Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng (TT)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HOÀNG THỊ GIANG

TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG
BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI
VÀ KHOAI TÂY TRỒNG

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
MÃ SỐ: 62 62 01 11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2016


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Ngƣời hƣớng dẫn: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH
2. TS. RAMONA THIEME

Phản biện 1:

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC THÀNH
Viện Công nghệ Sinh học

Phản biện 2:

PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 3:

PGS.TS. ĐẶNG TRỌNG LƢƠNG
Viện Di truyền Nông nghiệp

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

giờ, ngày

tháng

năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong các bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sương do Phytophthora
infestans (Mont.) de Bary gây ra được coi là bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong
điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa
màng trong vòng một đến hai tuần lễ. Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh
hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trường vừa tăng chi phí sản xuất
(Darsow et al., 2008) nhưng vẫn không giảm thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc
sương có tính di truyền khá linh động và thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc

hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sương được coi là một biện pháp hiệu quả.
Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và 1960) tập
trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng mốc sương từ
loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R được chuyển vào khoai tây. Mặc dù
gen kháng chính có hiệu quả cao, nhưng tính kháng ở các giống mang gen kháng
chính R nhanh chóng bị vượt qua vì nấm mốc sương có khả năng thích nghi với cây
kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002). Tuy nhiên, nhiều chiến
lược khác nhau được xem xét để sử dụng nhiều gen kháng để tạo ra khả năng kháng
đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009; Darsow, 2014) và sử dụng các
gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen kháng từ các nguồn khác
nhau được tích tụ nhờ phương pháp lai chuyển gen truyền thống và sử dụng chị thị
phân tử (Tan et al., 2008, 2010).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại mang nguồn gen
kháng bệnh mốc sương cao (Szczerbakowa et al., 2005, Thieme et al., 2008, 2010).
Tuy nhiên, rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đường lai hữu tính giữa
các loài hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách
ly về sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lượng
nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010). Để
khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai
bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần để tạo con
lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et
al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen kháng vào khoai
tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các tính trạng đơn gen
và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhưng vẫn bảo toàn được hệ gen nhân
và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn vật liệu đa dạng mang mức
kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Davey et al., 2005;
Thieme et al., 2010).
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định được các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần
giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sương và các giống khoai tây

1


trồng mẫn cảm với bệnh mốc sương.
Tạo được các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây
dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc
sương từ loài dại vào khoai tây trồng.
Tạo được các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống
khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo được dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen
kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây
kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trên cơ sở thu thập được nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại mang
nguồn gen kháng bệnh mốc sương, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tách, dung
hợp tạo các thể lai soma cải thiện được khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời
tổ hợp được những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền đa dạng di truyền đã
tạo ra tiền hành đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng kháng bệnh mốc
sương và mang các đặc tính nông sinh học quý.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đã xác định được các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại
mang gen kháng bệnh mốc sương và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch
enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong
dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung
hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện
là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trường nuôi cấy các sản phẩm sau
dung hợp là môi trường VKMII lỏng; môi trường Cul-medium để tạo callus và môi
trường RJM để tái sinh chồi.
Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x)
mang gen kháng bệnh mốc sương (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii)
với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm với bệnh

mốc sương (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhưng có năng suất và
chất lượng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại
S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và
2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu
kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng
bệnh của Việt Nam.
Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo được
11 tổ hợp lai và chọn được 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x
Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh
mốc sương đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu
có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nước ta.
2


1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn giống cây
trồng. Đề tài cũng là một bước phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế bào thực vật
(kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết quả của đề tài có
giá trị khoa học cả trong nước và quốc tế. Đề tài đã góp phần chứng minh khả năng
chuyển được tính kháng bệnh mốc sương từ các loài khoai tây dại sang các giống
khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng dụng thành công kết quả này
trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các loại bệnh quan trọng.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đã chọn tạo được thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây
trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2,
13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời
có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chương
trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
Theo số liệu tổng kết của FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai tây
trên thế giới năm 2013 là 19.463.041 ha, trong đó khu vực Châu Á chiếm 51,68%
tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới, Việt Nam có diện tích trồng khoai tây
năm 2013 là 23.077 ha). Năng suất bình quân của thế giới là 18,9 tấn/ha trong đó
năng suất bình quân thực tế của Việt Nam chúng ta mới chỉ đạt 13,6 tấn/ha. Vấn đề
khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống, đặc biệt là các
giống khoai tây sạch bệnh. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng từ
20-25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…
2.2. NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC NGUỒN
GEN KHOAI TÂY DẠI
Có rất nhiều các loài dại đã được phát hiện mang các đặc tính kháng sâu bệnh
và chống chịu với các điều kiện bất thuận đã được phát hiện và khai thác vào nguồn
gen khoai tây trồng. Ross (1986) đã chỉ ra rằng có 6 loài khoai tây dại được khai
thác cho các giống khoai tây trồng của Châu Âu bao gồm: S. demissum (kháng mốc
sương, PLRV), S. acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder và chịu
sương giá), S. stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S. chacoense (Kháng PVA, PVY,
mốc sương, Colorado beetle, bọ nhậy), S. spegazzinii (kháng Fusarium, wart,
Globodera), S. vernei (kháng GloboderaI, có hàm lượng tinh bột cao). Theo thời
gian, nguồn gen kháng từ các loài khoai tây dại đã được khai thác và chuyển vào
nguồn gen khoai tây trồng.
3


2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao gồm: tách, nuôi cấy và tái sinh
tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma. Để tách được tế bào
trần người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme.
Trong đó phương pháp enzyme hiện nay được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả
cao.Tế bào trần sau khi được tách được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp

có khả năng tái tạo thành tế bào, phân chia và tạo cây hoàn chỉnh. Những yêu cầu
về mặt dinh dưỡng cho việc nuôi cấy tế bào trần gần giống với môi trường nuôi cấy
mô tế bào. Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố
trong đó có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần được hòa lơ
lửng trong môi trường lỏng ở mật độ khoảng 10 5 tế bào trần /ml trong hộp chứa
một lớp mỏng môi trường và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt
đã được phát triển bởi Kao et al. (1974).
Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào
chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ
thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ
thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố: giai
đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của loài
thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể
hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào được tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần
không còn giữ nguyên hình dạng như ban đầu. (Nguyễn Quang Thạch và cs.,
2009). Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào goi là microcallus
(những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào). Sau
3-8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề
mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM
(Möllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus. Khoảng 812 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được
chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh.
Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách
tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất
polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điệnelectrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên.
Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được
áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh,
hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào.
Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do
không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này
4

(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).
Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp bởi
các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70% (Nguyễn
Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là không đơn
giản, cần phải có các phương pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách được các cá thể lai
heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chưa dung hợp khi tái
sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết, người ta có thể sử
dụng cả “bố”, “mẹ” có đặc trưng rất khác nhau để dễ dàng thanh lọc ra các thể lai
trên môi trường chọn lọc. Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD,
RELP, PCR) hoặc isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các
gen của cả bố và mẹ dung hợp.
2.4. BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY
Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại
nghiêm trọng bậc nhất cho cây khoai tây, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ
rất nguy hiểm ở các vùng chuyên canh. Một nguồn gen kháng mốc sương mới được
phát hiện gần đây và hiện đang được tập trung nghiên cứu là các gen kháng có
nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum. Đây là loài dại nhị bội, có
nguồn gốc từ vùng trung Mỹ, phát triển tại vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300
mét so với mực nước biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005). Cho đến
nay các nhà khoa học đã phát hiện và nhân dòng được 4 gen kháng bệnh mốc sương
có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine
(NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay còn được biết
đến với tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpiblb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) được phát hiện từ phép
lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum.
2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY
2.5.1. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống
Các phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thường được áp dụng như
kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al., 1985).

Nhược điểm của phương pháp truyền thống là vấp phải những khó khăn về mặt đặc
tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum).
2.5.2. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen trên cây khoai tây đã được ứng dụng để chuyển gen
kháng bệnh virus, kháng bệnh mốc sương, bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh
(Verticillium wilt) và rệp. Tuy nhiên phương pháp chuyển gen còn nhiều hạn chế:
nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng
công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các
5


tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến; nhiều gen rất khó để tách ra được và
nhân dòng thành công; ngoài ra do khoai tây là cây lương thực, thực phẩm nên vẫn
còn nhiều tranh cãi về sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO).
2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần
Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để
chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính
(Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et al.,
1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium
(Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al.,
1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et
al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994;
Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al.,
1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995).
Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S. tuberosum (2n = 2x
và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô (S.pinnasisexta và
S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Dinu and Thieme (2000) đã
tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai tây dại với các giống khoai tây trồng S.
tuberosum L., các dòng khoai tây chọn tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển
các gen kháng bệnh mốc sương và các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng.

Thieme et al. (2010) cũng đã tạo được các con lai không chỉ đa dạng về hình thái, các
tính trạng nông sinh học mà chúng cũng đồng thời kháng được cả bệnh và sâu hại.
Để chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại Solanum
michoacanum (mch) (có khả năng kháng bệnh mốc sương cao) vào khoai tây
trồng Solanum tuberosum, các phép lai soma bằng dung hợp tế bào trần đã được
áp dụng giữa mch với 2 dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 và DG 88-89 và giống
khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sương (Smyda et al., 2013).
Tiếp nối các nghiên cứu này, Smyda et al. (2016) đã dung chỉ thị DArT (Diversity
array technology) để phân tích thành phần genom nhân của 97 con lai soma của tổ
hợp lai giữa S.michoacanum với S.tuberosum và 11 con lai cùng loài 4x mch
(những con lai có tính kháng bệnh mốc sương). Phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể
của các con lai đã cho thấy sự có mặt hay không có mặt của các chỉ thị phân tử từ
genom của cả bố và mẹ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể của các con lai soma.
Ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ. Hướng
nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập
nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Gần đây,
nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã được
bắt đầu tiến hành ở Việt Nam (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2009, 2011, 2012; Đỗ
6


Thị Thu Hà và cs., 2012, Đinh Thị Thu Lê và cs, 2012, Vũ Thị Thu hằng và cs., 2012).
Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo các con lai soma tổ
hợp được đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ
khoai tây trồng. Đây là hướng đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình
chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam.
PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành tại Viện Sinh học nông nghiệp – Học Viện Nông
nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI- CHLB

Đức) trong thời gian nghiên cứu từ năm 2011 đến năm 2015.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sương: S. bulbocastanum, S. tarnii,
S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz
Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank).
Các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi
với điều kiện khí hậu ở Việt Nam.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3.1. Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại
với các giống khoai tây trồng
- Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic
- Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây
trồng thu thập được
- Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
3.3.2. Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội
(Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR
- Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội Flow cytometry
- Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR
3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai
soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử
- Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm
nhân tạo và chỉ thị phân tử
- Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma
3.3.4. Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để
tạo quần thể chọn lọc
- Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng
- Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về khả năng
kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học
7

3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống
khoai tây trồng
3.4.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào
trần thu được
Vật liệu được nhân 10-20 cây in vitro/mỗi kiểu gen bố mẹ trong bình thủy
tinh từ 3-4 tuần tuổi, trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 22oC, để các nguyên liệu
này trong tối trước khi tiến hành các thí nghiệm dung hợp. Phương pháp tách tế bào
trần (Theo quy trình Cooking et al. (1960), có cải tiến theo Thach et al. (1993) và
Thieme et al. (1997)).
Tiến hành tách tế bào trần ở 4 nồng độ enzym khác nhau: E1 = Dung dịch
enzym 1: có 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulase; E2 = Dung dịch enzym 2: có 0,1%
Macerozym, 0,6% Cellulase, E3 = Dung dịch enzym 3:có 0,1% Macerozym, 0,8%
Cellulase; E4 = Dung dịch enzym 4: có 0,1% Macerozym, 1% Cellulase.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến
mật độ tế bào trần thu được
Tiến hành ủ các mẫu lá của các dòng/giống khoai tây (đã được cắt nhỏ và xử
lý qua dung dịch gây co nguyên sinh) ở các thời gian ủ khác nhau trong dung dịch
enzym: 13 giờ; 14 giờ; 15 giờ và 16 giờ.
3.4.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây
trồng thu thập được (Theo Thieme et al., 2008)
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất
lượng tế bào sau dung hợp
Tiến hành dung hợp tế bào trần ở mật độ 2 x 10 5 tế bào/ml trong dung dịch
dung hợp với các thông số dung hợp khác nhau: CT1: AC=700 kHz+ 3 lần xung
(Rokka et al., 1994), CT2: 800 kHz+ 2 lần xung, CT3: 900 kHz+2 lần xung, CT4:
1000KHz+1 lần xung.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp

Tiến hành thí nghiệm dung hợp với các thông số dung hợp tối ưu đã tìm ra ở
thí nghiệm trên với các mật độ khác nhau: 1x 105 tế bào trần/ml ; 2x 105 tế bào
trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml, 4 x 105 tế bào trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế
bào sau dung hợp
Theo dõi ảnh hưởng của các tổ hợp lai khác nhau đến kết quả tái sinh sau
dung hợp
3.4.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân
chia của tế bào trần sau khi dung hợp
8


Tiến hành nuôi cấy các tổ hợp lai trên 3 nền môi trường: VKM II lỏng (không
chứa agar); VKM II bán lỏng (nhỏ giọt agar) và VKM II rắn (bổ sung 5g agar/lít
môi trường).
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia
của các tổ hợp lai sau dung hợp
Tiến hành nuôi cấy các tổ hợp lai trên các loại môi trường lỏng khác nhau:
môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001),
KM8P* (Davey et al. 1994).
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh
chồi của các tổ hợp lai
Cấy chuyển các callus trên các môi trường tái sinh khác nhau: RIM (Masson et al.,
1988), MSO (Pan et al., 2004), K8P (Wei et al., 1994).
3.4.2. Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội (Flow
cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR
Thí nghiệm 9. Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội
Flow cytometry (Theo Thieme et al., 2008)
Sử dụng nguyên liệu lá cây in vitro của các kiểu gen khác nhau bao gồm các

dòng đối chứng (nhị bội), con lai sau dung hợp, giống khoai tây trồng tứ bội. Sử dụng
máy xác định độ bội Cell Lab QuantaTM Flow cytometry (Beckman Counter).
Thí nghiệm 10. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR
Các con lai ngẫu nhiên được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Theo Dinu
and Thieme, 2001) sử dụng cặp mồi (theo Song et al., 2005). Các con lai ngẫu nhiên
được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001).
3.4.3. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử
3.4.3.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử
Thí nghiệm 11. Phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây
nhiễm (theo Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009)
Phân lập nấm ở các vùng sinh thái khác nhau (Trong thí nghiệm này tiến
hành thu thập ở 2 vùng trồng khoai tây là Hà Nội và Lạng Sơn). Tiến hành nuôi
nguồn nấm bệnh phân lập được trên lát cắt củ. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, dùng
hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai số giữa các lần lặp lại.
Thí nghiệm 12. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời – Detached Leaflet Assay (Theo
Darsow et al., 2004, 2008; Hammann et al., 2009)
Mẫu lá khoai tây được lấy từ các cây trồng trong chậu vại hoặc trên đồng
9


ruộng ở giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa. Mỗi kiểu gen lặp lại 5 lần (lấy 5 lá). Nhỏ
dung dịch lây nhiễm với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml (mỗi giọt khoảng 20 30µl) lên chính giữa bề mặt lá, đặt trong điều kiện 12h tối/12h sáng, nhiệt độ 18 –
200C, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện
sau 5-6 ngày sau khi lây nhiễm. Tiến hành đo vết bệnh theo Darsow et al., 2004,
2008 và Hammann et al., 2009. Đo kích thước vết hoại tử bề mặt trước của lá theo
điểm từ 1-9: Điểm 1: không có vết bệnh ở cả mặt trước và mặt sau lá; điểm 2: có 1
điểm ở bề mặt sau lá; không có vết bệnh ở bề mặt trước lá; điểm 3: 1-4 % vùng lá

bị nhiễm bệnh, khoảng 4 cm2; điểm 4: 5-12% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 5:
13-30% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 6: 31-55% diện tích lá bị nhiễm bệnh;
điểm 7: 56-78% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 8: 79-96% diện tích lá bị nhiễm
bệnh; điểm 9: 97-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Đo sự hình thành bào tử nấm ở
bề mặt sau của lá: điểm 1: từ không có triệu chúng vết bệnh hoạc vết hoại tử 24mm; điểm 2: nhiễm trung bình 5-55% diện tích bề mặt lá; điểm 3: 56-100% diện
tích lá bị nhiễm bệnh.
Thí nghiệm 13. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test) (Darsow et al., 2004;
Hammann et al., 2009)
Củ mới được thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củ được bảo quản trong kho
lạnh từ 1 – 2 tháng ở nhiệt độ 8 – 90C. Mỗi kiểu gen được lặp lại 5 lần (5 lát củ). Nhỏ
lên mỗi lát củ 1 giọt dung dịch dịnh lây nhiễm (20 - 30µl) với nồng độ 1,5x104túi
bào tử/ml, trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90%
đến bão hòa. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7-10 ngày. Đánh giá và cho điểm
dựa vào kích thước vết hoại tử trên lát cắt củ (Darsow et al., 2004; Hammann et al.,
2009) theo điểm từ 1-9: điểm 1: không có vết bệnh; điểm 2: 1% diện tích lát củ bị
nhiễm bệnh (20mm2); điểm 3: 0,5-5% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (150mm2);
điểm 4: 6-12% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (300mm2); điểm 5: 25% diện tích lát
củ bị nhiễm bệnh; điểm 6: 43% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 7: 62% diện
tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 8: 85% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 9: 96100% diện tích củ bị nhiễm bệnh.
Thí nghiệm 14. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)
Thí nghiệm trên đồng ruộng được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần
lặp lại có 15 cây trên 3 luống (bao gồm cả các giống đối chứng và các dòng mang
gen kháng R). Nồng độ dung dịch lâu nhiễm là 20 x 10 3 bọc động bào tử/ml. Tiến
hành lây nhiễm tại thời điểm khi cây bắt đầu hoặc kết thúc có hoa vào lúc tối muộn
khi trời ẩm ướt (lây nhiễm theo kiểu dạng dạng phun mù). Triệu chứng sẽ bắt đầu
10

xuất hiện sau 1 tuần lây nhiễm. Tiến hành đo vết bệnh ít nhất 5 lần khi sự nhiễm
bệnh bắt đầu từ 0,1% - 100%. Đánh giá phản ứng của bệnh trong toàn bộ quá trình
phát triển của bệnh theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease
Progress Curve - AUDPC) và chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian tương đối (r)
AUDPC; Phân tích sự sai khác (variance) được sử dụng để đánh giá tất cả các
giống. Kết quả có thể được so sánh với giống đối chứng) (Truberg et al., 2008).
Thí nghiệm 15. Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị
phân tử
Xác định các gen kháng Rpi-blb ở các con lai soma có sử dụng các mồi đặc hiệu
của các gen: Rpi-blb1, (Wang et al., 2008) và Rpi-blb3 (Lokossou et al., 2010).
3.4.3.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con
lai soma
Thí nghiệm 16. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học
của các con lai soma
Các dòng con lai soma và các dòng bố mẹ sau nuôi cấy in vitro 4 tuần được
trồng vào vụ Đông – Xuân năm 2013-2014 tại cánh đồng thực nghiệm- Viện Sinh
học Nông nghiệp để đánh giá các tính trạng về hình thái, sinh trưởng, phát triển, các
yếu tố cấu thành năng suất cũng như khả năng kháng bệnh. Thí nghiệm được bố trí 3
lần lặp cho mỗi dòng, mỗi lần lặp lại 10 cây. Phương pháp đánh giá: theo tiêu chuẩn
ngành (số 32-1998/QĐ-BNN-KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998) và quy chuẩn của
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT).
3.4.4. Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần
thể chọn lọc
Thí nghiệm 17. Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về
khả năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học
Các hạt lai khoai tây được xử lý ngủ nghỉ bằng dung dịch Gibberelic Acid
Solution (GA3 nồng độ 1mg/l). Khi hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật thì phun
dịch lây nhiễm bệnh mốc sương (nồng độ dịch lây nhiễm là 6000 túi bào tử/ml),
Triệu chứng sẽ xất hiện sau 3 ngày, giữ lại cây khỏe và loại bỏ những cây bệnh.
Dùng thuốc trừ nấm phun phòng cho những cây khỏe sau lây nhiễm. Tiếp tục chăm

sóc cho đến khi thu hoạch củ.
3.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
+ Số liệu trong các thí nghiệm tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần
được xử lý theo chương trình EXCEL (thí nghiệm 1; 2; 3; 4 và 5)
+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá cho điểm bệnh mốc sương được xử lý
theo chương trình EXCEL, dùng hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai
số giữa các lần lặp lại (thí nghiệm 11; 12 và 13).
11


+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá các đặc tính nông sinh học của các
con lai (các chỉ tiêu: chiều cao cây, số củ trung bình/khóm, khối lượng củ trung
bình/khóm trong thí nghiệm 16) được xử lý thông kê đánh giá sự sai khác có ý
nghĩa ở mức α = 0,05 theo phần mềm SAS 9.1.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ
4.1.1. Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống
khoai tây trồng
4.1.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic
a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần
thu được
Các loại dung dịch enzym khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả
tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dòng/giống khoai
tây cần một loại dung dịch enzyme phù hợp: dung dịch E1 (0,2% Macerozym và
0,8% Cellulase) sử dụng để tách tế bào trần của các dòng/giống blb2G, trn3G,
Rasant, Agave; dung dịch E2 (0,1% Macerozym và 0,6% dùng để tách tế bào trần
của các dòng/giống pnt2G và Delikat; dung dịch E3 (0,1% Macerozym và 0,8%
Cellulase); dung dịch E4 (0,1% Macerozym và 1% Cellulase) dùng để tách tế bào
trần của giống Atlantic
b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến

hiệu suất tách tế bào trần
Thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả
tách tế bào trần. Thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối
với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ (bảng 4.1).
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến
hiệu suất tế bào trần thu đƣợc
Thời gian ủ (giờ) (số tế bào trần/ml)
Tên
dòng/giống
13 giờ
14 giờ
15 giờ
16 giờ
5
5
5
pnt2G
0,9 x 10
2,5 x 10
3,0 x 10
3,9 x 105
blb2G
1,4 x 105
2,9 x 105
2, 6 x 105
3, 4 x 105
trn3G
1,1 x 105
2,9 x 105
3,4 x 105

4,0x 105
Delikat
1,2 x 105
2,8 x 105
2,8 x 105
3,6 x 105
Quatar
1,2 x 105
2,9 x 105
3,3x 105
3,4 x 105
Rasant
2,4 x 105
3,8 x 105
2,8 x 105
4,6 x 105
Agave
2,1 x 105
3,9 x 105
2,5 x 105
4,4 x 105
Atlantic
2,1 x 105
3, 1 x 105
2,1 x 105
3,5 x 105
12


4.1.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây

trồng thu thập được
a. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào
sau dung hợp
Tế bào được dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800kHz và 2 lần xung), tế
bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 2 ngày nuôi
cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, số
macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 85,4 macrocallus/đĩa) (bảng 4.2).
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào
sau dung hợp của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat
Thời gian tế bào
Thời gian xuất hiện
Số lƣợng
STT CT
phân chia (ngày)
microcallus (ngày)
macrocallus/đĩa
1
CT1
3
21
49,5
2
CT2
2
18
65,4
4
28
27,6
3

CT3
4
CT4
4
24
38,2
Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ 2 lần
xung, CT3- 900 kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung

b. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp
Mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai
lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm
và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng (bảng 4.3). Dung hợp ở mật độ 4 x 105 tế
bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai
6x ở mật độ dung hợp này là 65,6% con lai là con lai 6x . Như vậy mật độ xung cho
hiệu quả dung hợp tạo con lai 6x cao nhất là 4 x 105 tế bào/ml (bảng 4.3).
Bảng 4.3. Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ
tế bào dung hợp khác nhau của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat
Mật độ Thời gian
Số
Số cây
Tỷ lệ
Tỷ lệ
Tỷ lệ
xung hợp xuất hiện macrocallus/đĩa tái sinh cây 2x cây 4x cây 6x
(tế bào/ phân chia
Sau 4 ngày
(cây)
(%)
(%)

(%)
ml)
(ngày)
Sau 8 tuần
5
3
28,5
16
56,3
25,0
18,7
1x 10
5
2
75,7
35
37,1
34,3
28,6
2 x 10
5
2
85,6
46
13,9
45,6
40,5
3 x 10
5
2

68,3
47
14,9
31,9
53,2
4x 10
5
2
62,6
29
10,3
24,1
65,6
5 x 10
Chú thích: dung hợp với các thông số AC= 800 kHz, DC=120V và 2 lần xung

c. Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào
sau dung hợp
Toàn bộ các tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy ra sau 2-3 ngày nuôi cấy. Khả
năng tạo macrocallus và tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ thuộc vào
13


bản chất di truyền của dòng cây nghiên cứu. Tổng cộng đã tạo được 7 tổ hợp lai giữa
các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng (bảng 4.4).
Bảng 4.4. Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống
khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện
STT
Tên tổ hợp lai
Số lƣợng

Số lƣợng chồi
Tỷ lệ tái
callus tái sinh
tái sinh
sinh (%)
1
trn3G + Agave
120
39
32,5
2
trn3G + Rasant
97
25
25,8
3
blb2G + Delikat
250
31
12,4
4
trn3G + Delikat
250
64
25,6
5
Pnt2G + Atlantic
193
23
11,9

6
blb2G + Atlantic
307
4
1,3
7
trn3G + Atlantic
395
2
0,5
Tổng
1612
188
4.1.2. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
a. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân chia
của tế bào trần sau khi dung hợp
Trên môi trường lỏng VKMII, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào trần của
các các tổ hợp lai từ sau 2-3 ngày đã bắt đầu phân chia phục thuộc vào các tổ hợp lai
khác nhau. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus
sau khoảng 2 tuần nuôi cấy. Trên môi trường lỏng, hầu như các tế bào phân chia tạo
hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lượng microcallus trắng sáng, kích
thước hạt to như hạt tấm. Trong khi đó các tế bào trần trên môi trường bán lỏng (nhỏ
giọt agar) có thời gian xuất hiện phân chia lâu hơn (sau từ 4-7 ngày). Trên môi
trường rắn, các tế bào hầu như không có khả năng phân chia hoặc chỉ có rất ít tổ hợp
có xuất hiện phân chia tế bào (blb2G + Delikat; trn3G + Delikat; blb2G + Atlantic)
nhưng sau thời gian lâu hơn rất nhiều (trên 9 ngày) (bảng 4.5).
Bảng 4.5. Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện
môi trƣờng khác nhau*
Thời gian xuất hiện tế
Thời gian xuất hiện

bào phân chia (ngày)
microcallus (ngày)
Tổ hợp lai
Lỏng Bán lỏng Rắn
Lỏng
Bán lỏng
Rắn
trn3G + Agave
3
4
12
21
trn3G + Rasant
3
3
14
21
blb2G + Delikat
2
5
15
11
26
trn3G + Delikat
3
6
9
12
25
pnt2G + Atlantic

2
6
10
22
blb2G + Atlantic
3
5
11
12
23
trn3G + Atlantic
3
4
14
24
Chú thích: (*) 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên
môi trường VKM II trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia.
14


b. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái
sinh của các tổ hợp lai sau dung hợp
Các tế bào trần nuôi cấy trên môi trường VKMII bắt đầu phân chia chỉ sau 23 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn
bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Các tổ hợp lai
khác nhau cũng có sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau trên môi
trường VKMII. Như vậy: môi trường VKMII lỏng là môi trường thích hợp để nuôi
cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp (bảng 4.6).
Bảng 4.6. Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau

Tổ hợp lai

Thời gian xuất
hiện tế bào phân
chia (ngày)

Thời gian xuất
Số lƣợng
hiện microcallus microcallus trung
(ngày)
bình/đĩa petri

VK
MII

A*

KM8P VKM
KM8 VK
A*
*
II
P* MII

A*

KM8
P*

trn3G + Agave

3

5

6

12

-

-

22,7

-

-

trn3G + Rasant

3

4

5

14

21

-

13,3

4,4

-

blb2G + Delikat

2

7

5

11

-

-

29,6

-

-

trn3G

+ Delikat

3

9

4

12

21

-

35,7

-

5,8

Pnt2G + Atlantic

2

6

6

10

-

22

48,3

-

1,3

blb2G + Atlantic

3

9

4

12

-

-

5,1

-

-

trn3G + Atlantic

3

7

8

14

21

-

9,4

5,9

-

Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên
môi trường lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia

c. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi
của các tổ hợp lai
Trên môi trường RJM, hầu như các tổ hợp lai đều có khả năng tái sinh tạo
chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 chồi/đĩa. Khả năng tạo chồi của
các tổ hợp lai khác nhau cũng khác nhau rõ rệt. Các tổ hợp lai trn3G + Delikat,
pnt3G +Atlantic có khả năng tái sinh cao với số chồi trung bình/đĩa lần lượt là 8,8
và 6,4. Các chồi này phát triển tốt, màu xanh. Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G

+Atlantic có khả năng tái sinh kém, chất lượng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8).
Tổng hợp các kết quả nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp thì thấy đã tái
sinh được tổng số 1612 callus và tạo được 188 chồi trong đó tỷ lệ tái sinh chồi của
các tổ hợp lai khác nhau rõ rệt (bảng 4.7).
15


Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo
chồi của các tổ hợp lai
Số lƣợng chồi tái sinh/chất lƣợng chồi
Tổ hợp lai
Môi trƣờng
Môi trƣờng
Môi trƣờng K8P
RJM
MSO
trn3G + Agave
3,3/++
0,8/+
2,5/+
trn3G + Rasant
5,5/++
1,6/+
1,3/+
blb2G + Delikat
6,5/++
0/2,4/+
trn3G + Delikat
8,8/++
0/0,8/pnt2G + Atlantic

6,4/++
1,65/+
0/blb2G + Atlantic
1,7/+
0/0/trn3G + Atlantic
2,3/0/0/(-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh

4.1.3. Xác định con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội thể (Flow
cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR

4.1.3.1. Xác định con lai soma bằng phương pháp đo độ bội thể (Flow
cytometry)
Thí nghiệm 9: Xác định con lai soma bằng phương pháp đo độ bội
Từ kết quả dung hợp tế bào trần đã tạo được 07 tổ hợp lai giữa các dòng
khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội. Các tổ hợp lai được nuôi
cấy tái sinh để tạo microcallus, macrocallus và tái sinh chồi. Sử dụng phương pháp
phân tích độ bội Flow cyometry để đo độ bội thể của các con lai.
Từ 188 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 82 cây có độ bội thể 2n=6x (chiếm
tỷ lệ 43,6 %). Tỷ lệ cây lục bội (2n=6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác
nhau. Trong 7 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai Delikat (+) trn3G cho tỷ lệ cây tái
sinh có độ bội thể 6x là cao nhất trong khi đó tổ hợp lai giữa Atlantic (+) trn 3G
không cho kết quả tạo con lai lục bội (bảng 4.8).
Bảng 4.8. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp
STT Tên tổ hợp lai
Số lƣợng
Số lƣợng chồi
Số dòng lục
callus tái sinh
tái sinh
bội (2n= 6x)

1
trn3G + Agave
120
39
15
2
trn3G + Rasant
97
25
12
3
blb2G +Delikat
250
31
15
4
trn3G + Delikat
250
64
28
5
pnt2G +Atlantic
193
23
9
6
blb2G + Atlantic
307
4
3

7
trn3G + Atlantic
395
2
0
1612
188
82
Tổng
16


4.1.3.2. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử
Thí nghiệm 10: Xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử
Trong số 188 con lai tái sinh có 82 con có độ bội 6x nhưng chỉ có 69 con có
kiểu gen dị hợp nhân. Tùy thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau, tỷ lệ con lai soma của
các tổ hợp dung hợp là rất khác nhau (2/11 tổ hợp dung hợp không có con lai soma
có kiểu gen dị hợp nhân).
Bảng 4.9. Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội thể
và chỉ thị phân tử SSR
Số cây
Tỷ lệ con
Số dòng Số dòng lai
Tên mồi
xác
lai soma/
Tổ hợp lai
lục bội
soma
xác định

định
dòng tái
(2n= 6x) (Hetezygous)
con lai
độ bội
sinh (%)
trn3G + Agave
39
15
15
38,5
STM2022
trn3G + Rasant
25
12
6
24,0
STM2022,
STIIKA
blb2G + Delikat
31
15
14
45,2
STM2022
trn3G + Delikat
64
28
28
43,7

STM2022
pnt2G +Atlantic
23
9
6
26,1
STM3023
blb2G + Atlantic
4
3
0
0,0
STM1106
trn3G + Atlantic
2
0
0
0,0
STM1104
Tống
1612
82
69
4.1.4. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử
4.1.4.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử
a. Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây nhiễm
Mẫu nấm mốc sương được phân lập từ mẫu lá bệnh thu thập ở các vùng trồng
khoai tây tại Hà Nội và Lạng Sơn. Nguồn nấm được nuôi trên các lát củ, sau 6 – 7

ngày triệu chứng của nấm xuất hiện trên lát cắt củ. Nguồn nấm bệnh phân lập được
từ 2 vùng sinh thái khác nhau đều thể hiện tính độc trên các giống khoai tây trồng
tại Việt Nam, thể hiện mức độ gây bệnh khá cao trên các đối tượng khảo sát. Sau
khi xử lý số liệu thống kê chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác về tính độc giữa
2 chủng nấm được phân lập. Nguồn nấm bệnh này hoàn toàn có thể sử dụng cho các
thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo.
b. Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời
Kết quả đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo cho thấy các dòng khoai tây dại sử
dụng để dung hợp S.bulbocastanum; S. tarnii và S. pinnatisectum đều có đặc tính
kháng tốt với bệnh mốc sương (điểm đánh giá kích thước vết hoại tử nằm trong
17


khoảng từ 1,0 – 1,8), trong khi các giống khoai tây trồng Delikat, Agave, Atlantic,
Quarta, Rasant có tính kháng bệnh mốc sương khá thấp (điểm đánh giá vết hoại tử
nằm trong khoảng từ 3,6-4,6). Các tổ hợp lai soma giữa S. tarnii; S. pinnatisectum với
các giống khoai tây trồng Delikat, Atlantic, Rasant và Agave hầu như không làm thay
đổi khả năng kháng bệnh mốc sương. Chỉ có tổ hợp lai giữa loài dại S.
bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có tính kháng rất cao với bệnh mốc
sương. Điều này chứng tỏ dòng dại S.bulbocastanum có khả năng chuyển đặc tính
kháng bệnh mốc sương của nó cho các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp.
c. Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ
Tất cả các dòng giống đều có biểu hiện kháng mốc sương trên củ với nguồn
mốc sương đã phân lập. Mức độ biểu hiện tính kháng bệnh mốc sương trên củ của
các con lai soma rất tốt trong đó nổi bật là 4 con lai soma của tổ hợp lai S.
bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat. Một số con lai soma của tổ hợp
lai giữa dòng dại S. tarnii với khoai tây trồng cũng có biểu hiện kháng cao với bệnh
mốc sương trên củ.

Tổng hợp các kết quả lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời và trên lát cắt
củ cho thấy các con lai soma của tổ hợp lai giữa S.bulbocastanum và Delikat có
tính kháng bệnh mốc sương rất cao. Các con lai này tiếp tục được kiểm tra khả
năng có mặt của gen kháng bệnh mốc sương.
d. Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng
lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)
Các vật liệu sẽ tiếp tục được đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương trên
đồng ruộng, sử dụng dung dịch lây nhiễm với nồng độ 20.000 bọc động bào tử/ml.
Thí nghiệm lây nhiễm được tiến hành vào chiều tối mát, duy trì nhiệt độ khoảng
180C- 250C, ẩm độ khoảng 70-80%. Triệu chứng bệnh sẽ bắt đầu xuất hiện khoảng
1 tuần sau lây nhiễm. Tiến hành đo đếm mỗi tuần 1 lần trong suốt quá trình diễn
biến của bệnh (7 lần). Kết quả được tính theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian
(bảng 4.17). Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục (∆)rAUDPC > 0 cho
thấy giống rất mẫn cảm với bệnh, (∆)rAUDPC < 0 nghĩa là giống có khả năng
kháng cao với bệnh trong đó giá trị tuyệt đối của (∆)rAUDPC càng nhỏ thì khả
năng kháng bệnh càng cao.
Giống khoai tây trồng Delikat rất mẫn cảm với bệnh trong khi các con lai soma
của dòng giống này với dòng dại S. bulbocastanum có khả năng kháng bệnh cao.
Thông qua đánh giá về sự thành thục trên đồng ruộng cũng cho thấy có sự tương quan
giữa tính kháng bệnh mốc sương với sự thành thục của các kiểu gen khác nhau. Các
kiểu gen có tính kháng bệnh cao thì thường là chín muộn và ngược lại. Con lai SH
2292/4 có độ chín muộn trong khi các con lai khác có độ chín trung bình. Như vậy có
18


sự tương quan chặt chẽ giữa tính kháng bệnh mốc sương và độ chín của cây. Điều này
nói nên rằng diễn biến của bệnh trên đồng ruộng khá phức tạp, chịu ảnh hưởng của
nhiều yếu tố của tự nhiên, do nhiều gen kiểm soát và được cho là tính kháng có ý nghĩa
quan trọng nhất (tính kháng về số lượng- Quantatitive resistance) (bảng 4.10).
Bảng 4.10. Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về khả năng

kháng bệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây
Cấp bệnh Hệ số kháng
Sự thành
Tình trạng
trung
bệnh điều
thục của cây
Tình trạng cây/
cây/
bình
chỉnh theo độ
1- Chín
ký hiệu
tổ hợp lai
(leaflet
thành thục sớm; 9-Chín
assay)
(ΔrAUDPC)
muộn
(1)
(2)
Cultivar
Delikat
5,0 S
0,311
4,8
Wild species
S. bulbocastanum
1,0 R
Blb + Delikat

SH 2282/4
1,0 R
-0,352
6,0
SH 2283/5
1,4 R
-0,248
6,5
SH 2283/9
1,8 R
-0,324
6,0
SH 2292/4
1,0 R
-0,030
7,4
e. Thí nghiệm 15: đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị
phân tử
Sử dụng các mồi đặc hiệu để phát hiện gen kháng mốc sương Rpi-blb1 (Wang
et al., 2008) và gen kháng Rpi-blb3 (Lokosou et al., 2009). Kết quả phát hiện sự có
mặt của gen kháng trên các vật liệu có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum
bulbocastanum (gồm S. bulbocastanum và các con lai soma từ tổ hợp lai
S. bulbocastanum + Delikat) là phù hợp với kết quả thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo.
4.1.4.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học
Thí nghiệm 16: Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học
Đa số các con lai tạo ra đều có hình thái tương tự với khoai tây trồng
(tuberosum) trừ các con lai 245/6 của tổ hợp lai cv. Atlantic + pnt2G; 3/7 của tổ hợp
lai cv. Rasant + trn 3G; 4/12; 7/7; 4/4 của tổ hợp lai cv. Agave + trn 3G là có kiểu
hình tương đối giống dạng dại (Wild type). Khả năng ra hoa của các con lai soma
cũng rất khác nhau. Các con lai có khả năng ra hoa cao như 2044/1; 2281/10;

2295/1 và 2195/2. Đây sẽ là những con lai có triển vọng cho chọn tạo giống vì chỉ
những con lai có khả năng ra hoa mới có thể tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để
chọn tạo được những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn. Các con lai của tổ
hợp lai trn 3G + cv. Rasant và trn 3G + cv.Agave không có khả năng ra hoa.
Nhiều con lai soma có số lượng củ trung bình trên khóm đạt từ 4-5 củ/khóm
như các con lai 248/1 của tổ hợp Delikat; 838/11 và 851/2 của tổ hợp lai trn3G
+cv.Delikat; 2044/1 của tổ hợp lai pnt2G + cv.Rasant; 2292/4 của tổ hợp lai blb 2G
+ cv; 2196/4 của tổ hợp lai pnt2G + cv.Delikat. Đồng thời củ của chúng có hình
dạng củ đẹp, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tươi hoặc chế biến.
19


Qua quá trình đánh giá chúng tôi nhận thấy có sự đa dạng về kiểu hình trong
quần thể các dòng con lai soma tạo ra. Những biến dị cũng thể hiện ngay trên các dòng
con lai soma của cùng một tổ hợp lai. Một số một số con lai soma có xuất hiện các biến
dị ở thân, lá, hoa và củ và khác nhau trong cùng một tổ hợp lai. Các biến dị xuất
hiện rất đa dạng và khác nhau giữa các tổ hợp lai khác nhau và khác nhau trong
cùng một tổ hợp lai. Do các con lai soma được tạo ra thông qua phép lai xa giữa
các loài khoai tây dại với khoai tây trồng (có bộ genome khác nhau) sẽ mang nhiều
tính trạng khác xa với khoai tây trồng. Các biến dị này sẽ tiếp tục được chọn lọc
thông qua các thế hệ lai backcross với khoai tây trồng nhằm chọn lọc được các
dòng con vừa mang đặc tính của khoai tây trồng lại vừa có khả năng kháng bệnh.
4.1.5. Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần
thể chọn lọc
Thí nghiệm 17. Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai lại thu được về khả
năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học
Kết quả đánh giá tính kháng bệnh trên cây con trồng từ hạt lai BC1
Các con lai của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat có khả năng kháng cao hơn
những dòng khác. Con lai 13.1322 đạt tỷ lệ 60%; Con lai 13.1303 đạt 53,8%; Con
lai 13.1311 đạt 55,8%. Các dòng con lai BC1 sau khi được thanh lọc tính kháng

bệnh ở giai đoạn cây con được trồng trong điều kiện chậu vại.
Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1
Sử dụng máy flow cytometry để kiểm tra độ bội của các dòng con lai BC1
triển vọng. So sánh kết quả với mẫu chuẩn nhị bội (2n = 2x=24) để kết luận về mức
đa bội của các mẫu cần đánh giá. Dựa vào sự bắt màu của mẫu và các đỉnh đo OD
chúng ta thấy các dòng lai BC1 đều có độ bội 2n=5x, đã giảm bội so với con lai
soma 2n=6x. Vì vậy theo lý thuyết, chúng tôi tiếp tục tiến hành lai lại các dòng này
với các giống khoai tây trồng với mục đích giảm bội. Sao cho các dòng lai BC có
độ bội giống với khoai tây trồng 2n=4x.
Kết quả đánh giá các đặc tính trồng trọt của các con lai BC1
Kết quả đánh giá cho thấy hầu hết con lai BC1 đã bảo toàn được đặc tính
hình thái ở dạng khoai tây trồng và có sức sinh trưởng tương đối giống với khoai
tây trồng. Ngoài ra khả năng ra hoa của các con lai và bố mẹ của chúng cũng được
đánh giá bởi khả năng ra hoa sẽ quyết định cho việc có thể tiếp tục lai trở lại với
khoai tây trồng để chọn tạo ra những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn
được hay không. Các con lai có khả năng ra hoa như 13.1302; 13.1303; 13.1304
trong đó dòng 13.1304 có khả năng ra hoa cao. Các dòng con lai trong cùng một tổ
hợp lai có biểu hiện tính đa dạng về kiểu hình một cách rõ rệt. Trong quần thể các
con lai được đánh giá, đặc biệt lưu ý đến các dòng của tổ hợp lai Delikat + blb2G lai
20


trở lại với giống khoai tây trồng Delikat. Các dòng con lai BC1 1303.2; BC1 1303.11
và BC1 1303.3 có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng, khả năng sinh
trưởng phát triển rất tốt và biểu hiện khả năng kháng bệnh mốc sương rất cao dưới áp
lực bệnh trong điều kiện tự nhiên. Kết quả đánh giá các tính trạng về củ của các con
lai BC1 cho thấy nhiều con lai có tiềm năng năng suất cao (trên 30 tấn/ha) như các
con lai 1303.2; 1303.4, 1303.6, 1303.11 và 1303.28 của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat
x Delikat; con lai 1305.5 của tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat x Delikat (bảng 4.22).
Đồng thời qua đánh giá các tính trạng phẩm chất củ cũng cho thấy các con lai

1304.2, 1303.4, 1303.6 và 1303.11 có hình thái củ đẹp, mắt ngủ nông, chất lượng
thử nếm rất ngon và hàm lượng chất khô cao, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tươi và chế
biến (bảng 14.23-A và B). Đây sẽ là nguồn vật liệu quan trọng cho chương trình
chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương của Việt Nam.
4.2. THẢO LUẬN
Các thí nghiệm được mô tả trong nghiên cứu này đã xác định được các thông
số trong quy trình tách, dung hợp tế bào trần bằng xung điện, nuôi cấy và tái sinh
các tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng. Trên cơ sở
đó, chúng tôi đã đạt được một tỷ lệ khá cao các con lai tái sinh từ các tổ hợp lai
dung hợp. Trong số 188 chồi tái sinh từ 1612 callus của 7 tổ hợp dung hợp, chúng
tôi đã chọn lọc được 82 con lai lục bội (2n=6x=72), trong đó có 69 con lai có kiểu gen
dị hợp nhân (hetezygous) được chọn lọc bằng chỉ thị phân tử SSR. Phân tích độ bội
Flow cytometry đã chọn được 82/188 (43%) các con lai có độ bội mong muốn (4x
tbr + 2x pnt, blb, trn). Ngoài ra kết quả phân tích độ bội thể cũng cho thấy phép
dung hợp tế bào trần cũng tạo ra một tổ hợp các con lai có độ bội khá đa dạng. Các
con lai có độ bội không mong muốn như con lai tứ bội (2x + 2x), con lai đa bội
(polyploidy) hay con lai hỗn bội (multiploidy) là kết quả của nhiều lần dung hợp
xung điện hoặc do đột biến dòng tế bào soma. Ramona Thiemei et al., (1997) đã tạo
được 239 callus tái sinh từ các tổ hợp lai giữa dòng khoai tây nhị bội (T17) với dòng
dại S. pinnatisectu (2n = 2x), trong số đó đã chọn lọc được 47-89% con lai có độ bội
mong muốn, 7-16% con lai là hỗn bội.
Trong khi việc lai khác loài giữa khoai tây dại và khoai tây trồng rất khó
thành công thông qua phép lai hữu tính, lai khác loài thông qua dung hợp tế bào trần
đã trở thành công cụ hữu hiệu để chuyển các đặc tính mong muốn từ các loài khoai
tây dại vào các giống khoai tây trồng, chẳng hạn như trong nghiên cứu của các tác
giả Thieme et al. (2008) đã tạo thành công các con lai soma giữa loài dại S. tarnii
với giống khoai tây trồng Delikat. Sau đó 1 năm, Jansky and Hamernik (2009) đã
dung hợp giữa loài khoai tây dại Solanum cardiophilum với giống khoai tây trồng
của Đức Agave và Delikat và tạo được một tỷ lệ rất thành công các con lai soma
khác loài.

21


Ở Việt Nam, các nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên cây khoai tây cũng
mới chỉ thành công trong việc tạo các con lai soma giữa các dòng khoai tây nhị bội
kháng virus cùng loài (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2009, 2011, 2012). Nghiên
cứu của chúng tôi cũng đã tạo được 69 con lai khác loài giữa các loài khoai tây dại
blb2G, pnt2G và trn3G với giống khoai tây trồng Delikat, Rasant, Agave và
Atlantic. Đáng chú ý là lần đầu tiên chúng tôi tạo được con lai soma giữa loài khoai
tây dại S. pinnatisectum với giống khoai tây trồng tứ bội Atlantic (một giống khoai
tây chế biến nhất nhạy cảm với bệnh mốc sương đang được trồng phổ biến tại Việt
Nam.). Thông qua kết quả đánh giá các đặc tính hình thái, chỉ những con lai có khả
năng sinh trưởng tốt và mang nhiều đặc tính giống với khoai tây trồng, đồng thời có
khả năng kháng bệnh thì mới được chọn lọc và tiếp tục lai lại với khoai tây trồng
nhằm tổ hợp được các đặc tính quý từ khoai tây trồng vào các con lai. Những biến
dị hình thái ở các con lai soma sẽ tiếp tục được chọn lọc, giữ lại những biến dị có
lợi, loại bỏ những biến dị bất lợi cho chọn tạo giống. Trong hầu hết các con lai
soma có biểu hiện tính kháng ở mức vừa hoặc thấp hơn một chút so với giống
khoai tây trồng, hay nói cách khác là khả năng kháng bệnh ở các con lai soma đã
được cải thiện rõ rệt. Các con lai soma giữa các loài khoai tây dại Mexico mang
khả năng kháng bệnh mốc sương rất cao sẽ là nguồn vật liệu quan trọng cho
chương trình chọn tạo giống khoai tây. Các công bố đi trước đã thành công trong
việc tạo các con lai soma giữa khoai tây trồng với loài dại S.pinnatisectum đã mang
khả năng kháng cao với bệnh mốc sương (Orczyk et al., 2003). Con lai soma giữa
loài dại S.bulbocastanum với S.tuberosum và các thể lai BC đã biểu hiện tính
kháng cao khi lây nhiễm với các chủng mốc sương ngoài đồng ruộng (Helgeson et
al., 1998). Thieme et al. (2008) đã chỉ ra rằng trong số 31 con lai soma tạo ra giữa loài
khoai tây dại Solanum tarnii và giống khoai tây trồng Delikat có 24 con lai biểu hiện
kháng bệnh mốc sương trong đó có 4 con lai có biểu hiện tính kháng cao với bệnh
(điểm đánh giá khi lây nhiễm nhân tạo trên lá là 9), so với loài dại Solanum tarnii

(điểm đánh giá là 8,7). Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên củ cũng cho thấy các con lai
soma điều biểu hiện ở mức 3,7-6,1 điểm (kháng cao hơn so với giống Delikat có mức
điểm là 3,2, trong khi loài dại Solanum tarnii có mức điểm là 7,0). Nhóm tác giả trên
đã sử dụng thang điểm 1-9 để đánh giá trong đó 1 = Nhạy cảm; 9 = kháng bệnh. Trong
nghiên cứu này, các con lai soma của tổ hợp lai giữa loài dại Solanum tarnii với giống
Delikat (857/5, 851/2, 849/5, 849/4 và 838/11) đều biểu hiện nhiễm bệnh với mức
điểm đánh giá trên lá từ 4,0 -5. Điều này cũng có thể lý giải là do chủng Phytophthora
của Việt Nam tạo ra sự khác biệt so với chủng Phytophthora của Châu Âu.
Các thể lai này tiếp tục được backross nhiều thế hệ với khoai tây trồng nhằm
chuyển được tính kháng bệnh vào các dòng vật liệu chọn tạo giống khoai tây.
22


Chúng tôi cũng đã sử dụng các cặp mồi đặc hiệu của gen kháng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 để
kiểm tra sự có mặt của gen kháng ở các con lai soma. Kết quả đã phát hiện được 2
gen kháng kể trên ở các con lai soma giống như ở loài dại S. bulbocastanum. Điều
này thêm một lần nữa khẳng định được đã chuyển được đặc tính kháng bệnh mốc
sương từ loài khoai tây dại S.bulbocastanum vào các con lai.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, các dòng con lai soma 6x là kết quả của phép
dung hợp tế bào trần giữa loài khoai tây dại (2x, 1 EBN) với khoai tây trồng (4x, 4
EBN), do đó có giá trị nội nhũ là 5 EBN. Backcorss các con lai lục bội với khoai tây
trồng tứ bội sẽ cho các con lai BC ở thế hệ đầu tiên có độ bội 5x. Tiếp tục tiến hành
lai backcross các con lai này qua nhiều thế hệ sẽ cho giống khoai tây trồng mang
các đặc tính mong muốn. Kết quả này có ý nghĩa lớn cho sản xuất khoai tây của
Việt Nam vì thực tế là chúng ta chưa tạo ra được giống khoai tây kháng bệnh mốc
sương. Các giống hiện có chủ yếu là thông qua con đường nhập nội. Các vật liệu
kháng bệnh tạo ra bằng con đường dung hợp tế bào trần, không phải là giống
chuyển gen nên dễ dàng được sản xuất chấp nhận, đồng thời giảm thiểu việc dùng
thuốc hóa học gây ô nhiễm môi trường.
Tuy nhiên do thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tôi mới chỉ tạo được những

con lai BC1. Việc tiếp tục lai trở lại các vật liệu này qua vài thế hệ để chọn lọc được
các dòng vừa mang khả năng kháng bệnh của loài khoai tây dại, vừa mang các đặc tính
nông sinh học quý của khoai tây trồng là hết sức cần thiết. Việc nghiên cứu sâu hơn
về cơ sở lý thuyết của sự biểu hiện gen kháng bệnh ở các con lai cần phải được tiếp
tục vì các con lai soma của các tổ hợp lai từ các loài khoai tây dại khác nhau có biểu
hiện khả năng kháng bệnh rất khác nhau.
Trong khi cả 3 loài khoai tây dại được sử dụng trong nghiên cứu này đều có
khả năng kháng bệnh mốc sương rất cao, nhưng chỉ những con lai soma của loài
S.bulbocastanum là biểu hiện tính kháng bệnh rất cao, đa số những con lai soma còn
lại chỉ biểu hiện tính kháng bệnh mốc sương ở mức vừa hoặc có cải thiện đôi chút
so với giống khoai tây trồng. Vấn đề này cần phải tiếp tục được nghiên cứu.
Ngoài ra việc nghiên cứu thêm về cơ chế thay đổi số lượng nhiễm sắc thể,
EBN và độ bội ở các thế hệ lai BC cũng rất cần thiết cho giai đoạn tiếp theo của
nghiên cứu này.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Đã xác định được các thông số để xây dựng được quy trình tách, dung hợp,
nuôi cấy và tái sinh tế bào trần của các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống
khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống,
thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các
23