cất.
3.3.1.5 Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn
Các vector ñược xử lý với enzyme giới hạn theo phản ứng:
+ Với một enzyme
Thành phần

Thể tích (µl )

- H2O

5,5

- ðệm 10X riêng của enzyme

1,0

- DNA plasmit

3,0

- Enzyme (10 U/l)

0,5

- Tổng thể tích phản ứng

10,0

+ Với hai enzyme
Thành phần

Thể tích (µl )

- H2O

5,0

- ðệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme

1,0

- DNA plasmit

3,0

- Enzyme 1 (10U/l)

0,5

- Enzyme 2 (10U/l)

0,5

- Tổng thể tích phản ứng

10,0

Phản ứng ñược ủ ở 37oC trong 3 -5 giờ. Sản phẩm cắt ñược kiểm tra

dung dịch EB (elution buffer) hoặc nước cất khử ion ..

bằng ñiện di trên gel agarose 0,8%.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………28

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………29


môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp ñược phát hiện trên môi trường thích

3.3.1.6 Phản ứng ghép nối ñoạn gen với vector:
ðoạn DNA cần nối ghép và vector ñã ñược mở vòng ñược trộn lẫn với
nhau theo tỷ lệ 3 : 1 về số lượng phân tử. T4 ligase ñược cho vào phản ứng với
nồng ñộ 1 ñơn vị/10µl phản ứng. Hỗn hợp phản ứng ñược trộn theo thứ tự:
Thành phần

Thể tích (µl )

hợp. Cấy trải lên ñĩa môi trường LB không có kháng sinh ñể kiểm tra.
b. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào khả biến E. coli bằng sốc nhiệt.
- Bổ sung 5 µl ADN plasmit tiếp vào ống eppendorf chứa sẵn 100 µl tế
bào khả biến ñã ñể trên ñá 30 phút, giữ trên ñá 30 phút.

- H20

1,5

- Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong ñá 5 phút.

- ðệm T4 ligase 10X

1,5

- Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ.
- Cấy trải dịch tế bào lên trên ñĩa LB ñặc có bổ sung kháng sinh thích

- ðoạn gen cần gắn

7,0

- Vector ñã mở vòng

3,0

hợp và nuôi qua ñêm ở 37oC.

- r ATP

1,0

3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng

- T4 ligase

1,0

xung ñiện

15,0

- Chuẩn bị tế bào A. tumefaciens khả biến trong các cuvet ñã khử trùng.

- Tổng thể tích
Phản ứng ñược ủ qua ñêm ở 14oC

- ðặt các ống cuvet ñã khử trùng vào ñá.

3.3.1.7 Biến nạp DNA plasmit tái tổ hợp vào tế bào E.coli
Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ñược tiến
hành theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng của hoá chất

- Bổ sung 5 µl plasmit tái tổ hợp vào 100 µl ñựng sẵn tế bào A.
tumefaciens khả biến

hoặc ñiện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN

- ðảo nhẹ, ñặt trong ñá trong 5 phút, chuyển dịch sang ống cuvet mới

có thể chui vào.

- Xung ñiện: 2,5kw; 25 µF và 400 Ω trong 4 - 5 µ

a. Chuẩn bị tế bào khả biến:

- Chuyển ngay ống dịch vào ñá, sau 5 phút, bổ sung 1 ml môi trường

Chủng khuẩn ñược cấy ria trên môi trường LB ñặc và nuôi qua ñêm ở
37oC, sau ñó lấy một khuẩn lạc ñơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200
v/p ở 37oC qua ñêm. Chuyển 0,5 ml dịch khuẩn sang 50 ml môi trường LB lỏng,
nuôi lắc 200 v/p, 37oC khoảng 3 giờ cho ñến khi OD

660nm

ñạt từ 0,6 - 0,8 thì

chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm ñã giữ lạnh trên ñá và ly tâm 6000 v/p, 10
phút. Thu cặn và hoà nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml CaCl 2 0,1M . Chia vào mỗi
ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung thêm 50 µl glycerol 60%, làm ñông
nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -80 oC. Sau ñó, các tế bào ñược phục hồi trong

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………30

YEP, mix nhẹ và chuyển các tế bào sang ống eppendorf 2ml, nuôi lắc trong
28oC trong 1 giờ
- Cấy trải 100 µl tế bào vào ñĩa chứa môi trường chọn lọc và nuôi từ
24- 48 giờ.
3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo
Topping, 1998 )
Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy cây thuốc lá chuyển gen

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………31


Môi trường

Thành phần cơ bản

MS

Môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog 1962)

Tái sinh chồi (GM)

MS + 1 mg/l BAP + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8

Ra rễ (RM)

MS + 0,1 mg/l IBA + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8

trong 2 ngày.
Sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên GM, các mảnh lá ñược chuyển sang môi
trường MS lỏng (khoảng 5 ml), ñổ dịch huyền phù vi khuẩn vào bình chứa các
mảnh lá và lắc nhẹ nhàng. Sau 10 phút gắp các mảnh lá lên giấy thấm vô trùng,

Chọn lọc chồi (GM Kan 50) GM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan+ 8g/l agar. pH = 5,8

thấm khô và cấy lên môi trường GM , ñồng nuôi cấy 2 ngày, sau ñó cấy chuyển

Chọn lọc cây (RM Kan 50)

các mẫu sang môi trường tái sinh ña chồi chọn lọc GM Kan 30.

RM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan + 8g/l agar. pH = 5,8

3.3.3.3 Chọn lọc chồi sau biến nạp

Quy trình tái sinh cây thuốc lá từ mảnh lá

Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm
Mảnh lá thuốc lá

(MS)

Môi trường tái sinh ña
chồi (GM)

chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 cấy
chuyển sang môi trường tái sinh ña chồi có bổ sung kháng sinh thích hợp ñể
tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh.

Môi trường trấu cát
(1: 1)

Môi trường ra rễ
(RM)

3.3.3.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh
Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi ñộc lập, có 2
- 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc

3.3.3.1 Tạo dịch huyền phù A.tumerfaciens
Chủng vi khuẩn A.tumerfaciens có chứa vector quan tâm bảo quản trong
glycerol trong ñiều kiện lạnh sâu (-80oC) ñược cấy sang môi trường LB lỏng có
bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p trong ñiều kiện 37oC qua ñêm, sau ñó cấy
vạch trên môi trường LB ñặc có kháng sinh thích hợp, nuôi trong ñiều kiện tối,
28oC trong 2 ngày. Chọn một khuẩn lạc tròn, ñều, ñứng ñộc lập ñể cấy chuyển
sang 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p, 37oC
trong 7 - 8 giờ, hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng
sinh, nuôi qua ñêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong ñiều kiện 37oC. Dịch
khuẩn thu ñược có OD660nm từ 0,6 - 1 là ñủ ñiều kiện ñể biến nạp
3.3.3.2 Biến nạp

Từ những cây thuốc lá invitro, chọn những lá bánh tẻ, cắt các mảnh lá
có kích thước khoảng 1cm2 và ñặt trong môi trường tái sinh ña chồi (GM)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………32

(RM Kan 50). Sau 3 tuần, từ những cây tái sinh hoàn chỉnh và phát triển tốt
trên môi trường ra rễ chọn lọc tiếp tục cấy chuyển sang môi trường ra rễ chọn
lọc lần 2 ñể thu cây hoàn chỉnh.
3.3.3.5 Ra cây trên giá thể trấu cát:
Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng
phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm ñể ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1).
Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu ñất trong nhà lưới.
3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Sau khi trồng vào bầu ñất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy
mẫu lá ñể phân tích cây chuyển gen.
3.3.4.1 Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá thuốc lá
a. Hoá chất sử dụng:
Thành phần dung dịch ñệm Shorty buffer:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………33


1.

0,2 M Tris - HCl, pH = 9,0

dNTPs

1,6

2.

0,4 M LiCl

Taq polymerase

0,5

3.

25 mM EDTA

Primer F

0,8

4.

1% SDS

Primer R

0,8

5.

Nước de ion

DNA mẫu

2,0

Tổng

20,0

b. Quy trình
- Nghiền mẫu lá trong Eppendorf loại 2 ml bằmg Nitơ lỏng thành dạng
bột mịn

- Chương trình thực hiện phản ứng PCR

- Bổ sung 500 µl dịch ñệm “Shorty buffer”

Nhiệt ñộ (oC) Thời gian

Bước

Phản ứng

- Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút

1

Biến tính

94

3 phút

Từ bước 2

- Hút 350 µl dịch nổi chuyển sang Eppendorf loại 1,5 ml có chứa sẵn

2

Biến tính

94

*

ñến bước 4

35 µl iso-propanol

Chu kỳ

3

Bắt cặp

*

*

thực hiện 35

- Mix bằng cách ñảo ngược các ống

4

Kéo dài

72

*

chu kỳ

- Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút

5

Hoàn tất kéo dài

72

10 phút

6

Kết thúc phản ứng

4

∞

- Loại dịch nổi
- Bổ sung 700 µl cồn 70%/ống

Ghi chú: *các thông số thay ñổi theo cặp mồi ñặc hiệu

Các thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, lặp lại 3 lần, mỗi thí

- Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút
- Loại bỏ dịch nổi

nghiệm bao gồm 50 mẫu. Thí nghiệm ñược ñặt trong ñiều kiện ánh sáng ñiện

- Làm khô bằng không khí

2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt ñộ trong phòng duy trì ở mức 26oC.

- Bổ sung 50 µl nước ñề ion, lắc nhẹ cho mẫu tan

3.3.4.2 Phản ứng PCR
- Thành phần 1 phản ứng PCR
Thành phần

Thể tích (µl)

Nước cất hai lần

10,3

ðệm (10X)

2,0

MgCl2

2,0

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………34

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………35


3.4

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Các chỉ tiêu theo dõi
∑ số mảnh lá tái sinh ña chồi

Tỷ lệ mảnh lá tái sinh ña chồi (%) =

x 100
∑ số mảnh lá biến nạp

Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A
ðể tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen vip3A, việc thiết kế vector

∑ số cụm chồi tiếp tục tái sinh ña chồi
Tỷ lệ cụm chồi tái sinh (%) =

4.1

x 100

mang gen vip3A ñể chuyển vào cây trồng là một bước quan trọng trong toàn
bộ quá trình tạo cây chuyển gen.

∑ số cụm chồi sau biến nạp

BamHI

SacI

S¶n phÈm PCR vip3A

∑ số chồi ra rễ
Tỷ lệ cây ra rễ (%) =

x 100
∑ số chồi ñưa vào chọn lọc

BamHI

SacI

∑ số cây sống sót
Tỷ lệ cây sống sót (%) =

x 100

35S

gus

NOST

∑ số cây ñưa ra
Bam HI & SacI
BamHI

SacI
vip3A

35S

NOST

T4 ligase
BamHI
35S

SacI
vip3A

NOST

Sơ ñồ 4.1: Sơ ñồ thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A
Gen vip thuộc nhóm gen mã hoá protein Vip (vegetative insecticidal
protein) (protein có trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa) xuất hiện trong pha sinh
trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bt, gây

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………36

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………37


ñộc với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây ñộc ñối

GGATCC: ñiểm cắt của enzyme giới hạn BamHI

với một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera). Trong

GAGCTC: ñiểm cắt của enzyme giới hạn SacI

nhóm gen vip thì gen vip3A ñược ñặc biệt quan tâm nghiên cứu vì chúng mã

4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR

hóa cho các protein có hoạt lực diệt sâu mạnh cùng với phổ hoạt ñộng rộng.

Theo lý thuyết, nếu ta cung cấp cặp mồi ñặc hiệu thì sẽ nhân chính xác

Protein Vip3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy mà protein

ñược ñoạn gen nằm giữa hai mồi ñó. Cặp mồi ñược thiết kế ñể nhân toàn bộ

Cry hầu như không có tác dụng.

gen vip3A có kích thước 2370 bp, nếu phản ứng PCR xảy ra ñặc hiệu thì theo

Gen sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên
cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học. Gen
mã hóa cho protein có kích thước 2369 bp, mã hoá 793 axít amin, ñược công

bố trên ngân hàng gen quốc tế (mã số AJ971413).

lý thuyết sẽ thu ñược băng duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb.
Kết quả ñiện di sản phẩm PCR cho thấy ñoạn DNA mã hoá protein
Vip3A ñã ñược nhân lên một cách ñặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất
có kích thước khoảng 2,4 kb, phù hợp với kích thước gen vip3A dự kiến. Sản

4.1.1 Thiết kế mồi

phẩm PCR sau ñó ñược tinh sạch theo bộ Kit thôi gel (Gel purification Kit)

ðể nhân thành công một gen, ñiều kiện ñầu tiên là có cặp mồi ñặc hiệu
của gen ñó. Cặp mồi ñặc hiệu V2.1 và V2.2 ñược thiết kế ñể nhân gen vip3A

của hãng Bioneer và ñiện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch. Kết quả
ñược thể hiện trên hình 4.1.

dựa trên cơ sở trình tự gen vip3A ñã ñược công bố (phụ lục 2). Ngoài ra mồi

1

2

V2.3 ñược thiết kế thêm ñể kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong cây sau
khi chuyển gen. Các mồi này có những trình tự và thông số cần thiết thể hiện
trên bảng 4.1.
Bảng 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân
2,5 kb

gen vip3A

STT

Trình tự mồi

V2.1 5'-GCGGATCCATGAACAAGAATAATACTAA-3'
V2.2 5'-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGCATCGTA-3'
V2.3 5'-GGAGAGCCATCCTTTTTTACTT-3'

Tm
61oC
62,5oC
55oC

%GC

Vị trí gắn

2,0 kb

2,4 kb

42,8 1 - 20
42,8 2350-2370
40,9 579 - 605

Trên cặp mồi nhân vip3A ñược thiết kế thêm ñiểm cắt của 2 enzyme
giới hạn là BamHI và SacI ñể phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau
này. Mồi xuôi (V2.1) gắn từ vị trí 1 ñến vị trí 20, mồi ngược (V2.2) gắn từ vị
trí số 2370 về vị trí số 2350, mồi ngược V2.3 gắn từ vị trí 605 về vị trí số 579.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………38

Hình 4.1: Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A
1: marker
2: Tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A

Ảnh chụp cho thấy một băng duy nhất có kích thước 2,4 kb, không có

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………39


vạch phụ chứng tỏ sản phẩm sau tinh sạch ñạt yêu cầu ñể dùng cho các thí

ứng của IPTG chuyển hoá cơ chất X - gal thành hợp chất có màu xanh. ðó là

nghiệm tiếp theo.

những vi khuẩn không có ñoạn DNA ngoại lai chèn vào. Khuẩn lạc trắng là

4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng

do gen lacZ ñã bị ñoạn gen DNA ngoại lai chèn vào giữa nên không tổng hợp

Sản phẩm tinh sạch PCR ñược gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR@
2.1-TOPO của hãng Invitrogen ñược cung cấp ở dạng mạch thẳng có bazơ
thiamin nhô ra ở ñầu 3'. Do ñặc tính của Taq - polymerase nên sản phẩm PCR
có ñến hơn 70% là có thêm bazo Adenin ở ñầu 3' do vậy việc liên kết giữa
gen và vector có hiệu quả cao. Phản ứng nối ghép ñược ủ qua ñêm ở nhiệt ñộ
14oC ñể thu plasmit tái tổ hợp.
4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Sản phẩm của phản ứng ghép nối ñược biến nạp vào tế bào khả biến

ñược enzyme β - galactosidase và ñây có thể là những khuẩn lạc có thể chứa
plasmit tái tổ hợp.
4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp
Việc kiểm tra xem các khuẩn lạc có chứa các plasmit tái tổ hợp hay
không là việc rất quan trong ñể chọn vật liệu chính xác cho các thí nghiệm
tiếp theo.
Chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc trắng, nuôi lỏng và tách chiết DNA
plasmit, ñiện di trên agarose 0,8%, sau ñó cắt kiểm tra bằng hai enzyme
BamHI và SacI. Kết quả ñiện di sản phẩm cắt thể hiện trong hình 4.3.

E.coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiệt (Cohen và cộng sự, 1972),
sau ñó ñược cấy trải trên môi trường LB ñặc có bổ sung ampicillin (100 µg/l),
X- gal (100 µg/l) và chất cảm ứng IPTG 0,1M, nuôi qua ñêm. Kết quả ñược
thể hiện trên hình 4.2.

Hình 4.3: Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit
1: Marker
Hình 4.2 : Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Trên ñĩa nuôi cấy thu ñược cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng.
Khuẩn lạc xanh là do trong vector pCR@ 2.1-TOPO có chứa gen lacZ, nếu

2 - 11: Các plasmit tách từ khuẩn lạc trắng ñược cắt bằng BamHI và SacI
:

12: Plasmit tách từ khuẩn lạc xanh ñược cắt bằng EcoRI
13: Plasmit tách từ khuẩn lạc trắng ñối chứng không cắt

Các plasmit tái tổ hợp ñược tách từ khuẩn lạc trắng sau khi ñược cắt

hoạt ñộng bình thường sẽ tổng hợp enzyme β - galactosidase và dưới sự cảm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………40

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………41